可注射性纳米材料与兔成骨细胞的生物相容性

目的:将可注射性纳米材料与兔成骨细胞复合构建可注射性组织工程骨,观察其体外实验的生物相容性.方法:取16周龄、体质量约1.5 kg的新西兰大耳白兔双股骨大转子部和胫骨干骺端骨髓4～5 mL,将传至第三代的骨髓基质干细胞以成骨条件培养基定向诱导培养,获取成骨细胞.将成骨细胞与可注射性纳米材料体外复合培养,用噻唑蓝法测定细胞活性,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,并行激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察.结果:可注射纳米材料组的成骨细胞保持正常的分裂增殖速度.可注射纳米材料组ALP活性值为2.135±0.085,对照组为2.141±0.107,两者差异无统计学意义(P＞0.05).激光共聚焦显微镜及扫描电镜可见,成骨细胞在可注射性纳米材料上可良好地增殖、生长,细胞的活性未受到材料的影响.结论:可注射性纳米人工骨具有良好的细胞相容性,可作为可注射性骨组织工程载体材料.     

不同比例共培养内皮细胞和成骨细胞的成骨及成血管效应

背景:近年来研究显示内皮细胞和成骨细胞共培养修复骨组织的过程中存在相互促进的作用。目的:观察不同比例下内皮细胞和成骨细胞共培养对其成血管和成骨作用的影响。方法:分离培养人脐静脉内皮细胞和成骨细胞MG63,内皮细胞和成骨细胞按照1:0,8:1,4:1,1:1,1:4,1:8,0:1在24孔板中进行共培养,内皮细胞和成骨细胞分别单纯单层培养作对照。在第7,14,21天时观察细胞生长状态、血管内皮生长因子表达水平及碱性磷酸酶活性。结果与结论:各组细胞在21d中生长良好,第14天1:8组可见成骨细胞开始集落式生长,第21天1:4组钙化染色结节要明显强于1:8组,而单纯成骨细胞组并未出现钙化结节。1:4组碱性磷酸酶含量在3个时间点均明显增高(P<0.05)且第7天时血管内皮生长因子开始增高,直到第21天时达到高峰。说明内皮细胞和成骨细胞共培养比例为4:1时,成血管作用较强,而比例为1:4时成骨作用更强。     

纳米晶胶原基骨材料在骨科疾病中的应用

目的:观察纳米晶胶原基骨材料(简称人工骨)植入后骨愈合的时间和骨修复效果,探讨人工骨在骨科临床的应用范围。方法:于2003-03/2005-03选择江苏大学附属医院骨科收治的骨折后骨缺损患者32例,骨不连患者5例,骨肿瘤患者4例,腰椎峡部裂患者4例。均符合本临床试验所制定的诊断标准,并经X射线片确诊,患者均知情同意。①骨折后骨缺损患者:均为四肢各部位粉碎性骨折,经切开复位后有骨缺损,采用人工骨植入骨缺损处。②骨不连患者:将骨折端瘢痕及硬化骨切除、髓腔打通后,植入人工骨。③良性骨肿瘤患者:将病骨刮除后植入人工骨。④腰椎峡部裂患者:在减压,RF复位、内固定后有2例行自体骨与人工骨混合植入,1例左侧行自体骨、右侧行人工骨植入,另1例在原来行自体骨植骨基础上因愈合欠牢固,而在原植骨处加植人工骨。结果:42例患者获得随访。①骨折后骨缺损患者29例,25例在术后2～7个月先后达临床愈合。另4例中,1例尺骨缺损植人工骨处术后2年尚无骨痂形成,术后2年9个月骨缺损处愈合;1例胫骨中上段粉碎骨折于术后15个月见原骨缺损植人工骨处骨痂形成不多。其余2例为术后过早负重,发生钢板断裂,给予重新手术复位、固定。②骨不连患者5例,有2例于术后9个月愈合,3例单纯植人工骨者未愈,其中2例再手术行自体骨移植,术后1年愈合。③良性骨肿瘤患者4例,骨囊肿2例术后未见复发。骨纤维结构不良2例,术后再次手术,改行自体骨移植。④腰椎峡部裂患者4例,3例术前腰腿痛症状消失,复查X射线片见原峡部断裂影消失。1例仍感下肢麻痛,复查X射线片见植骨愈合欠佳。结论:纳米晶胶原基骨材料具有良好的生物相容性及生物可降解性能,植入体内具有良好的骨传导作用,可用于四肢粉碎性骨折所致的骨缺损;因其不具备骨诱导成分,对于骨不连、良性骨肿瘤等所致骨缺损,宜将纳米晶胶原基骨材料和自体骨混合使用。     

