抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段（TRF1^33-277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF1^33-277，将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白哆，制备血清过柱纯化，将TRF1^33-277和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱，血清过GST柱以去除抗GST抗体，然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体，获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗。在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带，与阳对照基本一致。结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效。所获抗TRF1^33-277多克隆抗体为国内首次报道。     

兔抗人TGF-β_1多克隆抗体的制备

目的以人重组TGF-β1蛋白作为抗原,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀,免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果成功获得兔抗人TGF-β1多克隆抗体,纯化后抗体效价达1∶110 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体具有良好的特异性,能满足进一步实验的需要。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组scAAV的构建

目的:构建共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组双链腺相关病毒(scAAV)。方法:PCR扩增NEP1-40、PRP-1及FMDV2A的cDNA,建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA。两端加入Flag肽和6×His肽后合成融合基因cDNA,克隆到PES载体构建出重组质粒PES/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。双酶切重组质粒PBV220-NT4-NAP和PES/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,连接得到重组质粒pBV220-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。以腺相关病毒pSS-CMV构建双链腺相关病毒穿梭质粒ssAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。经细胞内同源重组得到共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。测定病毒滴度并利用鸡胚背根神经节检测其生物活性。结果:克隆了共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子融合基因cDNA,基因测序及核苷酸序列同源性比较结果与设计序列一致;构建了重组质粒pBV220-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,酶切鉴定、核酸序列测定结果与理论值一致;重组的双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2APRP-1应用于鸡胚背根神经节显示明显促进神经突起生长。结论:成功构建了共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,并显示出促进鸡胚背根神经节神经突起生长作用。     

人基质金属蛋白酶—1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步应用

目的：获得兔抗人基质金属蛋白酶-1(MMP-1)多克隆抗体，并将其初步应用于临床检测。方法：将人MMP-1融合蛋白经亲和层析法纯化，并将其作为抗原免疫家兔，获得兔抗血清，经饱和硫酸铵纯化，获得初步纯化的兔抗人MMP-1多克隆抗体。用双抗夹心间接酶联免疫吸附实验(ELISA)测定正常对照、慢性肝病、肝硬化患者血清MMP-1的OD值。结果：获得初步纯化的兔抗人MMP-1特异性多克隆抗体，该抗体能与人MMP-1起反应。结论：制备的MMP-1多克隆抗体可初步用于临床检测。     

EOLA1多克隆抗体的制备及免疫定位

目的:制备兔抗人内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)多克隆抗体,探讨其在部分人体恶性肿瘤组织中的免疫定位。方法:构建重组质粒,转化大肠杆菌及诱导表达,抽提目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,免疫组织化学法检测EOLA1在部分人体恶性肿瘤组织中的表达。结果:成功制备重组质粒在大肠杆菌中表达人EOLA1蛋白,免疫家兔制备得到兔抗EOLA1多克隆抗体,免疫组织化学法检测显示EOLA1蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达。结论:成功制备EOLA1多克隆抗体,证实EOLA1蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达。     

兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶多克隆抗体的制备

目的：制备兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶（NRDR）多克隆抗体。方法：应用原核表达的兔NRDR免疫豚鼠,制备豚鼠抗兔NRDR多克隆抗体,并以Western blot法分析抗体特异性。结果：免疫豚鼠获得了高效价抗血清,效价为1：2000时检测极限为160rig蛋白,与NRDR蛋白能特异性结合。结论：获得的多克隆抗体应用于Western blot中检测兔NRDR效果良好。为NRDR的进一步研究打下基础。     

流行性乙型脑炎病毒重组E蛋白的纯化及多克隆抗体制备

目的：纯化原核表达的JEV E蛋白并制备其多克隆抗体。方法：IPTG诱导大肠杆菌表达JEV E蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化。将纯化后的JEV E蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗血清。琼脂糖双向扩散实验及间接ELISA检测抗体效价。结果：获得浓度1.85mg/ml、纯度92%的JEV E蛋白,并制备了JEV E蛋白兔多克隆抗体血清。琼脂糖双向扩散实验显示多克隆抗体血清1∶16稀释时仍能观察到沉淀线,间接ELISA法显示1∶200稀释时具有较高效价。结论：纯化了JEV E蛋白,并制备出了多克隆抗体。     

