细胞穿膜肽的治疗应用

细胞穿膜肽(CPPs)是具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,能将蛋白质、多肽、核酸片段等以多种方式导入哺乳动物细胞内,其转导效率高且不会造成细胞损伤。CPPs的具体穿膜机制尚不清楚,甚至互相矛盾,但并不影响其在生命科学研究领域,包括基础研究和临床研究中的应用。CPPs已经在肿瘤、心肌病、免疫治疗等临床领域展现出很大的研究价值,并且已经取得了不少新的进展,具有广泛的应用前景。     

细胞穿膜肽在抗肿瘤靶向治疗中的研究进展

随着生物技术的发展,生物大分子在疾病治疗中的作用愈加重要,如蛋白质、寡核苷酸、多肽等.但是由于细胞膜的天然屏障作用,这些生物大分子的实际应用受到限制.细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一类具有较强细胞膜穿透能力的小分子短肽,可携带多种大分子物质进入细胞.本文综述了作为纳米载体的CPPs的分类及跨膜机制,以及近年其在抗肿瘤靶向治疗中的研究进展.     

细胞穿膜肽药物载体研究进展

细胞穿膜肽(CPP)是一类具有穿透细胞膜功能的小分子多肽,能携带多种生物活性分子进入细胞。随着对CPP研究的深入,发现其存在抗蛋白酶水解稳定性差、内体逃逸率低和缺乏靶向性等问题,严重限制其作为药物载体的应用。为了克服这些问题,完善CPP的药物载体功能,广大研究者提出了许多改进策略。本文主要就其改进策略加以综述,以期为CPP的改进提供新的思路。     

多肽修饰靶向给药系统在癌症治疗中的应用

多肽作为一类重要生物活性物质,具有活性高、低免疫原性、毒性低、易于装载等特点广泛应用于癌症治疗中。靶向给药系统可将药物选择性浓集定位于靶器官,靶组织,靶细胞中,将小分子多肽修饰于靶向给药系统表面,能在降低传统化疗药物毒副作用的同时提高治疗指数。本文介绍了包括表皮生长因子专一肽,肿瘤新生血管靶向肽以及细胞穿膜肽等修饰的靶向给药系统在癌症治疗中的应用,表明多肽修饰药物给药系统在癌症治疗中具有很好的临床应用前景。     

hPER1-NLS:一种新型穿膜多肽的研究

目的 研究hPER1-NLS多肽的穿膜特性。方法 用固相法化学合成hPER1-NLS多肽及对照多肽，用免疫组化方法观察hPER1-NLS的穿膜能力及在细胞中的定位，并对其穿膜的特性做初步研究。结果 hPER1-NLS对细胞膜有穿透作用，主要定位在细胞核中。且在不同作用环境条件下，都具有穿膜能力。结论 hPER1-NLS也是一种MPP，可能对于基因治疗及穿膜机制的探讨具有重要意义。     

多肽修饰脂质体靶向药物递送系统研究进展

目的 介绍近年来多肽修饰脂质体靶向药物递送系统的研究进展。方法 查阅和归纳总结近几年相关文献。结果 阐述了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽、丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸(APRPG)多肽、细胞穿透肽(CPP)、血管活性肠肽(VIP)等修饰脂质体的研究进展。多肽修饰的包载药物的脂质体可以增加药物在体内的选择性，减少药物毒副作用，提高药物治疗指数。结论 多肽分子是机体内一类重要的生物活性物质，将其作为导向物以配体-受体特异性结合的方式应用于靶向药物递送系统，具有良好的研究价值和应用前景。     

功能性支链的合成及靶向性CPPs修饰纳米脂质体的初步理化性质评价

目的：旨在合成功能性支链,并制备靶向细胞穿透肽 CPPs）修饰脂质体及对其体外理化性质进行初步表征。方法主要通过马来酰基团与巯基的特异反应合成多肽修饰的PEG－DSPE功能性支链,再通过薄膜分散法制备了靶向性CPPs修饰的载阿霉素多功能纳米脂质体,并利用激光粒度仪及荧光分光光度法对功能性脂质体的平均粒径表面电位包封率多分散系数及体外释药等理化性质进行研究。结果在脱氧充氮的条件下,利用Michael加成反应可以成功地合成功能性支链,并通过硫酸铵梯度法顺利地构建了靶向CPPs修饰的纳米脂质体,及初步考察出其体外纳米载体理化性质。结论本研究为脂质体构建所需功能性支链的合成工艺参数提供有价值的参考,为下一步系统研究其生物学性质提供前期基础。     

