大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ的基因克隆与表达

国产海龙科药用鱼类研究进展张朝晖，徐国钧，徐珞珊等．中国海洋药物，１９９５，１４（４）：２６对国产海龙科药用鱼类从分类学研究、药材资源研究、组织学研究、化学成分研究、药理作用研究等７个方面的进展进行综述，全文综述文献３１篇。国产海龙科药用鱼类研究进展...     

大肠杆菌L—天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达

用一对与大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因两侧序列互补的寡核苷酸Ｅ１,Ｅ２６和引物,以大肠杆菌野生株ＣＰＵ２１０００９的染色体ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增得到约１．２ｋｂ的ＣＤＮＡ片段,将此片段插入ＰＫＫ２３３－２的ｔａｃ启动子下游,转化不同的大肠杆菌宿主菌株,结果表明以ＣＰＵ２１０００９为宿主菌时,转化子的酶表达量最高,重组Ｌ－天门冬酶胺酶占菌体总蛋白４８．３％,发酵液酶活力达４００ＩＵ／ｍｌ,比活为４     

大肠杆菌L－天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达

用一对与大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因（ＡｎｓＢ）两侧序列互补的寡核苷酸Ｅ１,Ｅ２作引物,以大肠杆菌野生株ＣＰＵ２１０００９的染色体ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增得到约１．２ｋｂ的ＤＮＡ片段,将此片段插入ｐＫＫ２３３－２的ｔａｃ启动子下游,转化不同的大肠杆菌宿主菌株,结果表明以ＣＰＵ２１０００９为宿主菌时,转化子的酶表达量最高,重组Ｌ－天门冬酰胺酶占菌体总蛋白４８．３％,发酵液酶活力达４００ＩＵ／ｍｌ;比活为４８ＩＵ／ｍｇ蛋白,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯化后的重组Ｌ－天门冬酰胺酶分子量与天然酶相同,均为１４０ＫＤ。     

大肠杆菌L－天门冬酰胺酶的提取和纯化

大肠杆菌Ｌ－天门冬酰胺酶的提取和纯化刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐．药物生物技术,１９９５,２（１）：１６～１９大肠杆菌能产生两种Ｌ－天门冬酰胺酶,其中Ｌ－天门冬酰胺酶Ⅱ具有抗癌活性,以往对该酶的提取纯化常采用丙酮破碎细胞、有机溶剂反复分级沉淀的方法...     

氨气敏电极终点速率法测定天门冬酰胺酶活

作者建立了测定天门冬酰胺酶活性的氨气敏电极终点速率法。探讨了温度、pH、时间对测定结果的影响,以及不同pH的洗涤液对氨气敏电极洗涤复位的速度差异。本法的测定下限为0.0167U/L天门冬酰胺酶,与Berthelot氨显色法的相关系数为0.995,回归系数为0.948,平均回收率为98.8％,批内误差为2.7％,批间误差3.2％。用酸性洗涤液洗涤氨气敏电极可将处理时间缩短到原来的的四分之一。     

产肠毒素大肠杆菌定居因子Ⅰ基因克隆与表达

目的：在大肠杆菌DH5α中表达产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenio eseheriehia coli,ETEC）定居因子CFA／Ⅰ,检测重组表达的ETECCFA／Ⅰ。方法：以质粒pBV220为基础,构建pBV220-CFA／1重组载体,表达产物用SDS—PAGE鉴定,免疫原性实验验证。结果：成功构建了pBV220-CFA/Ⅰ重组载体,表达产物的分子量与天然蛋白相同,动物免疫试验表明重组菌具有免疫原性。结论：CFA／Ⅰ基因的成功克隆为今后的ETECCFA／Ⅰ候选疫苗研制奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌定居因子I基因克隆与表达

目的:在大肠杆菌DH5α中表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenio escherichia coli,ETEC)定居因子CFA/I,检测重组表达的ETEC CFA/I.方法:以质粒pBV220为基础,构建pBV220-CFA/I重组载体,表达产物用SDS-PAGE鉴定,免疫原性实验验证.结果:成功构建了pBV220-CFA/I重组载体,表达产物的分子量与天然蛋白相同,动物免疫试验表明重组菌具有免疫原性.结论:CFA/I基因的成功克隆为今后的ETEC CFA/I候选疫苗研制奠定了基础.     