纳米羟基磷灰石颗粒与成骨细胞相容性的研究

目的:将纳米羟基磷灰石颗粒(nano-hydroxyapatite,nHA)与体外培养的胎鼠颅顶骨源性成骨细胞共同培养,观察nHA与成骨细胞的相容情况及细胞形态。评价其细胞增殖性和细胞相容性。方法:将体外培养的胎鼠颅顶骨源性成骨细胞培养于标准培养基中,每个培养基中添加不同浓度的nHA颗粒,37.5℃、5%CO2孵箱内培养120 h。并以两个无添加物的培养基作为空白对照。分别在2、6、8、24、72、120 h测定成骨细胞的数量,并用透射电镜和倒置相差显微镜分别观察成骨细胞的形态和细胞显微结构。结果:实验1、2、3组在24、72、120 h时MTT吸光值与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。实验1、2、3组在2、6、8、24、72、120 h时成骨细胞数目与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。透射电镜观察结果显示,成骨细胞的细胞突中吸收了纳米颗粒。倒置相差显微镜观察结果显示,传代细胞在6 h内贴壁,细胞形态为长梭形、鳞片形、短梭形、圆形。结论:nHA材料具有很好的安全性和细胞相容性。     

脱细胞基质骨与成骨细胞和血管内皮细胞的生物相容性

目的:采用自行研制的脱细胞基质猪肋骨作为支架材料,复合兔成骨细胞和血管内皮细胞,对其生物相容性、抗原性和细胞毒性进行观察。方法:实验于2003-04/10在四川大学华西医院人类疾病生物治疗教育部重点实验室完成。用物理、化学方法制备脱细胞基质猪肋骨。体外培养兔成骨细胞、血管内皮细胞。而后将试验分成3组进行。①成骨细胞组:将成骨细胞与脱细胞基质骨材料复合。②血管内皮细胞组:血管内皮细胞与脱细胞基质骨材料复合。③成骨细胞 血管内皮细胞组:成骨细胞 血管内皮细胞与脱细胞基质骨材料复合。④对照组:单纯成骨细胞。于培养1,3,5,7d分别用倒置相差显微镜、组织学切片和扫描电镜观察脱细胞基质异种骨的生物相容性、抗原性;用流式细胞仪检测材料对细胞周期和DNA含量的影响,了解材料对细胞有无毒性的影响。结果:①脱细胞基质骨扫描电镜观察:脱细胞基质骨的骨小梁结构完整,骨陷窝空虚,未见细胞成分残留。②各组细胞的生长、分化和增殖情况倒置相差显微镜观察:3组细胞与脱细胞基质骨材料复合培养12h后,细胞在各组材料表面和孔隙内均可黏附和生长。③组织学观察:MASSON染色显示3组细胞在材料表面和孔隙内大量增殖,并分泌细胞外基质。以成骨细胞 血管内皮细胞组材料表面黏附的细胞数量最多。组织学切片染色显示,各组细胞沿材料边缘紧密附着,细胞与材料的组织相容性良好。④各组细胞黏附、生长、增殖和基质分泌情况扫描电镜观察:3组细胞与材料复合培养5d后,细胞紧密黏附在材料表面。成骨细胞呈梭形或多角形,相邻细胞间有突起相互连接。血管内皮细胞呈椭圆形,有角状突起,与材料附着紧密。其中,成骨细胞 血管内皮细胞组材料表面黏附大量细胞,并有较多胶原形成。血管内皮细胞组材料表面胶原形成很少。⑤细胞周期和DNA含量:成骨细胞 血管内皮细胞组1d,3dDNA合成期高于单独细胞组,无异倍体细胞。结论:脱细胞基质骨具有良好的生物相容性、极低的抗原性、无细胞毒性和致瘤性。成骨细胞与血管内皮细胞联合培养细胞在脱细胞基质异种骨中有很强的增殖潜力。     