穿膜融合多肽TAT—N24对胃癌细胞迁移的影响

目的观察穿膜融合多肽TAT—N24对胃癌细胞MGC803迁移的影响。方法用纯化的融合多肽TAT—N24处理胃癌MGC803细胞,通过细胞迁移实验检测其对细胞运动迁移能力的影响,明胶酶谱实验观察其对肿瘤转移相关基因MMP9表达的影响。结果经TAT—N24多肽处理的MGC803细胞,其细胞迁移能力明显低于对照组细胞,差异具有统计学意义（P〈0．05）,但其对肿瘤转移相关基因MMP9的表达和分泌却没有影响。结论融合多肽TAT—N24能够抑制胃癌MGC803细胞的运动迁移能力,其在胃癌的治疗上可能具有潜在的应用前景。     

肿瘤靶向性细胞穿膜肽的固相合成及体外活性研究

目的采用固相合成法合成以基质金属蛋白酶为靶点的肿瘤靶向性细胞穿膜肽,用5-羧基四甲基罗丹明对其进行荧光标记,并对合成的产物进行生物活性和细胞毒性评估。方法采用N-芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基酸的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成肿瘤靶向性细胞穿膜肽,并在有耦合剂HATU和DMF的情况下,加入5-羧基四甲基罗丹明进行荧光标记,应用高效液相色谱分析仪和质谱仪测定其纯度和分子量;荧光显微镜观察穿膜肽对体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝脏细胞株LO2的穿膜效果,以评价穿膜肽的生物学活性;MTT比色法检测穿膜肽对SMMC-7721细胞活性的影响。结果所合成的细胞穿膜肽经高效液相色谱法鉴定纯度为96.05%,经质谱鉴定相对分子量为3504.9。这种穿膜肽对正常肝脏细胞株LO2无明显穿膜作用,但对肝癌细胞株SMMC-7721有较强的穿膜作用,并且对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法成功合成细胞穿膜肽;所合成的细胞穿膜肽具有肿瘤靶向性。     

穿膜融合多肽TAT-N24对胃癌细胞迁移的影响

目的观察穿膜融合多肽TAT-N24对胃癌细胞MGC803迁移的影响。方法用纯化的融合多肽TAT-N24处理胃癌MGC803细胞,通过细胞迁移实验检测其对细胞运动迁移能力的影响,明胶酶谱实验观察其对肿瘤转移相关基因MMP9表达的影响。结果经TAT-N24多肽处理的MGC803细胞,其细胞迁移能力明显低于对照组细胞,差异具有统计学意义(P<0.05),但其对肿瘤转移相关基因MMP9的表达和分泌却没有影响。结论融合多肽TAT-N24能够抑制胃癌MGC803细胞的运动迁移能力,其在胃癌的治疗上可能具有潜在的应用前景。     

含神经纤毛蛋白-1靶向序列的细胞穿透肽的合成及其与非小细胞肺癌的特异性结合研究

目的 设计一类具有C末端基序的新型肿瘤穿透肽YCCS,并检测其对非小细胞肺癌的靶向结合能力。方法 设计了融合肺癌靶向肽段CS及神经纤毛蛋白-1靶向肽段CRMP-1的新型多肽YCCS,采用Fmoc固相合成法合成多肽,并在多肽上标记荧光素FITC,以神经纤毛蛋白-1阳性的非小细胞肺癌A549、人乳腺癌MDA-MB-231,以及神经纤毛蛋白-1阴性的正常人肺成纤维细胞HBE135-E6E7、正常人肝细胞HL-7702为研究对象,观察荧光标记的多肽与A549细胞的特异性结合能力。结果 成功设计并合成了肿瘤穿透肽FITC-YCCS用于细胞结合研究,荧光细胞结合实验证实,在5 μmol/L浓度下,YCCS多肽能特异性的与非小细胞肺癌A549结合,而基本不与乳腺癌细胞及正常细胞结合。随多肽浓度升高,在20 μmol/L浓度下,YCCS多肽与乳腺癌细胞MDA-MB-231和肝细胞HL-7702出现少量结合。结论 本研究设计的肿瘤穿透肽YCCS在5 μmol/L浓度下,可检测到对非小细胞肺癌A549具有特异性结合能力。     