Wnt信号通路抑制对急性白血病天门冬酰胺酶耐药性的影响

目的:探讨Wnt信号通路抑制对急性淋巴细胞白血病(ALL)天门冬酰胺酶(Asp)耐药性的影响。方法:人ALL细胞株THP-1分为对照组、Asp组与si-Wnt组,Asp组与si-Wnt组分别转染siRNA阴性对照与Wnt siRNA,转染后48 h,两组均加入Asp(终浓度为0.25μM),对照组只加生理盐水。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期,Western-blot法检测蛋白表达水平。结果:Asp加药后24 h、48 h、72 h,si-Wnt组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均高于对照组和Asp组,且Asp组高于对照组(P<0.05)。Asp加药后72 h,si-Wnt组的G0/G1期细胞比例、Wnt及AKT蛋白表达均低于对照组与Asp组,Asp组低于对照组(P<0.05)。而si-Wnt组G2/M期细胞比例高于对照组与Asp组,且Asp组高于对照组(P<0.05)。结论:Wnt信号通路抑制可降低ALL细胞对Asp的耐药性,抑制AKT蛋白的表达,阻滞细胞周期,促进ALL细胞的凋亡,抑制其增殖。     

大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆与表达

应用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５中扩增出长约１．４Ｋｂ的色氨酸酶基因,将其插入高表达载体ｐＥＴ３ａ的ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ位点,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）,构建高产色氨酸酶基因工程菌。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和薄层扫描表明,工程菌色氨酸酶的表达量占细胞总可溶性蛋白的６９．８％。酶活测定结果表明,７株工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高,其中ＷＷ－１１号比宿主菌高１６倍。     

醇酒酵母S—腺苷甲硫氨酸合酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建S－腺苷甲硫氨酸合酶基因工程菌,为酶促转化法生产S－腺苷甲硫氨酸奠定基础。方法：应用PCR技术从S－腺苷甲硫氨酸高产酿酒酵母染色体DNA中扩增得到S－腺苷甲硫氨酸合成酶基因sam2,将其克隆至表达载体pT7－7,转化大肠杆菌,1％琼脂糖电泳比较大小,筛选重组予。结果：SDS－PAGE显示重组菌S－腺苷甲硫氨合成酶亚基分子量约为42KDa,平均表达量约占菌体总可控性蛋白的42％,酶活达到14．1U/g湿菌体,比宿主菌酶活提高15．7倍。结论：酿酒酵母SAM合成酶基因在大肠杆菌中高效表达,重组菌已具有初步的工业化应用价值。     

甲苯生物降解的关键酶基因克隆及表达

目的:克隆、表达恶臭假单胞菌生物降解甲苯的关键酶基因。方法:恶臭假单胞菌WZ-1在含甲苯的MS培养基中培养以鉴定其降解甲苯的能力。设计引物扩增甲苯生物降解的关键酶——甲苯双加氧酶和邻苯二酚1,2双加氧酶基因,PCR扩增目的片段后进行T-A克隆,筛选阳性克隆并鉴定。构建甲苯双加氧酶-pET28a进行体外诱导表达。结果:恶臭假单胞菌WZ-1在含甲苯的MS培养基的生长曲线证明其具有降解甲苯的能力;通过重组技术获得阳性克隆,并以酶切、DNA测序进行鉴定;IPTG诱导后获得重组甲苯双加氧酶的高表达。结论:成功获得了用于降解甲苯的甲苯双加氧酶基因和邻苯二酚1,2双加氧酶基因,并在体外诱导表达了目的蛋白,为后续利用模式生物对苯系物的生物降解建立了实验基础。     

弓形虫主要表面抗原基因克隆及在大肠杆菌中的表达

为在大肠菌中表达弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）,进一步研究其生物学功能。将ＳＡＧ１基因重组于ｐＧＥＭＥＸ－１事例型表达载体上,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,得到含重组表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１／ＳＡＧ１的工程菌。结果表明ＩＰＴＧ诱导表达后,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ＳＡＧ１蛋白。提示ｐＧＥＭＥＸ－１大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的ＳＡＧ１蛋白。     

弓形虫主要表面抗原基因克隆及在大肠杆菌中的表达

为在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）,进一步研究其生物学功能。将ＳＡＧ１基因重组于ｐＧＥＭＥＸ－１融合型表达载体上,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,得到含重组表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１／ＳＡＧ１的工程菌。结果表明ＩＰＴＧ诱导表达后,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ＳＡＧ１蛋白。提示ｐＧＥＭＥＸ－１大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的ＳＡＧ１蛋白。     