可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨髓间充质干细胞促进骨缺损的修复

背景:可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料是清华大学利用仿生学原理制备的一种较理想的组织工程新型材料,经过前期体外实验证明其具有良好的生物相容性和骨传导性.目的:观察骨髓间充质干细胞复合可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖材料在促进骨缺损修复中的作用.方法:用梯度离心和贴壁培养法收集兔骨髓间充质干细胞,分离、培养至第3代,然后与纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合.24只新西兰大白兔双侧股骨外侧髁钻孔,制备骨缺损模型.所有兔右侧股骨外侧髁缺损以骨髓间充质干细胞-纳米羟基磷灰石/壳聚糖局部植入作为实验组,其中20只兔左侧股骨外侧髁缺损以单纯纳米羟基磷灰石植入治疗作为对照组,4只兔左侧股骨外侧髁缺损旷置为空白组,于第12周末,分别行大体、影像学观察、组织形态学、观察该复合材料对兔骨缺损的修复效果.结果与结论:术后12周实验组植入体已与骨缺损处骨性愈合,明显见新生骨生成,骨缺损能够完全修复,对照组骨缺损处部分修复,部分骨皮质不连续.空白组缺损区尚未见修复,纤维结缔组织填充.术后12周,实验组见骨形成细胞较多,材料内见新生骨小梁相互连接成片;对照组少量骨细胞形成,骨量少,部分纤维组织填充.空白组未见骨形成细胞,纤维组织较多.结果表明,骨髓间充质干细胞-纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料具有骨缺损修复能力,其疗效优于单纯纳米羟基磷灰石材料.     

低强度超声波体外促进成骨细胞与人工骨改建的实验研究

目的研究低强度超声波(LIUS)对体外培养的人成骨样细胞MG-63生物学特性的影响,同时观察LIUS对MG-63细胞在人工骨块上的附着的影响。方法分别利用MTT、细胞化学钙钴法检测被LIUS作用后的MG-63细胞的增殖和碱性磷酸酶(ALP)表达。采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,各组数值以均数±标准差(sx?)表示。采用Image pro-plus 6.0软件分析ALP表达情况;利用方差分析法检验组间差异的显著性。最后用扫描电镜观察MG-63细胞在人工骨块上的附着情况。结果超声作用3、7 d,MG-63细胞的增殖活力A值明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);且MG-63细胞胞质ALP的平均灰度值明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜下观察到通过作用了LIUS作用后的纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(n HAC/PLA)复合材料的孔隙内部可见大量MG-63细胞附着,细胞伸出伪足明显,并向四周伸展。结论 LIUS可以促进细胞增殖、增强细胞活性并可促进人成骨样MG-63细胞在纳米羟基磷灰石上的附着。     

可注射性硫酸钙/羟基磷灰石骨替代材料的性能研究

目的:探讨可注射性硫酸钙/羟基磷灰石骨替代材料的可行性。方法:用Gillmore双针法,万能力学测试机,注射器推注法测定含40%重量羟基磷灰石(HA)的α-半水硫酸钙与固化液欧乃派克混合后的凝固时间,抗压强度和可注射能力。结果:含40%重量HA的α-半水硫酸钙在37℃生理盐水条件下初凝时间和终凝时间分别为15和25 min,抗压强度为(10.7±0.6)MPa,可注射的平均时间为(5.8±0.4)min。结论:含40%重量HA的α-半水硫酸钙可以满足临床操作的要求,作为一种可注射性骨替代材料是可行的。     

