人源性抗肝癌单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的建立产生人源性抗肝癌单克隆抗体的人-鼠杂交瘤.方法用IL-2和美洲商陆(PWM)体外刺激肝癌病人外周血淋巴细胞,再与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合,待杂交瘤生长进行筛选、克隆化及特性分析.结果建立了3株产生人源性抗肝癌单克隆抗体的人-鼠杂交瘤-AF3,CB7、CH1.三种单抗均识别肝癌细胞表面抗原,并具有显著的补体依赖的细胞毒活性.其中AF3的效价最高.结论通过人-鼠杂交瘤技术获得了产生人源性抗肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞系.抗体效价高,是一种较理想的单克隆抗体.     

抗人微管不稳定蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备人微管不稳定蛋白（Stathmin）的单克隆抗体,检测Stathmin蛋白在真核细胞中的表达,为探讨Stathmin 生物学功能奠定基础。方法利用重组Stathmin蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗Stathmin单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western blot和免疫组织化学实验等方法分别对其效价和特异性进行鉴定。结果成功地建立了2株稳定分泌抗Stathmin的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为F001和F002。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。两株单克隆抗体通过免疫组织化学实验和Western blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的Stathmin蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗Stathmin蛋白的单克隆抗体,为进一步研究Stathmin的生物学功能及其与肿瘤的关系创造了条件。     

抗人肝癌细胞相关抗原的单克隆抗体

 用人体肝癌培养细胞株SMMC—7721免疫Balb/c小鼠,融合得到六株抗人肝癌细胞单克隆抗体的杂交瘤,选其中一株（B1）连续克隆化培养5次。用间接免疫荧光测定并鉴定抗体,此株杂交瘤能在体外稳定分泌抗体,腹水效价（ELISA）为10^-8。所染色的肝癌以外的组织细胞无明确的反应,仅部分胚胎组织有交叉,说明该单克隆抗体有较好的肝癌细胞相关性。抗体亚型为小鼠IgM型。染色体核型分析,其数量是亲本细胞之和,计2n=80～106,有1～2条中部着丝点标记染色体。该杂交瘤命名为FP-4。     

抗KDR3单克隆抗体的制备和生物活性的鉴定

目的：制备抗KDR3单克隆抗体，研究其阻断VEGF受体的作用。方法：将抗KDR3单克隆抗体腹水，采用ELISA酶免疫分析方法．测定其效价，提取ECV304细胞膜蛋白用Western blot方法进行识别抗原的鉴定，并测定抗KDR3单克隆抗体的活性。结果：获得一株稳定分泌抗KDR3的杂交瘤细胞株，所产生抗体可阻断VEGF对人脐静脉内皮细胞系ECV304的刺激增生作用。结论：抗KDR中和抗体IMC-ICI和抗KDR3单克隆抗体同样对ECV304细胞都表现出对外源性VEGF有明显抑制作用，而且对内源性VEGF也有明显抑制作用．抗KDR3单克隆抗体在肿瘤治疗的过程中将起一定的作用。     

靶向肿瘤血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性抗体的研制

背景与目的:肿瘤的生长依赖于新生血管形成,阻断其血管形成可有效治疗肿瘤.本研究旨在研制抗人肝癌血管内皮细胞的功能性单克隆抗体,确定其抑制人肝癌移植瘤生长的作用.方法:用从新鲜人肝癌组织中分离、鉴定、培养的人肝癌血管内皮细胞免疫10只BALB/c小鼠.免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后采用甲基纤维素选择培养.使用活细胞免疫荧光、细胞增殖、内皮成管实验及"人源化血管"动物模型体内抑瘤实验筛选和鉴定有治疗潜力的功能性抗体.结果:细胞融合产生1 442个单个集落的杂交瘤株,获得119株阳性克隆,其中53株是具有抑制人肝癌血管内皮细胞增殖、成管的功能性抗体,2株被证实能抑制人肝癌移植瘤在BALB/c裸鼠体内的生长,抑瘤率为66.7%～76.5%.结论:建立了高通量制备、筛选、鉴定内皮细胞功能性单抗技术,获得了2株具有靶向血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性单抗.     

