人骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的实验研究

采用密度梯度离心法分离出胸骨骨髓间充质干细胞（HBMCs），经体外培养、扩增、纯化后，加入诱导因子定向诱导为内皮细胞（ECs），并对细胞进行鉴定。证实HBMCs在特定环境下可分化为ECs，以HBMCs诱导为ECs作为种子细胞具有可行性。     

人胎肝干细胞的体外培养及诱导分化

为体外分离培养和诱导分化人胎肝干细胞 ,从原代分离培养人胎肝干细胞集落 ,免疫细胞化学鉴定细胞集落分子标志物的表达 ;在体外特定细胞因子作用下诱导干细胞定向分化为成熟肝脏细胞 ,对其生物学特性进行初步鉴定。结果 ,从人胎肝组织中成功分离表达AFP、Albumin、Cytokeratin等标志物的胎肝干细胞集落 ,在体外特定细胞因子作用下肝干细胞可定向分化为成熟肝脏细胞。因此人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞 ,体外可定向分化为成熟肝细胞。人胎肝干细胞的分离培养对于生物型人工肝的制备及其深入研究奠定了良好的基础     

心肌样细胞和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物在体内构建工程化心肌组织

目的 探索以骨髓间充质干细胞（BMMSCs）诱导分化的心肌样细胞为种子细胞、以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）作为支架材料,在大鼠体内构建工程化心肌组织的可实施性。 方法 分离培养大鼠BMMSCs,取第3代细胞用5-氮胞苷和血管紧张素Ⅱ联合诱导24 h继续培养3周,将诱导分化的心肌样细胞种植到PLGA支架上形成移植物,在孵箱里孵育3 d,然后将其移植到预先制备好的大鼠腹膜腔囊袋之中。4周以后,取出移植物并采用HE染色观察心肌样细胞的形态特征、用免疫组织化学染色法检测工程化心肌细胞肌钙蛋白（cTn） I的表达、透射电镜下观察心肌样细胞的形态和结构。 结果 HE染色结果显示,在PLGA支架上可见到梭形的细胞核,且心肌样细胞分布均一;免疫组织化学染色结果显示PLGA-心肌样细胞组绝大多数移植细胞表达心肌特异性蛋白cTnI;透射电镜观察显示,在体内构建的工程化心肌组织中,可以看到肌丝沿细胞的长轴平行排列,胞浆中富含大量的线粒体和内质网,以及桥粒结构、缝隙连接和Z线样物质。 结论 成功的建立了在大鼠体内构建工程化心肌组织的方法。这种体内微环境有助于移植组织或细胞的存活,在大鼠体内构建的工程化心肌组织具有与天然心肌组织相似的结构。     

人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的研究

取心血管外科手术患者胸骨骨髓,Ficoll离心法获取单个核细胞,体外培养扩增后种植在猪去细胞主动脉瓣叶表面2周,观察细胞生长情况;免疫组化检测细胞分化结果;扫描电镜和透射电镜观察细胞种植情况.结果 经体外培养的入骨髓基质干细胞在去细胞猪主动脉瓣叶纤维网状支架表面形成一层基本连续的细胞层.认为去细胞猪主动脉瓣叶组织是良好的纤维支架,可用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的.     

组织工程在心血管病治疗中的应用

组织工程学是将细胞生物学和材料学、工程学相结合进行体外构建组织或器官的新兴学科。其基本原理是将体外培养、扩增的,具有特定生物学功能的种子细胞与可降解材料相结合,形成细胞-材料复合物,在体外培养一定时间后植入体内用以修复替代病损的组织器官。组织工程学在心血管病治疗中主要应用于组织工程心脏瓣膜、组织工程血管和组织工程心肌三个方面。分述如下。1组织工程心脏瓣膜临床上应用的人造心脏瓣膜(机械瓣,生物瓣)可有效改善血流动力学,提高患者生存质量,但存在不同程度的缺陷:机械瓣需终身抗凝,易致出血、栓塞和感染;同种异体瓣有…     