兔脂肪间充质干细胞与纳米骨生物相容性的体外实验研究

目的：将兔脂肪间充质干细胞（ADMSCs）与纳米相羟基磷灰石胶原骨（NHAC）共同体外培养，观察其在体外的生物相容性。方法将兔ADMSCs与纳米相羟基磷灰石胶原骨共同体外培养，行倒置显微镜、激光共聚焦显微镜观察。结果兔ADMSCs在纳米相羟基磷灰石胶原骨上良好地生长，增殖。结论纳米相羟基磷灰石胶原骨有良好的生物相容性，可以作为骨组织工程理想的载体材料。初步构建了细胞纳米相羟基磷灰石胶原组织工程骨。     

纳米级羟基磷灰石/骨形态发生蛋白复合物修复兔桡骨大段缺损及局部血管内皮细胞生长因子的表达

背景:研究发现,在小段骨缺损中植入骨或仿生骨组织,坏死组织逐渐被替换,移植骨中会长入有活性的血管肉芽组织,移植骨被吸收,新骨主动形成.但在大段骨缺损,这一过程发生较慢且不完全.目的:观察纳米级羟基磷灰石材料复合骨形态发生蛋白后大段骨缺损修复能力及诱导生成血管能力.方法:制作兔桡骨大段骨缺损模型,抽签随机分2组,选择一侧分别植入纳米级羟基磷灰石/骨形态发生蛋白、纳米级羟基磷灰石修复,均以另一侧为空白对照.植入后6个月行大体观察、X射线、组织形态学检查、组织切片碱性磷酸酶染色、成骨量分析、血管内皮细胞生长因子阳性细胞率及阳性血管数检测.结果与结论:空白对照组基本无骨组织生成.纳米级羟基磷灰石植入后被新生骨组织分割成小块,材料原有结构破坏.纳米级羟基磷灰石/骨形态发生蛋白组较纳米级羟基磷灰石组残存材料更少,材料降解更为彻底.纳米级羟基磷灰石/骨形态发生蛋白组成骨量、血管内皮细胞生长因子表达及血管内皮细胞生长因子阳性血管数目均明显高于纳米级羟基磷灰石组(P < 0.001),且血管内皮细胞生长因子表达与血管内皮细胞生长因子阳性血管数目成正比关系.说明纳米级羟基磷灰石与骨形态发生蛋白复合后,骨修复能力进一步增强,诱导血管生成能力明显提高.     

兔骨髓间充质干细胞与羊膜的共培养

背景:近年来利用组织工程技术构建软骨以修复软骨缺损已经取得较大进步。骨髓间充质干细胞在软骨组织工程研究中作为一种常见的种子细胞被广泛应用。目的:以人羊膜作为细胞支架负载兔骨髓间充质干细胞,观察羊膜的生物相容性。方法:将兔骨髓间充质干细胞接种于人脱细胞羊膜上,体外共培养后进行形态学观察,以四甲基偶氮唑盐比色法观察骨髓间充质干细胞增殖活性,评价羊膜的组织相容性。应用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色法观察细胞存活和凋亡情况。结果与结论:骨髓间充质干细胞在羊膜上生长较好,细胞活力增强,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色结果示仅有少量细胞凋亡。提示羊膜是一种具有良好生物相容性的支架材料,可以促进骨髓间充质干细胞增殖。     