分泌抗人甲胎蛋白并对肝癌细胞有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和鉴定

采用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤SP_2/O细胞与用人甲胎蛋白抗原免疫的BALB/c小鼠脾细胞融合,经多次筛选,获得7株分泌抗人甲胎蛋白并对肝癌细胞有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其培养液上清和腹水效价分别为10~(-2)和10~(-6～9-)。杂交瘤腹水经硫酸铵盐析,DEAE纤维素层析,或免疫吸附亲和层析法纯化,每ml腹水单克隆抗体的产量为1～2mg。用ELISA,免疫双扩散、聚丙烯酰胺凝胶电泳、间接免疫荧光法鉴定了单克隆抗体的特异性、亲和力、稳定性及IgG亚类。     

巨噬细胞抑制因子-1单克隆抗体的研制及血清检测系统的建立

目的 研制巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)单克隆抗体并建立MIC-1血清检测方法.方法 应用自主研制的MIC-1抗原免疫BALB/C雌鼠,通过杂交瘤技术获得分泌抗MIC-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA方法构建MIC-1血清检测体系并对性能进行鉴定.结果 成功获得了32株抗MIC-1单克隆抗体,选用其中2株...     

Epstein-Barr病毒转化人已免疫的B淋巴细胞,制备人源性单克隆抗体技术路线的研究

自从１９７５年Ｋｏｈｌ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ建立杂交瘤技术以来，单克隆抗体的研究与应用，已充满医学的各个领域。但制备人源性单克隆抗体现仍面临着较大困难。主要因为１）免疫人的淋巴细胞有困难。２）免疫人Ｂ－淋巴细胞长期建株难以存活。３）产生抗体的细胞株难以长...     

肝脏型脂肪酸结合蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备和鉴定

目的： 制备抗肝脏型脂肪酸结合蛋白(LFABP)的单克隆抗体(mAb)并进行亚型和特异性鉴定。方法：以重组的LFABP蛋白为免疫原,经过原核表达和纯化后,免疫BALB/c小鼠,获得分泌鼠抗人LFABP蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA 和Western blot方法检测其特异性。结果：纯化的LFABP重组蛋白免疫小鼠后经过筛选得到2株稳定分泌抗人LFABP的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为3E6和5B7,其亚型分别为IgG1和IgG2a,抗体经纯化后浓度达到2 mg/mL,效价达到1∶10 000以上。Western blot分析结果表明可与细胞中表达的内源LFABP发生特异性免疫反应。结论：成功制备了鼠抗人LFABP的mAb,为进一步研究LFABP的生物学特性,并为相关疾病的治疗奠定了基础。     

抗慢性B淋巴细胞白血病同种型和独特型单克隆抗体的研究

本研究以慢性B淋巴细胞性白血病患者血清IgM免疫BALB／C／J‘鼠，取其脾细胞，采用细胞融合技术建立分泌抗慢性淋巴细胞白血病（BCLL）同种型和独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用一系列免疫化学，细胞免疫学等技术对10株独特型单抗和5株同种型单抗的特异性，亲和力，识别抗     

成纤维母细胞生长因子单克隆抗体的研究

目的 制备并研究bFGF单克隆抗体,以便用于恶性肿瘤的早期诊断。方法 提纯bFGF并用杂交瘤技术获得杂交瘤细胞,再用BALB/C鼠种植收获腹水得到McAb,进行核型、效价、特异性、表位等分析。结果 所得杂交瘤细胞具有双亲细胞染色体特点McAb效价较高,特异性良好,无非特异反应,3种McAb均为IgG型。结论 McAb具有良好的性能,为进一步的临床检测应用奠定了基础。     

抗人肝癌细胞膜单克隆抗体HCMP—1的制备及其生物学特性的初步鉴定

用超选择免疫法，诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠对正常人肝细胞抗原产生选择性低兔疫反应后，二步腹腔注射人肝癌细胞悬液，２－４周后用人肝癌细胞作强化免疫动物１次，取出脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞用ＰＥＧ法融合制备杂交瘤。采用细胞抗原ＥＬＩＳＡ法，同时测定培养上清对肝癌细胞及正常肝细胞的免疫反应，筛出一株能稳定分泌抗人肝癌细胞膜抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，ＨＣＭＰ－１ＭＡｂ是一种ＩｇＧ２亚型的单抗，它与ＨＢｓ     