热休克因子4b多克隆抗体制备及纯化

目的制备兔抗人热休克转录因子4b(Hsf4b)多克隆抗体。方法利用实验室已纯化的GST-Hsf4b融合蛋白免疫新西兰大耳白兔3次,制备Hsf4b多克隆抗体血清,ELISA方法检测血清抗体效价,饱和硫酸铵纯化血清多克隆抗体,Western blot检测多克隆抗体与Hsf4b蛋白结合能力。结果 ELISA检测显示,经过三次免疫,获得了高效价的兔抗人Hsf4b多克隆抗体;Western blot检测表明,制备的兔抗人Hsf4b多克隆抗体与Hsf4b蛋白结合良好。结论成功制备了高效价的抗Hsf4b多克隆抗体,为研究Hsf4b生物学功能提供了有用的实验工具。     

RmIL-18多克隆抗体的制备及辣根过氧化物酶的标记

目的用纯品rmIL-18免疫新西兰兔，制备多克隆抗体，并予辣根过氧化物酶标记。方法使用免疫佐剂包被rmIL-18分次免疫新西兰兔，得到兔血清，再采用硫酸铵沉淀粗提法和QAE-Sephadex A-50离子交换层析法提纯IL-18抗体，最后用HRP简易过碘酸钠法标记IL-18抗体。结果用以上方法标记的IL-18抗体酶标记率为40．29％，酶标抗体的效价为1：3200，最佳工作浓度为1：1600。结论成功制备出标记HRP的IL-18多克隆抗体，建立了IL-18抗原的酶联免疫检测，以进一步用于实验研究。     

Nogo受体拮抗剂对大鼠急性脊髓损伤的保护作用

目的探讨Nogo受体拮抗剂NEP1-40对大鼠脊髓损伤后脊髓功能恢复的影响,为临床治疗急性脊髓损伤提供实验依据。方法健康Wistar大鼠48只随机分为创伤对照组、NEP1-40治疗组。建立大鼠中段胸部脊髓后半部横切模型。对照组注入生理盐水,实验组采用NEP1-40治疗。分别在术后取材行苏木精-伊红染色、免疫荧光染色检测。术后第1、3天及1、2、3、4周对动物进行运动功能评分。结果脊髓损伤3周后,NEP1-40组行为学评分高于对照组,同时NeuN/NF-200阳性染色亦明显高于对照组,差异有统计学意义。结论NEP1-40治疗脊髓损伤能促进神经元的再生,恢复脊髓功能。     

Nogo受体及其拮抗剂与神经节苷脂在新生大鼠HIBD中的作用

目的观察Nogo-A受体拮抗剂NEP1-40及神经节苷脂对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤后神经再生的作用。方法将100只7日龄新生大鼠随机分为10组:在6h、24h两个时间段分别设空白对照组,假手术组,缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型组,HIBD后NEP1 40治疗组及神经节苷脂治疗组，用原位杂交的方法观察各组别Nogo-A mRNA的表达情况。结果HIBD组两时段的Nogo-mRNA表达均高于同时段空白组及假手术组，差异有统计学意义；NEP1-40治疗组能抑制HIBD后mRNA的表达,与同时段模型组对比差异有统计学意义；神经节苷脂治疗组mRNA的表达在6h时与HIBD组无明显差异,在24h时较HIBD组低但高于空白组。P值均＜0.05。结论Nogo-A mRNA在缺氧缺血性脑损伤后表达显著增高,其编码的Nogo-A可抑制中枢神经损伤后的再生,NEP1-40能拮抗这一作用,从而可能在促进缺氧缺血性脑损伤后神经再生中起到作用。神经节苷脂GM-1在缺氧缺血性脑损伤后也可抑制Nogo-A mRNA的表达，有稳定细胞膜、减轻细胞水肿、促进神经再生的作用。     