三种细胞因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化

背景:已证实血管内皮细胞种植于组织工程材料上在体内可增殖分化形成血管,但获取内皮细胞时创伤较大,且来源极其有限.目的:观察在血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1体外联合诱导下,兔骨髓间充质干细胞能否向血管内皮细胞分化.设计、时间及地点:2006-11/2007-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成的细胞对照观察.材料:清洁级8周龄日本大耳白兔1只用于骨髓间充质干细胞的分离培养.血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1均为Peprotech公司产品.方法:兔麻醉后抽取骨髓液,贴壁法 胰酶消化分离培养获得足够数量的骨髓间充质干细胞,分为两组,诱导组向含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入10μg/L血管内皮细胞生长因子、1μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L胰岛素样生长因子1,诱导2周.对照组单纯加入含10%胎牛血清的DMEM培养液.主要观察指标:对诱导后细胞进行形态观察、NO含量测定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色以及电镜观察Weibel-Palade小体形成情况.结果:诱导5d后细胞呈集落样分布,形态趋于圆形;未诱导细胞均匀散在分布,呈长梭形和三角形.诱导14d后,诱导组细胞培养上清液中NO含量明显高于对照组(t=3.75, P<0.05).诱导组表达血管内皮细胞特有表面标志Ⅷ因子,超微结构可见Weibel-Palade小体;对照组Ⅷ因子相关抗原呈阴性表达.结论:兔骨髓间充质干细胞经上述3种细胞因子体外联合诱导后,可向血管内皮细胞方向分化.     

可吸收性珊瑚羟基磷灰石与人骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞复合培养及碱性成纤维细胞生长因子的作用

目的:观察人骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞与珊瑚羟基磷灰石的相容性及碱性成纤维细胞生长因子的作用。方法:实验于2003-02/2005-10在大连医科大学附属第一医院中心实验室及上海第二医科大学完成。实验材料:①可吸收性珊瑚羟基磷灰石。②人骨髓间充质干细胞:取自单纯性骨囊肿行自体骨髓注射治疗的患者(年龄10～16岁,平均14.5岁),患者均知情同意。实验分组:使用含地塞米松、β甘油磷酸钠和抗坏血酸的条件培养基诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,与珊瑚羟基磷灰石复合培养,分为实验组(RPMI1640完全培养液 成骨细胞 可吸收性珊瑚羟基磷灰石),促增殖组(完全培养液 成骨细胞 可吸收性珊瑚羟基磷灰石 10μg/L碱性成纤维细胞生长因子),正常培养组(完全培养液 同等数量的成骨细胞)。实验评估:①采用扫描电镜观察成骨细胞与可吸收性珊瑚羟基磷灰石复合培养6h,1,3,7d时细胞形态。②成骨细胞附着于材料表面后生长增殖特性:于接种后24h,各组均取6孔细胞用胰蛋白酶消化贴壁细胞,包括材料上贴附的细胞,计数孔内细胞数及平均细胞数,绘制细胞生长曲线。③成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性的测定:于接种后1,3,5,7d采用酶联免疫监测仪测410nm波长的吸光度值,计算每1000个细胞的吸光度值。结果:①成骨细胞与可吸收性珊瑚羟基磷灰石复合培养后细胞形态:复合培养6h,细胞多为单层结构,形态多样,有数个突起;复合培养1d,成骨细胞附着于可吸收性珊瑚羟基磷灰石表面并深入到材料的孔隙内,与材料牢固结合,并在材料表面伸展,细胞表面可见大量微绒毛;复合培养7d,细胞数量增多,可见少量胞体表面及细胞间有颗粒状钙盐结晶沉积,细胞形态无明显差异。②成骨细胞附着于材料表面后生长增殖特性:实验组细胞接种后,随时间延长数量逐渐增加,仍可保持正常的分裂增殖速度,与正常培养组相比差异无显著性意义(P>0.05)。复合培养4,5,6,7d后促增殖组细胞附着载体后数量增长明显高于实验组、正常培养组,差异均有显著性意义(P<0.05)。③成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性的测定:随着培养时间的增加,3组细胞碱性磷酸酶含量(每1000个细胞的平均吸光度值)均逐渐增高(以实验组为例,复合培养1,3,5,7d分别为0.0121±0.0014,0.0154±0.0013,0.0172±0.0012,0.0183±0.0015),差异无显著性意义(P>0.05)。结论:①人骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞可以在一定的生物载体上正常生长、增殖,并保持生理功能。②10μg/L碱性成纤维细胞生长因子可促进此过程中细胞增殖。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化