HER2抗独特型单克隆抗体的制备和初步研究

目的:研制HER2抗独特型单克隆抗体,为进一步深入研究乳腺癌抗独特型抗体疫苗奠定基础。方法:用人HER2蛋白免疫家兔,获得特异性兔抗HER2抗体。再用兔抗HER2抗体免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备HER2抗独特型单克隆抗体。并筛选出β型HER2抗独特型单克隆抗体。结果:ELISA检测结果表明,获得的兔抗HER2抗体能特异性地与HER2蛋白结合,其OD值随HER2的浓度呈正线性关系。用兔抗HER2抗体免疫小鼠获得一株稳定分泌HER2抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞1F5,其分泌的单克隆抗体能特异性的和兔抗HER2多克隆抗体结合,并与HER2产生竞争抑制作用。用1F5抗独特型单克隆抗体免疫家兔得到的抗血清能和HER2特异性的结合。该抗体亚型为IgG3,未浓缩腹水的效价为1∶1.02×104。结论:抗独特型单克隆抗体为β型HER2抗独特型抗体,有可能成为乳腺癌抗独特型单克隆抗体疫苗。     

大肠癌相关新基因ST13单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的 研制抗ST13蛋白单克隆抗体,建立检测方法,探讨ST13基因的生物学特性。方法 按淋巴细胞杂交瘤技术制备抗ST13蛋白单克隆抗体,并以亲和层析法纯化单抗,将此单抗作探针用Western-Blot和免疫组化检测标本。结果 获得3个抗ST13蛋白单抗的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞培养上清和腹水中单抗的ELISA效价为10^4-10^5。以ST13单抗作Wester-Blot和免疫组化证实该单抗具有高度特异性,可用于检测组织表达的ST13蛋白。结论 制备了具有高度特异性和高效价的抗ST13蛋白单抗;建立了Western-Blot及免疫组化检测组织表达的ST13蛋白的方法。     

抗人双特异性蛋白磷酸化酶18单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人双特异性磷酸化酶18（Dusp18）单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定,为Dusp18功能的研究奠定基础。方法重组Dusp18免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与SP2／0细胞融合,经筛选建立可稳定分泌抗Dusp18的单抗细胞株,制备腹腔积液,ProteinG纯化所得腹腔积液,ELISA及Westernblotting检测抗体的效价和亲和力,用亚型鉴定试纸条鉴定单克隆抗体的亚型。应用免疫组织化学检测Dusp18在肝癌组织中的表达情况。结果获得两株（F003和F004）单抗,上清效价分别为1：5120和1：10240,腹腔积液效价分别为1：25600和1：51200,Westernblotting结果均在预期位置出现阳性条带。利用两株抗体均可在肝癌组织中检测到Dusp18的表达。两株抗体亚型均为IgG1型,轻链均为k型。结论成功制备能特异性识别Dusp18的单克隆抗体,为进一步研究Dusp1的生物学功能,揭示其与肿瘤发生、发展之间的关系奠定了基础。     

EGFRvⅢ单克隆抗体研制与鉴定

目的:制备针对EGFRvⅢ的单克隆抗体,以期待其对消化道肿瘤的靶向治疗.方法:通过人工合成EGFRvⅢ与KLH连接,免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠源性单克隆抗体细胞株,经腹水生产抗体,并对抗体进行纯化和相关性质鉴定.结果:合成EGFRvⅢ的基因缺失融合区的相应14肽,短肽与蛋白载体KLH连接作为抗原,免疫Balb/c小鼠.制备针对表达EGFRvⅢ肿瘤而对正常组织无破坏作用的的单克隆抗体.通过常规免疫程序获得高效价(1∶128 000)抗血清的免疫小鼠后,进行细胞融合,制备杂交瘤单克隆抗体细胞.应用ELISA检测的方法筛选鉴定能分泌EGFRvⅢ抗体的杂交瘤细胞株,经亚克隆获得5株鼠源性成系抗体阳性细胞株.阳性细胞株经扩大培养,注射于小鼠腹腔以大量制备抗体.抗体型别鉴定为IgG2a,并对抗体效价及其相对亲合力进行测定.腹水效价达1∶128 000,亲和力最高达9.8×10-9 mol/L.用表达的正常EGFR配体结合区蛋白检测自制抗体的特异性,结果显示抗体不与正常EGFR配体结合区蛋白结合.结论:成功制备了抗鼠EGFRvⅢ单克隆抗体,为后续抗肿瘤的靶向治疗奠定基础.     

