鼠疫菌毒力基因研究进展

鼠疫菌毒力基因研究进展俞东征（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所，北京市１０２２０６）１Ｆ１抗原及其基因表达在鼠疫耶尔森氏菌的抗原中，Ｆ１抗原具有极为重要的意义，它不仅是鼠疫菌中最早发现的抗原，也是最主要的保护性抗原，而且它对于鼠疫菌具有非常高...     

鼠疫菌特异基因的克隆表达和抗原性分析

目的 在大肠埃希菌中克隆表达鼠疫菌特异基因(YPO1089.pst、ymt),分析重组蛋白的抗原性.方法 利用PCR技术扩增目的 基因,PCR产物经纯化、双酶切后,与质粒载体pET-30a(+)相连接并转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞.经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达目标蛋白,并进行10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白免疫印迹分析其特异性,最后采用亲和层析法纯化诱导表达的融合蛋白.结果 成功构建了pET-YPO1089、pET-pst和pET-ymt 3个重组表达质粒,经优化诱导表达条件,重组的rYP01089、rPst和rYmt在大肠埃希菌中均得到了稳定高效地表达;免疫印迹结果表明重组的rPst可与鼠疫阳性血清发生特异性的免疫反应;目标蛋白经纯化后纯度可达95%以上.结论 鼠疫菌的特异性抗原能够在原核蛋白表达系统中获得高效表达,rPst具有敏感且特异的免疫学特性,实验结果为开发新型鼠疫诊断试剂奠定了基础.     

鼠疫耶尔森氏菌LcrV基因的克隆与表达研究

目的研究鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)保护性抗原V蛋白的生物学活性,进而研究Y.pestis的致病机理.方法采用PCR方法,从Y.pestis菌种中扩增出LcrV基因片段,进行鉴定后,然后将该片段克隆于原核表达载体pBV220,构建成重组质粒pBV/LcrV,进行温控诱导表达.结果(1)获得长约980bp的PCR片段,序列分析结果与已知LcrV序列相同.(2)SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量38×103处有表达条带.(3)经薄层扫描分析,目的蛋白条带占全菌蛋白的38.4%.(4)表达后菌体超声破碎后,目的蛋白主要存在于上清中.结论获得了LcrV基因,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达产物主要以可溶状态存在.     

应用标识基因检测鼠疫菌的研究

英国Sanger研究中心、美国Wisconsin大学和我国分别于2001,2002和2004年完成了鼠疫耶尔森氏菌CO92,KIM,91001的全基因组序列测定工作[1～3],这有助于研究鼠疫菌的进化过程,为寻找新的检测手段提供了便利研究条件.聚合酶链反应(PCR)自1985年发明至今,经过不断开发和改进,现已经广泛应用在诸多领域,是分子生物学、临床诊断、法医检验实验室的常规技术.我们采用我国91001菌株序列上YPO2088标识基因(编码甲基化转移酶)[4],对150份样本进行PCR扩增,现将结果报道如下.     

鼠疫耶尔森菌特异基因扩增引物应用于鼠疫菌的鉴定研究

目的研究一种快速鉴定鼠疫菌的PCR方法。方法选用针对鼠疫菌特异序列的6对引物进行PCR扩增,以其它近缘的肠道致病菌做对照,并测序比较鉴定。结果鼠疫菌均能扩出预期产物,而其他近缘的肠道致病菌菌株均不能扩出预期产物。结论这些引物具有较高的特异性,可迅速、有效地鉴定鼠疫菌,并与其它近缘的肠道致病菌相鉴别。     

类Orientalis鼠疫耶尔森氏菌的基因分型及鼠疫大流行

在过去的1500年中，共发生过三次鼠疫大流行，鼠疫耶尔森氏菌引起了其中的第三次大流行。鼠疫耶尔森氏菌的DNA也在第二次大流行中人类的遗骸中发现。鼠疫耶尔森氏菌的Antiqua生物型可能引起了第一次大流行，其他的2种生物型，即Medievalis和Orientalis可能分别引起第二次和第三次大流行。为了验证这种假说，我们设计了一种称作“多间隔区(指基因组内已知基因间的DNA序列)分型法”的原始基因分型系统，该系统的原理是测量基因间间隔区的DNA序列。当多间隔区分型法用于分析可能死于第一次及     

鼠疫耶尔森氏菌染色体上重要致病相关基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中表达鼠疫耶尔森氏菌染色体编码的重要致病相关基因。方法 运用生物信息学技术对鼠疫耶尔森氏菌基因组序列信息进行分析，选定了18个与病原菌粘附、侵袭宿主细胞相关的基因为克隆与表达的目的基因。通过PCR和TA克隆技术从鼠疫耶尔森氏菌基因组中克隆了这些目的基因。上述目的基因经双酶切回收后，分别导入原核表达载体pET32a中，转化大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Westernblot检测蛋白表达。结果 共获得14个可经IPTG诱导的高表达的重组转化子菌株。结论 上述重组转化子菌株表达的融合蛋白经进一步纯化可进行宿主感染鼠疫耶尔森氏菌后免疫应答的研究及抗体表达谱变化的研究。这些研究不仅对于鼠疫耶尔森氏菌致病机理的研究有意义，而且在鼠疫疫苗的研制上有重要价值。     

从基因水平看鼠疫菌的侵袭致病性

目的：阐述鼠疫菌的侵袭致病性。方法：从自然界生物进化的角度，分析鼠疫菌致病基因表达受环境因素调节，成功实现在宿主(包括侵入皮下组织和进一步扩散到深层组织)和蚤体内的寄生。结果：环境因素调节鼠疫菌基因的表达和致病性，结论：在其生命循环过程中，与环境相适应的基因表达促进了致病性。     