人参皂苷Rb1对NEP基因启动子活性的影响

目的 构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒,探查神经内肽酶(NEP)基因启动子中与人参皂苷Rb1影响NEP启动子活性有关的位点。方法 用NEP基因5′上游启动区2.4kb片段和荧光素酶报告基因载体pGL3-basic构建NEP启动子-荧光素酶报告基因质粒pGL3-nep2.4;用Erase-a-Base System对pGL3-nep2.4质粒2.4kb DNA插入片段5′端进行缺失,构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒;用Rb1处理NEP启动子缺失体转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,检测双荧光素酶活性,观察Rb1对NEP启动子活性的影响。结果 成功构建了含NEP启动子DNA序列的重组质粒pGL3-nep2.4。荧光素酶活性检测显示,转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性是转染pGL3-basic的13.1倍(P<0.01)。Rb1处理可使转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性增加,其是对照组的2.9倍(P<0.01);细胞荧光素酶活性检测亦显示,NEP基因上游启动区-894~-857bp(Region Ⅰ)及-100~-82bp(Region Ⅳ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的29%(P<0.01)和25%(P<0.01),-559~-534bp(Region Ⅱ)及-223~-179bp(Region Ⅲ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的5.12倍(P<0.01)及1.81倍(P<0.01)。Rb1处理后,RegionⅠ、Ⅱ和Ⅲ缺失体质粒转染细胞荧光素酶活性均与对照组无统计学差异(P>0.05),Region Ⅳ缺失质粒pGL3-226转染细胞荧光素酶活性也与对照组无明显差异(P>0.05),而含Region Ⅳ质粒pGL3-244转染细胞荧光素酶活性则是对照组的1.61倍(P<0.01)。结论 NEP基因5′上游2.4kb DNA片段有较强的启动子活性,Rb1能明显增加其活性。NEP基因2.4kb DNA片段有2个正调控区(RegionⅠ和Region Ⅳ)和2个负调控区(RegionⅡ和Region Ⅲ),Rb1通过Region Ⅳ发挥正调控作用。     

呼气负压技术与常规肺功能检测方法的相关性研究

目的：探讨呼气负压技术（NEP）与常规肺通气功能检测方法的相关性。方法100例受试者用NEP检测呼气气流受限（EFL），测定气流受限指数（FL%），采用3分法进行EFL评分。所有受试者同时进行常规肺通气功能测试，测定FEV1、FEV1占预计值%（FEV1%）、FEV/FVC，根据FEV1%对常规肺通气功能分级，应用Pearson检验分析FL%与FEV1、FEV1%、FEV/FVC的相关性，用Spearman检验分析3分法EFL评分和FEV1%的相关性。结果 FL%分别与FEV1、FEV1%、FEV/FVC存在负相关（r分别为-0.70、-0.73，r=-0.67，P均〈0.01），其中与FEV1%相关性最强；3分法EFL评分和FEV1%存在负相关（r=-0.74，P〈0.01），提示气流受限指数随着气流阻塞程度的加重而增加。结论 NEP与常规肺功能检测方法具有相关性,且操作较常规肺功能简单，具有较好的临床应用前景。     

单克隆抗体HIM82对中性粒细胞呼吸爆发的降调节作用

本研究用单抗HIM82对中性粒细胞（PMN）呼吸爆发的早期调控，发现HIM82（30μg／ml）对佛波酯（PMA）激活的PMN产生的O2-、H2O2分别可下调至（44．00±8．9）％（n=8，P＜0．01）和（65．16±15.41）％（n=8，P＜0．01），对因呼吸爆发产生的活性氧物质（reactiveoxygenspecies，ROS）引起质膜中性内肽酶（NEP）的纯化作用（inactivation）[活性下降（43．29±9．41）％，n＝8，P＜0．01]有防护作用[活性恢复至（6648±15.53）％，n=8，P＜0．05]。结果表明该单抗对PMA激发PMN呼吸爆发产生O2-、H2O2有明显的降调节作用，也表明质膜上相应分化抗原分子对PMN功能特别是对激活呼吸爆发的机构有重要影响。     