聚乙二醇去细胞瓣复合支架联合人主动脉瓣膜间质细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:运用聚乙二醇(PEG)交联猪去细胞瓣,共价接枝GRGDSPC多肽(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸),并联合人主动脉瓣膜间质细胞(HAVICs)体外构建组织工程心脏瓣膜。方法:通过迈克尔加成反应,将去细胞瓣支架上引入的巯基与枝化状PEG末端丙烯酰基共价结合,使PEG交联去细胞瓣,并行生物力学检测。再利用PEG-去细胞瓣支架上未饱和的丙烯酰基与GRGDSPC多肽末端半胱氨酸的巯基发生迈克尔加成反应,对PEG-去细胞瓣支架行GRGDSPC多肽共价修饰,免疫荧光测定GRGDSPC多肽修饰效果。在RGD-PEG-去细胞瓣复合支架上种植HAVICs,缝制于生物反应器内,体外构建心脏瓣膜。接种2、4、8h后,通过细胞计数观察细胞粘附情况。体外培养10d后行形态学观察和DNA含量测定。结果:力学测试结果显示,PEG-去细胞瓣支架的最大抗张强度较单纯去细胞瓣支架明显提高[(7.53±0.32)Mpa∶(5.65±0.28)Mpa],差异有统计学意义(P<0.05),与天然主动脉瓣的差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光检测显示,GRGDSPC多肽可有效地与PEG-去细胞瓣共价接枝。不同时段细胞粘附计数及形态学观察提示,RGD-PEG-去细胞瓣复合支架明显促进HAVICs的粘附,并可在瓣膜表面形成连续单细胞层。DNA含量测定提示,RGD-PEG-去细胞瓣复合支架DNA含量明显增高(P<0.05)。结论:PEG交联去细胞瓣可明显改善瓣膜支架力学性能,GRGDSPC多肽接枝的PEG-去细胞瓣复合支架,可促进种子细胞的粘附,改善瓣膜支架生物学性能。     

胚胎干细胞用于肝组织工程研究的初步评价

目的在生物材料上进行胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESc）的三维培养和肝细胞定向诱导分化,评价其用于构建肝组织工程的可行性。方法胰酶消化生物反应器悬浮旋转培养5天的拟胚体（embryoid bodies,EBs）,将细胞悬液与细胞外基质Matrigel 1∶1混合接种于聚乳酸（poly-L-lactic acid,PLLA）和聚乙醇酸（polyglycolic acid,PGA）共聚合三维支架内,用系列诱导剂定向诱导肝细胞分化。镜下动态观察ES细胞的培育和生长情况,并用HE染色、糖原染色、免疫荧光染色检测组织结构形态、肝细胞功能及其肝细胞标志物白蛋白（ALB）的表达。结果显微镜和扫描电镜见ESc可在聚合支架材料上三维立体状态生长,随培养时间不断增殖,交织成网状。HE染色提示形成了致密的类肝组织样结构。糖原染色和免疫荧光染色结果提示形成的类肝组织表达Alb,并有大量糖原存在。结论可在PLLA/PGA三维支架材料及Matrigel上培养ESc和定向肝细胞诱导分化,长时间培养后可形成类肝样组织。     

体外诱导胚胎干细胞源性表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究

目的通过探索体外诱导来源于胚胎干细胞的表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的可行性及条件,为寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞。将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果。结果体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达。培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志。经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化。结论胚胎干细胞源性表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。     

组织工程心脏瓣叶体外研究瓣叶基质的检测

目的　初步探讨组织工程心脏瓣叶体外生成基质的检测。方法　杂种猪 4只 ,取主动脉。分离并培养、扩增内皮与成纤维、平滑肌细胞 ,将细胞种植在湿化处理后的支架材料上 (聚羟基烷酸酯 ,PHA)。以首次种植成纤维、平滑肌细胞为起点 ,培养 2 8d ,使用氯胺 T法检测样本的羟脯氨酸含量 ,并行扫描电镜检测。结果　氯胺 T法检测羟脯氨酸 ,方法简便 ,准确性高 ,经测定组织工程心脏瓣叶羟脯氨酸含量为 (10 93± 2 89) μg/g(材料重量 )。扫描电镜检测显示细胞表面可见基质的形成。结论　氯胺 T法可精确测定体外培养的组织工程心脏瓣叶胶原含量 ,结合扫描电镜可有效检测基质的生成     

体外培养人骨髓基质细胞表面抗原检测及分化能力观察

目的检测体外培养人骨髓基质细胞（BMSCs）表面抗原,并观察其分化能力。方法取人颅骨板骨髓组织,以BMSCs专用培养基接种培养,经多次换液得到较纯的BMSCs;在倒置显微镜下观察细胞形态,应用流式细胞仪对细胞表面抗原进行检测;体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导,分别进行油红0染色及yonKossa染色。结果培养细胞表面抗原检测显示,CD14阴性、CD45阴性、CD29阳性、CD90阳性、CD105。阳性;脂肪细胞定向诱导后,油红0染色见胞质内有红色脂肪颗粒;成骨细胞定向诱导后,yonKossa染色见有钙结节形成。结论培养细胞表型特征符合BMSCs,并具有自我更新特性和多向分化潜能。     