TAT-N24穿膜融合多肽的表达与鉴定

目的 表达并纯化TAT-N24穿膜融合多肽,初步探讨其生物学活性.方法 构建pTAT-HA-N24原核表达载体,在BL21大肠埃希菌中表达并纯化TAT-N24融合多肽,利用SDS凝胶电泳检测纯化蛋白的纯度,利用免疫细胞化学和流式细胞术检测TAT-N24融合蛋白的穿膜能力和生物学活性.结果 在原核表达系统中成功构建并表达纯化了TAT-N24穿膜融合多肽,其在6 mol/L尿素和DMSO中均具有较好的溶解性,纯化的融合多肽经SDS凝胶电泳分析未见明显杂蛋白混入,利用免疫细胞化学染色可见TAT-N24处理结肠HT29细胞12 h后90%以上的细胞中可检测到TAT-N24,流式细胞术检测细胞周期可见TAT-N24能够有效地诱导细胞周期阻滞,抑制结肠癌细胞生长.结论 TAT-N24具有高效的穿膜能力,并能有效抑制结肠癌细胞增殖,可望开发成为有效的肿瘤分子治疗药物.     

细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究

目的 构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体，并研究其蛋白转导功能。方法 在带His标记的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pET14b—HE（pET14b-His-EGFP）基础上，利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽（CPP）、连接子、核定位信号（NLS）序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b—HC（L）NE（pET14b—His—CPP—Linker-NLS—EGFP）；经酶切、测序鉴定载体构建正确后，将重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni^2＋亲和层析纯化得到融合蛋白：将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中，荧光显微镜下观察并进行Western blot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果 酶切、测序证实载体构建成功，融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达：蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核，并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论 成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体，建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统，为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。     

穿膜肽HIV-Tat49-57和CTL表位融合多肽疫苗的初步免疫学效应研究

目的探讨穿膜肽HIV-Tat49-57将CTL表位带入活细胞胞质并将其投入MHC-Ⅰ类抗原提呈途径的可能性.方法应用多肽固相合成技术,分别合成含HIV Tat49-57和HLA-A2.1限制性CTL优势表位MART-127-35的18肽和该CTL表位9肽.采用间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜技术,分别对上述18肽和9肽的穿膜能力进行了动态观察.进一步用标准51Gr释放试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA-A2.1阳性健康者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导的表位MART-127-35特异性CTL活性.结果 18肽能够穿过活哺乳动物细胞质膜进入胞质,并呈现出时间、剂量依赖关系;而9肽则无此效应.与9肽相比,18肽在体外诱导出了明显增强的特异性CTL活性(P<0.05).结论穿膜肽HIV Tat49-57可有效携带CTL表位穿过细胞膜进入胞质,并有效激发出针对该表位的特异性CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供新思路.     

一种合成多肽——PLNG自由穿膜现象初探

目的 研究人工设计合成的多肽PLNG在不同作用环境条件下的跨膜运动现象。方法 体外培养不同组织来源的鼠细胞及CHO细胞、BEL细胞,用免疫荧光观察不同浓度、不同温度、不同反应时间条件下,PLNG的穿膜能力及PLNG对不同类型的细胞（CHO细胞、BEL细胞、成年大鼠肝细胞、幼大鼠肝细胞、成年大鼠心肌细胞、幼大鼠心肌细胞、成年大鼠神经细胞、幼大鼠神经细胞）的穿膜特性。结果 PLNG在不同作用环境条件下对细胞膜都有穿透作用,且进入细胞的量近乎相同。结论 实验观察到PLNG具有广谱的穿膜能力,这种穿膜能力在一定范围内对温度、时间及PLNG浓度不敏感;而且这种穿膜能力不受组织特异性的限制。     