抗兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶单克隆抗体的制备和鉴定

背景与目的:制备抗兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶[NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR]的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.材料与方法:以基因工程重组兔NRDR为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌兔NRDR mAb的细胞株.以间接ELISA法筛选阳性克隆、鉴定Ig亚类、细胞培养上清及腹水效价,同时采用Western blot方法检测mAb的特异性.结果:获得3株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(NR1、NR2和NR5).其抗体亚类均为IgG1,细胞培养上清效价依次为1∶20、1∶40和1∶20,腹水效价分别为1∶106、1∶107和1∶106.Western blot结果显示NR1、NR2和NR5抗体均能有效识别兔肝组织中的NRDR及重组表达的兔NRDR.结论:成功地建立了稳定分泌兔NRDR mAb的杂交瘤细胞株,为NRDR生物学功能的进一步研究打下了基础.     

抗人淋巴细胞共同抗原单克隆抗体的组织鉴定和在肿瘤鉴别诊断上的初步应用

淋巴细胞表面抗原的研究对了解淋巴细胞亚群、功能以及淋巴瘤诊断有实用意义。我室建立了三株能分泌抗人淋巴细胞共同抗原单克隆抗体(McAb)的鼠——鼠杂交瘤细胞株。所产生的单抗针对全T淋巴细胞和部分B淋巴细胞。以下介绍McAb的组织鉴定以及用于对恶性淋巴瘤和其他癌瘤的鉴别诊断的研究结果。     

肝癌细胞凋亡-抗HBx/抗CD3双功能抗体介导细胞毒性T细胞对靶细胞的杀伤

研究发现，针对效应细胞毒性T淋巴细胞[CTL]表面受体[TCB／CD3复合物]与肿瘤相关抗原的双功能抗体能有效地介导CTL对靶肿瘤细胞的杀伤。为此，我们通过细胞融合法经流式细胞仪[FACS]无菌分选建立了抗HBx／抗CD3二次杂交瘤，应用该二次杂交瘤所分泌的双特性单克隆抗体[BsAb]介导CTL在LTNM4裸鼠人肝癌模型进行了实验性治疗研究。     

抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制

摘 要? 目的：研制抗肝癌干细胞的功能性单克隆抗体,为肝癌干细胞的靶向治疗提供候选抗体药物。方法：从人肝癌组织中分离人肝癌干细胞样细胞（human liver cancer stem-like cells, hLCSLCs）,免疫BALB/c裸鼠,采用脾细胞融合法制备大容量单抗库。应用细胞免疫荧光、无血清成球培养、裸鼠皮下成瘤等方法筛选、鉴定特异识别肝癌干细胞的单克隆抗体。流式细胞仪分选hLCSLCs侧群细胞（hLCSLCs side population cells, hLCSLCs-SP）,无血清悬浮培养法和CCK-8法检测杂交瘤单抗对hLCSLC-SP自我更新和增殖能力的影响。结果：细胞融合后获得2 964株杂交瘤克隆,在能与hLCSLCs反应的237株克隆中,有116株单抗能与hLCSLCs的细胞膜结合,其中的33株杂交瘤单抗只与hLCSLC-SP反应（阳性率为2%~5%）、不与非hLCSLC-SP反应。该33株单抗中有6株能与CD133阳性细胞有不同比例的共染,并且与无血清悬浮培养的成球细胞呈阳性反应(阳性率为3%~26%),明显高于hLCSLCs-SP。裸鼠皮下接种1×104个15D2单抗阳性的hLCSLCs,成瘤率为100%。功能性筛选实验发现,6株单抗中的4株能显著抑制hLCSLC-SP的增殖和成球生长,其抑制率分别为24%~42%和13%~50%。结论：采用自建的大容量单克隆抗体库技术,筛选获得了4株特异性识别hLCSLC-SP的功能性单抗,为肝癌干细胞的抗体靶向治疗奠定了基础。