组织工程化肺动脉带瓣管道纤维支架制作方法初步探讨

目的:观察采用酶加去污剂的方法脱去猪肺动脉带瓣管道的细胞和基质的效果,并通过物理和化学等方法对其进行测定,评价其作为组织工程支架材料的可行性。方法:采用0.25%胰蛋白酶和1%的Triton依次对新鲜猪肺动脉带瓣管道进行脱细胞脱基质处理。通过厚度、含水量、抗拉强度及热皱缩温度测定其物理性质与新鲜猪肺动脉对比;通过测定其蛋白多糖含量间接反应基质脱除的大小;通过新西兰幼鼠皮下埋植试验观察异种移植后炎症反应的大小。结果:采用0.25%胰蛋白酶和去污剂1%Triton能够有效脱除肺动脉壁和瓣膜中的细胞和基质成分,产生多孔隙性、低免疫原性的支架材料,初步具备良好组织工程支架材料的基本特点。     

蛋白多糖在脱细胞猪肺动脉带瓣管道中抗钙化的作用

目的:证实去除细胞外基质蛋白多糖对提高脱细胞猪肺动脉带瓣管道抗钙化性能的作用,为研制组织工程化肺动脉带瓣管道做准备。方法:实验分为3组,即A组:为新鲜猪肺动脉带瓣管道组织,B组:用胰蛋白酶+Triton X-100处理的脱细胞猪肺动脉带瓣管道组织和C组:在B组处理的基础上再经透明质酸酶消化,去除细胞外蛋白多糖基质成分的猪肺动脉带瓣管道组织,每组4份(n=4)。方法:实验室:将3组样本分别进行HE染色后,用光镜和扫描电镜观察肺动脉管壁及瓣膜组织的变化。采用盐酸胍抽提结合阿利新蓝染色法测定蛋白多糖的含量。同时将3组样本包埋于大鼠皮下,于6周后取出标本进行Van Kosaa银染色法(钙盐染色)和原子吸收分光光度计法分别定性、定量分析组织的钙化程度。结果:光镜和电镜检查结果显示,猪肺动脉管壁和瓣膜组织的细胞可以较完整的去除,纤维网架结构可以完整保持。蛋白多糖含量的测定显示,与A、B组相比,C组细胞外基质蛋白多糖的含量显著下降(P<0.05)。大鼠皮下包埋实验显示,与A、B两组相比,C组的钙化反应更少,管壁组织钙的含量显著下降(P<0.05)。结论:采用胰蛋白酶+Triton X-100脱细胞方法可以达到去除细胞的目的。通过大鼠皮下包埋实验证明,采用透明质酸酶消化减少细胞外基质蛋白多糖的含量可以进一步减少脱细胞组织的钙化反应,为组织工程肺动脉带瓣管道的构建提供较为理想的脱细胞基质材料。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

目的对人骨髓间充质干细胞（HMSCs）的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20ml,密度梯度离心法分离HMSCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HMSCs表面标记物;MMT法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果HMSCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC、UEA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HMSCs的染色体数目未发生改变。结论密度梯度离心法可得到纯度较高的HMSCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HMSCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。     

组织工程心脏瓣膜构建中细胞种植的实验研究

目的 观察不同细胞种植在脱细胞猪主动脉瓣叶支架上的生长特点。方法 将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理．并在其上分别种植新生牛主动脉内皮细胞(BAECs)、平滑肌细胞(SMCs)、SMCs和BAECs。结果 猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除，种植的BAECs在脱细胞瓣叶表面形成一连续的细胞层．SMCs形成多层连续的细胞层，复合种植细胞则形成多层连续的细胞层；BAECs表面形成一连续的细胞层，其间为多层分布的SMCs，同时内皮细胞分泌前列环素(PGI2)的能力明显增强。结论 不同种类的细胞在脱细胞瓣叶表面均生长良好，并呈现不同的生长方式，SMCs和BAECs复合种植有可能为今后组织工程瓣膜构建中有关细胞种植提供参考。     

体外构建工程化心肌组织的实验研究

目的探索以胶原海绵为支架,新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞,于体外构建工程化心肌组织。方法用胰酶消化法分离新生大鼠心肌细胞,经初步纯化,然后接种于长方形片状胶原海绵中,将此细胞/胶原复合物置于细胞培养箱中,培养25 d,采用常规苏木精-伊红（HE）染色、免疫组织化学染色和透射电子显微镜等方法评价该工程化心肌组织片的形态和功能。结果构建的工程化心肌组织片先是出现局部自发收缩,随时间延长,自发收缩区域增多、强度增大,整个心肌片出现同步收缩,此收缩活动可持续25 d。检测结果显示,工程化心肌组织内细胞间连接广泛存在,细胞多呈纵向分布,胞核呈长圆形;多数细胞胞浆内α-肌节肌动蛋白阳性;细胞间连接清晰可辨,细胞内的肌原纤维排列整齐,可见到肌小节结构和Z线。结论用新生大鼠原代心肌细胞作为种子细胞、胶原海绵为支架,于体外可构建组织形态与生理功能类似于成熟大鼠心肌组织的工程化心肌组织。     