目的：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体，因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点，是近年研究的热点。实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法，并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能。 方法：实验于2006-08/2007—06在吉林大学药学院生物工程实验室完成，实验室属吉林大学重点实验室。①实验材料：四五月龄新西兰大白兔2只，由吉林大学基础医学院动物培养中心提供，体质量1．0～1．5kg，雌雄不限，实验动物级别为二级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养，以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞的形态特征，并利甩成骨诱导剂包括0．1μmol／L的地塞米松、50mg/L的维生素C、10mmol／L β-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10％FBS的L．DMEM、0．25μmol／L地塞米松、50μmol／L吲哚美辛、0．5mmol／LIBMX、10mg／L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化。 结果：①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形，类似于成纤维细胞，骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44，而CD34、CD45均阴性表达。②成骨诱导14d后细胞不明显，未形成钙结节，21d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色。③成脂诱导48h后，细胞内有小脂滴出现，2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞（有）由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉积。 结论密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法，骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分?     

富血小板血浆诱导兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景:对于骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化,目前大多存在诱导物价格昂贵、制备困难或细胞培养周期长、成骨能力低等缺点,近年研究发现浓缩血小板中存在的生长因子有诱导骨再生的作用.目的:观察富血小板血浆对体外培养兔骨髓基质干细胞的增殖和成骨细胞分化作用.方法:从8只兔双侧股骨大转子抽取骨髓,体外分离培养兔骨髓基质干细胞,传至第3代分为两组,实验组用含1%富血小板血浆的DMEM进行干预,对照组加入普通DMEM条件培养液.结果与结论:倒置显微镜下,原代培养细胞24～36 h后开始贴壁,10～12 d细胞融合成单层.实验组细胞培养第2天已贴壁,第6天细胞大部分融合;对照组细胞形态学变化较实验组晚出现1～3 d.培养第2,6,10,14天,碱性磷酸酶活性测定和茜素红钙结节染色结果显示,体外培养的兔成骨细胞生长良好,生化指标稳定,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,证实富血小板血浆能促进体外培养的兔骨髓基质干细胞增殖,并能促使其向成骨细胞分化.     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化

目的:骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体,因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点,是近年研究的热点.实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法,并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能.方法: 实验于2006-08/2007-06在吉林大学药学院生物工程实验室完成, 实验室属吉林大学重点实验室.①实验材料:四五月龄新西兰大白兔2只, 由吉林大学基础医学院动物培养中心提供, 体质量1.0～1.5 kg, 雌雄不限, 实验动物级别为二级, 实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态特征,并利用成骨诱导剂包括0.1 μmol/L的地塞米松、50 mg/L的维生素C、10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10?S的L-DMEM、0.25 μmol/L地塞米松、50 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化.结果:①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,类似于成纤维细胞,骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44,而CD34、CD45均阴性表达.②成骨诱导14 d后细胞不明显,未形成钙结节,21 d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色.③成脂诱导48 h后,细胞内有小脂滴出现,2周后脂滴数量增加并相互融合,细胞(有)由长梭形变为圆形或多边形,油红O染色显示有大量脂质沉积.结论:密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法,骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景：细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段。目的：通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化。方法：取已自然退变的第6代髓核细胞与生长良好的第4代骨髓间充质干细胞按不同比例（75：25,50：50和25：75）体外共培养7d,单独髓核细胞（100：0）与单独骨髓间充质干细胞（0：100）分别作为阳性对照和阴性对照。结果与结论：RT-PCR检测显示共培养组（75：25和50：50）蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组（100：0）,吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组（75：25和50：50）胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组（100：0）。共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多。提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换。     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景:细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段.目的:通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化.方法:取已自然退变的第6 代髓核细胞与生长良好的第4 代骨髓间充质干细胞按不同比例(75∶25,50∶50 和25∶75)体外共培养7 d,单独髓核细胞(100∶0)与单独骨髓间充质干细胞(0∶100)分别作为阳性对照和阴性对照.结果与结论:RT-PCR 检测显示共培养组(75∶25 和50∶50)蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组(100∶0),吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组(75∶25 和50∶50)胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组(100∶0).共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多.提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换.     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;诱导7d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义（P〈0.05）,第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。