兔抗人NDR2高效价抗血清的制备、纯化及鉴定

目的 制备高效价的NDR2抗体。方法 构建pRset-A-ndr2,pGEX-4T-1-ndr2-a和pGEX-4T-1-ndr2-b三种重组表达质粒，并分别在大肠杆菌中导表达相应的融合蛋白；用全长GST－NDR2蛋白免疫兔，然后用GST－NDR2－A和GST－NDR2－B片段加强免疫；对包涵体形式表达的6His-NDR2进行初步的纯化；利用固定于硝酸纤维素膜上的NDR2抗原亲和吸附纯化抗血清。结果 经免疫得到了高效价的兔抗人NDR2多克隆抗血清，亲和纯化提高了NDR2抗体的特异性；免疫组化表明NDR2是一种胞浆蛋白。结论 用全长NDR2蛋白免疫兔，再用片段加强免疫，可以提高蛋白的抗原性，制备得到高效价的抗体。纯化后的特异性NDR2抗体，为进一步研究NDR2的功能打下了必要的基础。     

人睾丸前列腺素D合成酶的原核表达

目的：将获得纯化的重组人睾丸前列腺素D合成酶（L－PGDS）用于基础和临床研究,方法：在原核表达系统中,用异丙基-β-D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组质粒pGEX-2T／htL-PGDS的表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和并纯化重组融合蛋白GST／htL-PGDS,再用凝血酶裂解融合蛋白,从而获得纯化的重组L－PGDS。对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序,并对重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析,鉴定其是否为所需目的蛋白。结果：用IPTG诱导重组质粒pGEX-2T／htL-PGDS表达的最佳浓度为1mmol/L最佳时间为4h。在此基础上获得的融合蛋白用凝血酶裂解后获得单一纯化的重组蛋白L-PGDS,最佳裂解时间为2h。SDS－PAGE和DNA测序证实,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白,结论：用上述方法可获得纯化的人睾丸L－PGDS。     

小鼠金属硫蛋白—Ⅰ在大肠杆菌中的表达与分离纯化

目的：在大肠杆菌中表达小鼠金属硫蛋白－Ⅰ，并研究其分子结构和生物学功能。方法：将小鼠金属硫蛋白－Ⅰ基因克隆入融合表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌BL21，得到含重组表达质粒pGMA的工程菌。结果：经IPTG诱导，表达出分子量约为33KD的融合蛋白。然后经Glutathione-Sepharose4B亲和纯化后，用凝血酶切除GST部分。经SephacrylS-100过滤纯化，得到结合有Cd^2 的小鼠金属硫蛋白－Ⅰ。产率约为3mg/L培养液。结论：成功制备了表达MT的工程菌。     

用亲和层析法纯化人精浆蛋白

【目的】用亲和层析法从增生的前列腺组织中纯化人精浆蛋白(-γseminoprotein,-γsm)。【方法】采用超声波粉碎、NP-40提取与两种免疫亲和层析相结合[抗人精浆蛋白单抗(E4B7mAb)亲和层析和蛋白A亲和层析]的新提纯方案,获得了高纯度-γsm抗原。【结果】所纯化的-γsm蛋白经ELISA双抗夹心法和免疫印迹分析检测证明,用此法从增生的前列腺组织中分离到-γsm抗原,而且纯化的-γsm具有生物活性。【结论】这种方法的建立将为分离-γsm抗原提供一种有效途径,为抗精浆蛋白基因工程抗体的研究提供良好的抗原保证。     

抗人γ—精浆蛋白VH单域抗体基因的构建表达及空间构象分析

目的 扩增出抗人γ－精浆蛋白（γ－Sm）单克隆抗体（mAb）的重链可变区（VH）单域抗体基因,并进行原核表达及空间构象分析。方法 从分泌抗γ－Sm mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经RT－PCR扩增VH单域抗体基因,将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX－4T－1中进行表达,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果 VH单域抗体基因全长363bp,含起始码和终止码。将其克隆到pGEX－4T－1内,转化大肠杆菌DH5α,获得高效表达,表达量占全菌总蛋白质的38％,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后,用谷胱甘肽（GST）亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗γ－SmVH单域抗体。竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论 构建成功抗γ－Sm的VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