以神经内肽酶为靶点筛选治疗阿尔茨海默症天然药物的实验研究

目的筛选具有提高神经内肽酶(NEP)活性从而降低神经细胞β 淀粉样肽（Aβ）水平的药物,为临床治疗阿尔茨海默症（AD）提供实验依据。方法以脂质体LipofectamineTM2000介导瑞典突变型淀粉样肽前体蛋白(sweAPP)表达质粒pcDNA3.1 sweAPP转染神经母细胞瘤细胞SK N SH,G418筛选获得稳定表达细胞株作为AD模型细胞,采用蛋白印迹技术检测sweAPP表达情况,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养基中Aβ40和Aβ42含量变化,进而以MTT法检测各天然药物对SK N SH细胞增殖能力的影响,确定药物的有效浓度及最佳作用时间,以NEP肽酶实验检测药物对NEP酶活性影响,ELISA法检测药物对Aβ水平的影响。结果Western Blot结果显示,转染后SK N SH细胞高表达sweAPP蛋白;ELISA结果显示,转染后的SK N SH细胞分泌Aβ40、Aβ42明显升高,分别为转染前的7.26?和3.27倍（P<0.05）。NEP肽酶实验检测结果显示,茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3能够明显提高NEP酶活性,分别为（117±2.8）%、（131±4.0）%和（121±1.6）%。ELISA结果显示,经茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3作用后,细胞培养基中Aβ40和Aβ42水平明显降低,分别为对照组的（82±0.78）%和（85±2.21）%、（74±1.61）%和（99±3.31）%、（83±5.31）%和（76±6.74）%。结论成功构建AD模型细胞;茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3可提高NEP酶活性,从而有效降低Aβ的水平;本研究为茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3在临床上的应用以及分子机制研究提供了试验数据。     

苯并[a]芘对神经胶质细胞中胰岛素降解酶与脑啡肽酶表达的影响

目的：探讨苯并［a］芘［benzo(a)pyrene,BaP］对神经胶质细胞中具有β-淀粉体（β-amyloid,Aβ）清除作用的胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme,IDE）及脑啡肽酶（neprilysin,NEP）表达的影响。方法：制备新生SD大鼠原代神经胶质细胞混合培养体系,接受不同浓度的BaP、Aβ1-42寡聚体、Aβ1-42纤维体单独或联合处理24 h后,采用细胞增殖 毒性检测试剂盒测定细胞存活率。随机分为对照组、BaP（2.00 μmol/L）组、Aβ1-42（20.00 mg/L）寡聚体组、BaP+Aβ1-42寡聚体组、Aβ1-42（20.00 mg/L）纤维体组、BaP+Aβ1-42纤维体组,其中BaP均为预处理12 h后再与不同聚集状态的Aβ1-42共同作用。进一步采用实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹技术检测体系中IDE、NEP的mRNA和蛋白表达水平。结果：20.00 μmol/L及以下浓度的BaP处理,20.00、40.00 mg/L的Aβ1-42寡聚体或Aβ1-42纤维体单独处理,BaP与Aβ1-42寡聚体或BaP与Aβ1-42纤维体联合处理对神经胶质细胞的存活率均无明显影响。与对照组相比,BaP单独处理组中IDE、NEP的mRNA和蛋白水平均未明显改变;而Aβ1-42寡聚体单独作用可明显上调IDE的mRNA及蛋白水平（P<0.05）,同时BaP预处理可显著抑制Aβ1-42寡聚体作用引起的IDE表达水平上调（P<0.05）;另一方面,Aβ1-42纤维体在单独处理或有BaP预处理情况下,IDE、NEP的mRNA和蛋白水平均未发生明显改变。结论：在对细胞存活率无明显影响的前提下,BaP预处理显著抑制了Aβ寡聚体作用后的IDE表达水平上调,提示苯并［a］芘可能干扰Aβ寡聚体降解途径导致Aβ增多聚集,进而可能促进认知功能降低及阿尔兹海默病的形成。     