我国鼠疫菌抗链霉素基因的监测

目的了解全国鼠疫菌分离株是否存在抗链霉素基因。方法根据Guiyoule等人在EMBL公布的抗链霉素相关基因,设计2对引物,对271株代表性鼠疫菌进行PCR扩增。结果实验用271株代表性菌株中尚未发现有鼠疫菌抗链霉素基因。结论目前在所实验的271株菌株还未发现鼠疫菌耐链霉素菌株。     

鼠疫菌几种毒力因子表达的基因调控研究进展

众所周知,鼠疫菌毒力因子有荚膜抗原（Ｆｒａｌ）、低钙反应（Ｌｃｒ）、色素沉着（Ｐｇｍ）和鼠疫菌素Ｉ（ＰｓｔＩ）。关于这几种毒力因子表达的基因调控近几年来许多研究者进行了大量研究,因为鼠疫菌素Ｉ已有专题文章论述,本文对前３种毒力因于表达的基因调控的研究进展综述如下。１Ｆｌ抗原表达的基因调控 现在认为,编码ＦＩ抗原的基因是多拷贝的原因,在鼠疫菌最大的一个质粒和染色体上都有分布。ＦＩ抗原的基因在鼠疫菌的基因组中是相对独立的结构,它的结构基因与调控基因紧密相邻,可以包括在一个克隆子中。 最近,已经查明这一…     

鼠疫菌36Mdal质粒的发现及鉴定

云南省瑞丽县的一株鼠疫菌,除具有已知的6、45和65Mdal三种质粒外,尚可检出另外一种36Mdal质粒。     

多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

鼠疫耶尔森氏菌inv基因中IS1541的研究及应用

目的　了解鼠疫耶尔森氏菌 inv基因中 IS15 41的插入情况 ,为鼠疫耶尔森氏菌的鉴别诊断提供依据。方法　 PCR反应及 Southern杂交分析。结果　对来自不同疫源地的 5 0株鼠疫耶尔森氏菌的 inv基因中部分序列进行扩增 ,均可扩出一条长为 10 0 0 bp的片段 ,用 IS15 41作探针 ,对其进行 Southern杂交分析 ,杂交结果无差别 ,而对照菌株除假结核耶尔森氏菌扩出一条长约 30 0 bp左右的片段外 ,其它均为阴性。结论　鼠疫耶尔森氏菌 inv基因高度同源 ,其间均有 IS15 41插入 ;该方法有助于鼠疫耶尔森氏菌与其它菌株的鉴别诊断     

用鼠疫噬菌体诱导鼠疫菌L型的研究

用噬菌体成功的诱导成鼠疫菌L型。通过回复性试验可长出正常鼠疫菌。同时用噬菌体裂解试验、生化反应、细胞壁染色等方法验证,所获鼠疫菌L型无细胞壁或残缺不全。这对进一步研究鼠疫流行病学和鼠疫菌保存机理有一定意义。     

用UDPE技术检测和鉴定鼠疫耶尔森氏菌

我们建立了用ＵＤＧ（尿嘧啶糖基化酶）防ＰＣＲ产物污染,以两个不同基因为靶序列扩增检测同一病原菌和用微孔板杂交－酶联显色检测ＰＣＲ产物的ＵＤＰＥ（ＵＤＥ－ＤｕｐｌｅｘＰＣＲ－ＥＩＡ）技术并用于鼠疫耶尔森氏菌的检测与鉴定。结果表明,该系统可以特异地检测和鉴定鼠疫耶尔森菌,检测灵敏度可以达到１ＣＦＵ／ｍｌ。     

鼠疫菌耐药性研究进展及现状

抗生素是治疗鼠疫的首要治疗方法,首选药物为链霉素,但过度使用抗生素会引起细菌产生耐药性。我国自20世纪开始研究鼠疫菌耐药性,逐渐发现了抗生素敏感性下降的现象,直至2021年我国首次发现鼠疫菌对链霉素的耐药菌株,提出了鼠疫菌耐药的新机制,促使我国鼠疫菌耐药性监测任务成为重中之重。本文阐述了国内外鼠疫菌耐药性的研究进展,以及我国近些年鼠疫菌耐药基因的研究情况,为鼠疫菌耐药性监测及鼠疫临床治疗提供技术支持。     

鼠疫菌fra基因探针的研究

利用ＰＣＲ的方法，由鼠疫菌的ＤＮＡ中扩增获得了单一的，长２４９ｂｐ的基因片段。这一反应的特异性良好，可以作为鼠疫菌的一种鉴定标志。将这一片段地高辛标记制成探针，与国外已经试用过的，来自９．５ｋｂ质粒的９００ｂｐ探针相比较，表明该探针的特异性优良，可用于鼠疫的监测与对鼠疫菌分子生物学的进一步研究。     

YopB：鉴定鼠疫菌的工具

耶尔森菌属中可感染人类的细菌包括鼠疫菌、小肠结肠炎菌和假结核菌。鼠疫菌是导致鼠疫的原因,通过跳蚤传播。本研究旨在制定一个鼠疫菌特异的针对yopB基因的聚合酶链式反应（PCR）检验方法,且对鼠疫菌检测或分型均特异的免疫测定实验方法。用于本实验的菌株是来自1994年鼠疫爆发地区和德干高原鼠疫监测区的病人和啮齿动物样本。通过培养物的碱裂解法获取质粒DNA。用DNASIS软件,用全部的70kb／低钙反应位点质粒序列来设计鼠疫菌特异yopB基因的引物。