含hIGF-1基因腺病毒的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达.方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pme Ⅰ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达.结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达.结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统.腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞.     

腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)的表达。方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定;用Pme I线性化后去磷酸化的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ 5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。用重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP对MSCs进行转染,并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果:pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ 5183中成功地发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论:采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中,并得到有效表达,且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况,这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

改良腺病毒AdF35-eGFP转染人 及大鼠骨髓间充质干细胞的效率对比研究

目的：比较改良腺病毒AdF35-增强绿荧光蛋白（eGFP）转染人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）和大鼠骨髓间充质干细胞(rat BMSCs, rBMSCs)的效率。方法：分别从人体、大鼠骨髓中分离出BMSCs,成骨、成脂诱导培养以鉴定BMSCs。构建含eGFP的AdF35重组腺病毒载体AdF35-eGFP,以不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别转染BMSCs后,MTT检测AdF35-eGFP对2种BMSCs的毒性作用,荧光显微镜观察eGFP的表达,流式细胞仪检测转染效率,实时定量PCR检测2种BMSCs表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)和CD46 mRNA的水平。结果：hBMSCs和rBMSCs从骨髓中分离出来后,分别成功诱导分化成骨和成脂。当MOI为1 000 PFU/mL时,AdF35-EGFP对2种BMSCs的活性均有明显抑制作用（P<0.001）。AdF35-eGFP感染hBMSCs 48 h后,荧光显微镜下可见发强烈绿色荧光的细胞,流式细胞仪检测其转染效率可达(84.8±7.1)％;Ad5-eGFP感染rBMSCs后,荧光显微镜下仅见少量发绿色荧光的细胞,48 h转染效率为(3.1±1.1)％。hBMSCs高表达CD46 mRNA,低表达CAR mRNA;而rBMSCs则高表达CAR mRNA,低表达CD46 mRNA,2种基因的表达差异有统计学意义（P<0.01）。结论：AdF35可作为理想载体携带目的基因转染hBMSCs,但不适合作为转染rBMSCs的载体。     

重组质粒pEGFP-N1-apoJ的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 体外构建重组质粒pEGFP-N1-apoJ，转染大鼠骨髓间充质干细胞，并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。方法 通过脂质体介导重组质粒pEGFP-N1-apoJ转染大鼠骨髓间充质干细胞，确定转染效率，并通过Real-time PCR、免疫细胞化学法、Western blot法检测载脂蛋白-J（apoJ）的表达。结果 增强型绿色荧光蛋白在大鼠骨髓间充质干细胞中瞬时转染效率达35%。转染后Real-time PCR、免疫细胞化学法和Western blot法检测证实重组质粒pEGFP-N1-apoJ在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。结论 重组质粒pEGFP-N1-apoJ成功转染大鼠骨髓间充质干细胞，并在大鼠骨髓间充质干细胞中得到表达,有助于应用apoJ行基因治疗,为进一步研究apoJ作为新的脑出血治疗措施奠定实验基础。     

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。     

人骨形态发生蛋白-7腺病毒的构建及其在犬转染骨髓基质干细胞后的表达

目的探讨携带人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)腺病毒构建方法以及其在犬转染骨髓基质干细胞中的表达情况。方法采用腺病毒表达系统体外构建携带BMP-7腺病毒的载体,转染人胚肾293细胞进行同源重组,利用BMP-7重组腺病毒转染犬骨髓基质干细胞,然后采用RT-PCR法检测BMP-7基因的表达。结果经过酶切鉴定证明获得了BMP-7转移质粒穿梭载体pTrack-BMP-7和BMP17重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒,病毒滴度为3.6×10~(12)VP/ml。RT-PCR证明BMP-7在重组腺病毒转染后的犬骨髓间充质干细胞中得到了表达,转染效率约98%。结论 BMP-7重组腺病毒的成功构建与成功转染犬骨髓间充质干细胞以及其高效表达,为骨缺损与骨不连的基因治疗提供了实验依据。     

腺病毒介导的人内皮型——-氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的：研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶（human endothelial nitric oxide synthase，heNOS）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的表达。方法：体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定；用PmeI线性化后去磷酸化的pShuttle—heNOS—EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy--1的感受态BJ 5183，使其在细菌内发生同源重组，获得阳性重组质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经Pac I酶切，转人AD 293细胞，包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。用重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP对MSCs进行转染，并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果：pShuttle—heNOS—EGFP与pAdeasy--1在BJ 5183中成功地发生了同源重组，得到了重组腺病毒质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论：采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中，并得到有效表达，且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况，这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

增强型绿色荧光蛋白转染对大鼠骨髓间充质干细胞体外神经元样细胞分化的影响

目的:利用质粒载体将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells-rMSC),研究EGFP对rMSC体外诱导分化神经元样细胞的影响.方法:以质粒为载体将EGFP基因转染rMSC,流式细胞...     