转染NEP基因对Aβ25-35诱导神经元凋亡的保护作用

目的研究转染NEP基因对神经毒物质Aβ_25-35诱导神经元凋亡的保护作用。方法培养大鼠脑皮层神经元，用Aβ_25-35作用神经元制备凋亡模型，NEP基因转染神经元。通过MTT法及流式细胞分析法观察NEP基因过表达对Aβ诱导神经元凋亡的保护作用。通过RT-PCR检测目的基因NEP，APP,以及凋亡相关基因Bcl-2和Bax-mRNA的表达，Western-Blot测定APP和Aβ的蛋白表达。结果MTT和流式细胞分析法观察，发现在Aβ_25-35作用下转染NEP组神经元活,性显著增高(P＜0.05)，凋亡率降低。RT-PCR及Western Blot结果显示，转染NEP组神经元APP基因的表达明显减少，Aβ的生成减少；同时促凋亡基因Bax表达降低，Bcl-2基因表达增高。结论转染NEP基因能保护Aβ所致的神经元凋亡。     

腺病毒介导的NEP基因对Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用

目的    研究脑中性内肽酶(NEP)基因外源表达对神经毒性物质β-淀粉样肽(Aβ25-35)诱导损伤的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用。方法    用脂质体法将含NEP的腺病毒载体转染高代次293细胞,制备高滴度病毒载体,感染Aβ25-35处理的外源损伤的人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞),采用MTT法检测细胞存活率,采用流式细胞术分析细胞凋亡状态和细胞内活性氧水平,采用RT-PCR和Western blot法检测凋亡相关基因bcl-2及bax的表达情况。结果    细胞存活率及流式细胞术检测结果显示,NEP高表达可明显减轻Aβ25-35诱导的细胞凋亡及减低细胞内活性氧水平,RT-PCR和Western blot结果显示,NEP对Aβ25-35诱导的细胞凋亡的抑制作用可能是通过减少促凋亡基因bax的表达以及降低细胞内活性氧水平来实现的。结论    NEP对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有一定保护作用,其作用机制可能与凋亡相关基因有关。     

雌激素缺失及17β-estradiol替代治疗对大鼠海马β淀粉样蛋白含量的影响

目的 观察雌激素缺失及雌二醇(17β-estradiol)替代治疗对大鼠海马β淀粉样蛋白(Aβ)含量的影响及其可能机制.方法 切除大鼠双侧卵巢制作雌激素缺失模型(Ovx),然后给予17β-estradiol补充治疗.ELISA检测海马AB含量,荧光法测定α和β分泌酶活性,Western印迹检测β分泌酶(BACEl)和中性内肽酶(NEP)的表达.结果 Ovx大鼠雌激素水平[(11±4)pg/ml,P＜0.01]明显低于对照组[(21±8)pg/ml],而给予17β-estradiol替代治疗后雌激素水平上升[(63±13)pg/ml,P＜0.01];Ovx大鼠海马组织Aβ40[(28.5±4.5)ng/ml,P＜0.01]和Aβ42含量[(4.6±1.2)ng/ml,P＜0.01]均显著高于对照组的Aβ40[(14.4±2.4)ng/ml]和Aβ42[(2.8±0.4)ng/ml];而17β-estradiol替代治疗可以使Aβ40[(20.3±3.2)ng/ml,P＜0.01]和Aβ42[(3.8±0.5)ng/ml,P＜0.01]降低;Ovx大鼠α仅分泌酶活性降低(67.5%,P＜0.01)而β分泌酶活性增加(145.8%,P＜0.01),17β-estradiol替代治疗后部分逆转了上述现象;Ovx大鼠BACE1的表达增加(135.4%,P＜0.01)而NEP表达降低(40.8%,P＜0.01),而补充17β-estradiol后可以部分拮抗上述作用.结论 雌激素缺失可以增加去势大鼠海马AB含量,这可能与α分泌酶活性下降、BACE1活性增加和(或)NEP活性下降有关,而补充17β-estradiol可以降低Aβ含量;这可能是绝经后妇女雌激素替代治疗降低阿尔茨海默病发病危险性的原因之一.