大鼠胰腺干细胞的分离纯化、鉴定及定向分化

目的 探讨大鼠胰腺干细胞体外分离、纯化的实验条件及其定向分化潜能.方法 应用胰腺原位灌注V型胶原酶消化大鼠胰腺组织,100目滤网滤过,Ficoll 400浓度梯度离心法分离胰腺干细胞,采用添加表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基行体外培养.运用荧光免疫染色法检测细胞表面CK-19、Pdx-1、Nestin、Insulin和Glucagon蛋白,计算阳性细胞率.双硫腙(DTZ)染色鉴定诱导分化后的细胞,光电酶标记法ELISA检测胰岛素分泌功能.结果 本实验获取的胰腺干细胞,体外培养可稳定传代培养8代以上.细胞表面CK-19、Pdx-1和Nestin蛋白均呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(81.3±7.5)%.诱导分化后细胞经DTZ染色呈棕红色.在高糖刺激下,培养上清液中胰岛素含量增高.结论本法可获取高纯度、多数量的胰腺干细胞,在人工诱导下可定向分化为具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团,为临床胰岛移植获得足量细胞来源提供实验基础.     

大月龄胎儿同种带瓣血管组织库的初步研究

目的探讨创建大月龄胎儿同种带瓣血管组织库的可行性。方法取脑死亡胎儿15例,胎龄28～40周,体重1500～2600g,热缺血时间<150分钟。其中带瓣主动脉15个,带瓣肺动脉8个。严格无菌操作,-196℃液氮长期保存,组织学观察冷冻前后血管大体形态、内皮细胞及超微结构的变化。结果冷冻前后血管瓣膜无细菌污染,动脉壁支架结构完整,血管瓣膜内皮细胞部分脱落。结论深低温冷冻保存的胎儿同种血管瓣膜结构完整,创立大月龄胎儿带瓣血管组织库切实可行。     

BMSCs的分离培养、纯化与鉴定

目的 建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离培养体系.方法 运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs,利用相差显微镜观察其形态及生长情况,扫描电镜观察其细胞结构,运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力,用MTT比色法绘制细胞生长曲线,并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化,利用ALP和油红O进行染色鉴定.结果 所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征,分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期,第10天进入平台期;在成骨、成脂肪的诱导培养条件下,分别出现成骨、成脂肪表型特征,可进一步定向分化,结论所收获的细胞具有BMSCs的特异性.     

外管道在复杂心脏畸形治疗中的应用

1966年Ross等将带瓣管道首次应用于连接右心室流出道和肺动脉,以后各类同种或异种带瓣主动脉及肺动脉逐渐用于各类复杂心脏畸形的治疗。目前临床应用的心外科管道主要有:人工合成的材料、带机械瓣、生物瓣的人工血管、异种管道和同种异体管道,与前3种管道相比,低温保存的同种带瓣心外管更有优势。本文对外管道使用中的一些问题、影响外管道疗效的相关因素,以及外管道再次置换等问题做一综述。     

人骨髓间质干细胞分离、培养、分化和鉴定方法的研究

目的 探讨人骨髓间质干细胞(hMSCs)分离和体外培养的适宜条件,检测其多向分化的能力.方法 应用细胞生物学干细胞培养法、分子生物学干细胞组织工程学等方法研究hMSCs的分离、培养并检测其多向分化潜能.结果 hMSCs增殖能力在一定的范围内(2.5%～20%)随着血清浓度的增加而增大,20%的血清浓度最适宜,其增殖活性在一定种植密度范围内(1～8×10~4/ml)随种植细胞数量增加而增高,在种植细胞密度为8×10~4/ml时,细胞的增殖活性最高.所分离、培养的hMSCs是纯的、可长期传代、扩增的稳定的细胞.hMSCs在成脂培养基中有脂肪细胞形成,苏丹Ⅲ染色法将脂肪细胞胞浆染成桔红色.在成软骨培养基中有软骨细胞形成,阿尔新蓝染色法将软骨结节样结构染为深蓝色.在成骨培养基中有成骨细胞形成,Von Kossa染色法显示有黑色矿化结节形成.该细胞在特定的诱导培养条件下具有向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化能力,符合判定hMSCs的"金标准".结论 所分离、培养的hMSCs是纯的、可长期传代、扩增并保持未分化状态的、稳定的细胞,其在体外诱导条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化,是一种具有多向分化潜能的细胞.