重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质干细胞的实验研究

目的 体外研究重组腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质于细胞(MSCs)的方法.方法 用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定,重组绿色荧光蛋白的腺病毒载体Ad-GFP转染,荧光显微镜检测其转染效率,CCK-8法检测转染细胞的增殖能力.结果 Ad-GFP对大鼠MSCs的感染率高达90.0%,感染1月后仍有稳定表达;转染细胞的增殖能力与未转染细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组腺病毒载体Ad-GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖能力不受影响,可作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法.     

bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞及对其增殖的影响

目的：观察bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞（bMSCs）后细胞目的基因的表达及对其增殖的影响。方法：将兔骨髓来源的间充质干细胞分离培养扩增,用PCR扩增法获得绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,转染间充质干细胞,用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白基因的表达,计算转染率,用MTT检测转染细胞的增殖特性。结果：实验成功地构建了绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,倒置荧光显微镜下观察到转染后的bMSCs发出稳定的绿色荧光信号,转染率为（43.32±4.51）%,MTT法显示重组质粒组增殖速度显著高于空白质粒组和未转染细胞组（P〈0.05）。结论：运用转染的方法实现了两种基因在MSCs中的共同表达,为监控MSCs细胞的转染和表达过程提供了一种手段。为后期利用MSCs细胞进行组织工程骨组织制造和移植提供了规范化的监控和程序化生产手段。     

腺病毒介导的白细胞介素10基因转移对胰岛β细胞凋亡及胰岛素释放的影响

目的 了解鼠白细胞介素10(mIL-10)基因转移对RINm5F胰岛β细胞凋亡及胰岛素释放功能的影响,以探讨其对1型糖尿病的潜在治疗价值.方法 携带有IL-10基因的重组腺病毒载体Ad-mIL-10感染RINm5F细胞(Ad-mIL-10组),并设置重组腺病毒载体(Ad-eGFP)组及未感染组为对照,通过RT-PCR、Western印迹及酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测IL-10基因和蛋白表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析细胞活力,放射免疫法行胰岛素释放实验.检测加入白细胞介素1-β(IL-1β)诱导细胞破坏后,Ad-mIL-10对培养上清中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)水平的影响,Hoechst33258核染色分析细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞表面Fas表达.结果 RINm5F细胞中检测到mIL-10基因及蛋白的有效表达,培养液中町测得IL-10蛋白.IL-10重组腺病毒感染胰岛β细胞后仍具有在高糖浓度下刺激胰岛素分泌的功能.将IL-1β作用于细胞后,Ad-mIL-10组NO、NOS水平低于未感染组及Ad-eGFP组[NO水平(nmol/106 cells):52.9±3.2比227.3±26.4、235.1±28.6,均P＜0.05;NOS水平(U/106 cells):9.3±1.2比29.8 ±2.5、30.5±2.8,均P＜0.05].Fas表达阳性细胞数明显低于未感染组及Ad-eGFP组(24.6%±1.0%比33.3%±5.1%、32.6%±1.1%,均P＜0.05);细胞凋亡率也低于其他两组(9.4%±1.1%比19.2%±2.2%、20.6%±2.3%,均P＜0.05).结论 携有mIL-10基因的重组腺病毒可在RINm5F细胞有效表达,通过抑制IL-1β诱导的Fas表达而起到抗凋亡作用,胰岛细胞生理功能不受影响.     

人白介素24腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建人白介素24（hIL-24）的腺病毒载体,获得hIL-24重组腺病毒子,为hIL-24进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-hIL-24重组质料为模板,PCR扩增hIL-24,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack—CMVR质粒上,PmeI线性化重组质粒pAdTrack—CMV-hIL-24,与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hIL-24,经Pacl线性化后转染QBI-293A包装细胞。收获腺病毒重组病毒子,RT-PCR和Western—blotting鉴定。结果测序结果显示hIL-24序列正确,RT—PCR和Western-blotting检测到了hIL-24的表达。结论成功构建人白介素24的重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack,CMV—hIL-24。获得了人白介素24重组病毒子Ad-hIL-24。     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

连环蛋白P120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建携带HA—tag的连环蛋白P120（P120ctn）基因重组腺病毒载体,并观察腺病毒感染后P120ctn在HepG-2细胞中的表达情况。方法把HA-tag和P120ctn基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒。再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取P120ctn重组腺病毒并进一步感染HepG-2细胞株。结果P120ctn基因成功克隆到腺病毒载体中,该腺病毒可高效介导P120ctn在HepG-2细胞中表达。结论成功地构建了含P120ctn基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体

目的构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体,为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础。方法将前期构建的PTENshRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含PTEN基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌。pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定及Westernblotting检测受感染海马神经元细胞内PTEN蛋白的表达。结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-U6-shRNA包被成功,受腺病毒感染海马神经元细胞内PTEN蛋白表达明显降低。结论成功构建了PTEN基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-shRNA,为应用基因沉默技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定了基础。     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…     

Gene-viral vectors: a promising way to target tumor cells and express antican cer genes simultaneously

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与美丽治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因-病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果：构建了一种新型基因-病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b-55kDa蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX-015相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。它还具有更大的优势,即该载体系统可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应用该载体系统携带该报告基因绿色荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果,并在电镜中证实该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因-病毒载体是将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,通过肿瘤增殖病毒在肿瘤细胞内特异性复制及增殖,从而数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量。它充分利用了肿瘤基因治疗与病毒治疗优势,进一步提高抗肿瘤的疗效,克服了传统基因治疗转染率低、表达量少及靶向性弱等缺点及病毒治疗的杀伤力低的缺点。它将成为肿瘤治疗最有希望的治疗方案之一。     

携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建

目的　构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究。方法　将 MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183胞内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义 MRP的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- ASmrp。结果　成功地构建了携带反义 MRP的重组腺病毒载体系统 ,经测定病毒滴度可达 2 .5× 10 9。结论　构建的重组腺病毒 Ad Easy- GFP-ASm rp可望有效地将反义 MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础