转铁蛋白在蛋白多肽药物口服给药中的应用

转铁蛋白作为一种药物载体,在蛋白多肽药物的口服给药领域有着美好前景。以转铁蛋白作为药物载体,可以使蛋白肽类药物在肠道吸收;对转铁蛋白进行适当的修饰,可以提高其递送效率。本文概述了近年来转铁蛋白在蛋白多肽药物口服给药中的作用及有关转运机制的研究进展。     

MPP-hPER1融合蛋白穿膜的实验研究

本课题研究了MPP-hPER1融合蛋白对多种细胞的穿膜性.在分析MPPs家族分子组成特点的基础上,合成了PLNG活性肽.并且应用重组技术构建了MPP-hPER1融合蛋白表达体系,通过细胞培养、转染、免疫荧光染色等手段,观察了不同作用时间、不同温度、不同细胞系的条件下,PLNG及MPP-hPER1融合蛋白对细胞膜的穿透能力.结果显示PLNG及MPP-hPER1融合蛋白穿透细胞膜是非能量依赖型、非时间依赖型和非细胞种系依赖型.提示生物体中有一类特殊的生物大分子,按照非经典途径进入细胞发挥生物学活性作用.实验结果提示,PLNG可以作为一种特殊的生物分子载体,介导功能分子进入细胞,在基因治疗及细胞治疗领域发挥作用.     

穿膜序列对MHC-Ⅰ类限制性CTL表位呈递影响的研究

目的:从时间依赖性抗原呈递动力学的角度研究穿膜序列(CPP)对MHC-Ⅰ类限制性CTL表位呈递的影响.方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含CPP与H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的融合多肽,同时合成该表位N、C端自然延伸的抗原肽和无关对照肽.采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测抗原呈递细胞(APC)在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC-Ⅰ类呈递的情况.结果:与不含CPP的抗原肽相比,含CPP的抗原肽中的CTL表位更易进入APC内MHC-Ⅰ类呈递途径,表现为呈递所需时间明显缩短(P<0.05),且同一时相点的呈递强度显著增加(P<0.05).结论:在外源性抗原肽中引入穿膜序列可明显促进其MHC-Ⅰ类限制性CTL表位的呈递效率,从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性.     

MPP—hPER1融合蛋白穿膜的实验研究

本课题研究了MPP－hPER1融合蛋白对多种细胞的穿膜性。在分析MPPs家族分子组成特点的基础上，合成了PLNG活性肽。并且应用重组技术构建了MPP－hPER1融合蛋白表达体系，通过细胞培养、转染、免疫荧光染色等手段，观察了不同作用时间、不同温度、不同细胞系的条件下，PLNG及MPP－hPER1融合蛋白对细胞膜的穿透能力。结果显示：PLNG及MPP－hPER1融合蛋白穿透细胞膜是非能量依赖型、非时间依赖型和非细胞种系依赖型。提示生物体中有一类特殊的生物大分子，按照非经典途径进入细胞发挥生物学活性作用。实验结果提示，PLNG可以作为一种特殊的生物分子载体，介导功能分子进入细胞，在基因治疗及细胞治疗领域发挥作用。     

低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤应用

【目的】研究重组穿膜肽天花粉蛋白的抗肿瘤作用。【方法】利用蛋白重组技术,在天花粉蛋白的C端引入半胱氨酸,并以此作为修饰位点偶联穿膜肽,通过亲和色谱法分离纯化得到目的蛋白。以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白的生成以及其对还原性物质的响应性。通过细胞摄取实验研究穿膜肽介导蛋白内吞摄取效率,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,测定穿膜肽天花粉蛋白修饰物的抗肿瘤活性。【结果】成功制备穿膜肽—天花粉蛋白复合物,此复合物具有一定还原响应性。且经过穿膜肽修饰后,天花粉蛋白在HeLa、MCF-7肿瘤细胞的摄取率明显增强,对HeLa、MCF-7细胞的抗肿瘤作用也显著提高。【结论】穿膜肽修饰天花粉蛋白可显著提高其抗肿瘤作用。