Rv1196基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 用PCR方法从结核菌基因组中扩增Rv1196基因,将之重组到pET24b载体,在大肠杆菌中进行融合表达,重组蛋白纯化后通过免疫印迹反应初步鉴定其抗原性和特异性.方法 提取H37Rv标准株的基因组DNA;设计Rv1196基因两端的引物,通过PCR方法从基因组DNA中扩增出Rv1196抗原的基因,直接连接到pGEMT载体上,经过筛选鉴定后,将重组子测序;将测序的质粒用NdeI和XhoI双酶切后连接到pET24b载体上,筛选得到重组载体pET24b-39;转化BL21并优化表达条件,采用金属鏊合层析纯化重组蛋白;选取7例结核病阳性临床血清标本和7例健康人血清标本进行Western blot分析.结果 获得了氨基酸编码序列正确的基因,与数据库中报道一致;Rv1196基因能够在大肠杆菌中高效表达,其表达量约占细菌总蛋白的30%以上;重组抗原不与健康人血清反应,但与结核标本血清呈强烈反应.结论 重组Rv1196抗原具有较好的特异性和抗原性,有较好的血清学分析价值.     

纳豆激酶原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　构建纳豆激酶原基因克隆 ,实现其在大肠杆菌中的表达。方法　从纳豆芽胞杆菌中分离纯化基因组DNA ,作为模板通过PCR扩增纳豆激酶原基因。运用重组DNA技术 ,构建表达质粒pESX 1,转化大肠杆菌JF112 5 ,温度诱导表达目的蛋白。结果　琼脂糖凝胶电脉及核苷酸序列分析证实 pESX 1为含纳豆激酶原基因的阳性克隆。在大肠杆菌中表达纳豆激酶原 ,经自体加工产生具有纤溶活性的纳豆激酶。结论　成功地构建了纳豆激酶原基因克隆 ,实现了在大肠杆菌中的表达。     

纳豆激酶原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 构建纳豆激酶原基因克隆，实现其在大肠杆菌中的表达。方法 从纳豆芽胞杆菌中分离纯化基因组ＤＮＡ，作为模板通过ＰＣＲ扩增纳豆激酶原基因。运用重组ＤＮＡ技术，构建表达质粒ｐＥＳＸ－１转化大肠杆菌ＪＦ１１２５，温度诱导表达目的蛋白。     

人白细胞介素31基因克隆及在大肠杆菌中的表达

人白细胞介素31(IL-31)是近年在”NatureImmunology”杂志上报道的新细胞因子,为一具有4个螺旋结构的单链分子,主要由激活的T细胞产生,基因定位于12q24.31,大小为904bp,开放阅读框495bp,编码一条由164个氨基酸残基组成的多肽链,成熟的IL-31分子含有141个氨基酸。生理状态下,IL-     

人白细胞介素15基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人白细胞介素（IL）15全长cDNA,并在大肠杆菌中表达。方法从人外周血分离的淋巴细胞中提取总RNA,通过RT—PCR扩增出hIL-15全长cDNA。构建到原核表达载体pET28a（＋）中,通过卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增,DNA测序正确后,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,扩增后IPTG诱导表达。通过SDS-PAEG及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。结果 成功构建人IL-15表达载体,并表达于大肠杆菌中。SDS—PAEG及Western-blot分析显示表达的融合蛋白分子量为16．1ku,与理论值相符。结论 获得了hIL-15融合蛋白,为hIL-15单克隆抗体的制备及其功能研究奠定了基础。     

结核杆菌Ag85B的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：通过结核杆菌Ag85B基因的克隆和在大肠杆菌表达的研究,探讨Ag85B蛋白作为候选疫苗用于结核免疫预防和治疗的可行性。方法：用PCR技术,扩增人结核杆菌Edman株Ag85B基因序列,并将扩增的DNA片段插入克隆质粒载体pUC18,用质粒酶谱和DNA充阢分析鉴定重组克隆。克隆的Ag85B基因插入原核表达质粒pBV220,构建重组Ag85B表达质粒,用SDS－PAGE和Western blot鉴定大肠杆菌表达的重组蛋白。结果：成功克隆了结核杆菌Ag85B基因,构建了Ag85B的原核表达载体,获得了高效表达菌株,目的蛋白的表达量达菌总蛋白的25％－30％。结论：获得了高效表达人结核杆菌Ag85B成熟蛋白的工程菌株,为Ag85B保护性抗原位点分析和新型结核疫苗的研制奠定了基础。