一步亲和纯化制备基因工程人源抗HBs单克隆抗体Fab片段

目的：探索亲和纯化人源单克隆抗体片段的简便实用方法。方法：应用自制的抗人免疫球蛋白片段抗体（Ａｎｔｉ－Ｆａｂ）与链球菌蛋白Ｇ亲和胶（Ｇａｍｍａ Ｂｉｎｄ）交联制备亲和层析柱,用一步法从工程菌培养上清中纯化人源抗ＨＢｓ单克隆Ｆａｂ片段。经依沙吖啶沉淀、离子交换、分子筛纯化人混合血清提取ＩｇＧ组分,木瓜酶处理后分离,纯化出Ｆａｂ,免疫绵羊制备高效价抗表。用Ｇａｍｍａ Ｂｉｎｄ一步纯化出抗血清中的ＩｇＧ     

PTI-1表达载体构建及在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的：构建表达人前列腺癌诱导基因1（PTI－1）蛋白的重组质粒，在大肠杆菌中诱导高效表达并纯化。方法：应用亚克隆PTI－1基因的pUC19/PTI-1质粒，重新构建表达载体PTI－1／pGEX4T-1，酶谱分析鉴定出正确的重组质粒，诱导表达，进行SDS－PAGE分析，应用GSH树脂纯化表达产物。结果：筛选出5个与pGEX4T-1正向重组质粒，其中一株表达一个Mr为69000的新蛋白，并以包涵体的形式存在，蛋白在宿主菌中高效表达，表达量为43．2％，纯化蛋白得到纯度为79．72％的GST／PTI－1融合表达高效表达及纯化的成功使简便获得前列腺癌诱导蛋白成为可能。     

NAD—Sepharose6MB亲和胶的制备及在2,5—二酮基—D—葡萄糖？…

目的：制备ＮＡＤ亲和胶,用于分离纯化２,５－二酮基－Ｄ－葡萄糖酸还原酶,方法：将ＮＡＤ通过丁二酸二酰肼与溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＭＢ胶联结,制香ＮＡＤ亲和胶,从棒杆菌细胞中取的２,５－二酮基－Ｄ－葡萄糖酸还原酶粗酶液用ＮＡＤ亲和胶进行亲和层析纯化。结果：ＮＡＤ的结合率为７１．６７％;亲和层析回收率为７７．２７％;酶的比活提高了１．１倍。结论：以ＮＡＤ为配基的亲和胶用于纯化以ＮＡＤＰＨ为辅酶     

酪酸对大鼠成骨细胞系中骨唾液酸蛋白转录的作用

目的：研究酪酸调节大鼠成骨细胞系（ ROS17／2.8）中骨唾液酸蛋白（ BSP ）转录的作用机制。方法使用能生成BSP的大鼠成骨细胞系（ROS17／2.8）,分为试验组和对照组。试验组首先加入无血清α－基本必须培养基（α－MEM）配制的（10－8～10－2）mol／L浓度梯度的酪酸12 h,确定最优刺激浓度为10－4 mol／L,然后使用10－4 mol／L的酪酸作用于ROS17／2．8细胞3、6、12 h,对照组加入等量不含酪酸的无血清α－MEM。用Northern杂交试验检测BSP mRNA的表达;用瞬时转染方法检测BSP启动子的转录活性变化;用凝胶迁移实验验证酪酸对核蛋白与相关基因区段结合的作用。结果酪酸作用ROS17／2.8细胞12 h后BSP mRNA的表达水平升高。酪酸对BSP基因启动子转录活性的上调作用主要通过启动子pLUC3（－116～＋60）中的纤维母细胞生长因子2响应区段（ FRE）,在凝胶迁移试验中,酪酸促进了FRE片段与相应核蛋白的结合。结论酪酸通过BSP启动子中的FRE片段增强BSP基因的转录,从而在成骨早期增强成骨细胞活性。     

钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的制备与活性测定

目的：从牛心肌中提取纯化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ),并测定其活性。方法：采用DEAE-cellulose柱层析和Sepharose 4B亲和层析分离纯化蛋白,用γ－^32P掺入法测定CaMKⅡ及自磷酸化的CaMKⅡ活性。结果：从牛心肌中提取到钙调蛋白结合的蛋白组分,纯化后得到的CaMKⅡ比较稳定,产量也较高,此过程比较简单,适合大量制备,经SDS-PAGE检测,发现酶提取物均质,酶亚基的目的蛋白带相对分子质量为56000。在syntide-2为底物的反应中,纯化的CaMKⅡ的特异性酶活性为7．84pmol.min^-1.mg^-1。CaMKⅡ可自磷酸化,经过自磷酸化的酶在Ca2 和钙调蛋白不存在时也保持活性。结论：通过凝胶层析与亲和层析可提纯CaMKⅡ。     

猪血浆FN的分离及其性质鉴定

本文用明胶和肝素亲和层析柱等方法,从猪血浆中分离得到大量(0.5mg/ml)的纤维粘连蛋白(FN)。此FN在琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一条带,分子量约450000;巯基乙醇还原后呈现分子量约230000的两条带;可以与抗人和抗牛血浆FN抗体发生免疫沉淀反应;并具有强烈促CHO细胞贴壁活性。提示猪血浆是一种分离提取FN的良好资源。     

男性少弱精子症患者精浆锌含量分析

目的 探讨精浆锌含量对精液质量的影响。方法采用化学比色定量检测法对144例少弱精患者进行精浆锌含量检测,根据精浆锌的含量分为低锌组和锌含量正常组,比较两组患者精液的量、精子密度、精子活率和精子活动率（A＋B）。结果两组患者精液的量、精子活率、精子密度和精子活动率比较在统计学上均有显著性差异（P〈0．05）。结论精浆锌含量可影响男性的精液质量,而且半数以上的男性少弱精患者精浆锌的含量低于正常,故应对不孕的男性少弱精患者在常规治疗的同时适量补充锌制剂,以提高受孕率。     

特异性血管生成抑制素的制备及其抑制血管生成作用

目的：从血浆中纯化制备有特异抑制血管生成活性的天然ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ蛋白,为研究和应用要下基础,方法：制备Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ偶联的的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱,从血浆中纯化纤溶酶原用弹性蛋白酶在体外进行有限消化,再经Ｌ－ｌｙｓｉｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化获得天然ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ片段,通过体外血管内皮细胞生长抑制分析和体内鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验测定纯化蛋白活性。结果：以     

多粘蛋白的分离及其与纤粘蛋白的比较

用明胶、肝素和精氨酸亲和柱等从猪血浆中分离得到一明胶亲和蛋白Polynectin(PN)。此蛋白与精氨酸的亲和性很高,借此与FN分开,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,PN的分子量为450 000,由多个相同的小亚基连接形成。免疫双扩散和ELISA结果表明,PN与FN之间无免疫交叉反应,PN只存在于猪血中,人及其它动物(牛、羊,小鼠和大鼠)血中无PN。PN不具有促中国地鼠卵巢(CHO)细胞贴壁活性。提示PN是一种不同于FN的大分子糖蛋白。此外,用无PN的FN免疫兔,制得高效价FN抗血清(1:32),并进一步纯化制得亲和层析纯FN抗体.     

男性不育者精浆及精子乳酸脱氢酶活性的研究

目的探讨男性不育症患者精浆及精子中乳酸脱氢酶同工酶X（LDH-X）活性,分析乳酸脱氢酶同工酶活性与男性不育的关系。方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、全谱酶联染色等方法检测精浆及精子中的LDH-X活性并计算其比值;按照WHO人类精液实验室手册要求对精液进行常规分析。结果 124例不育组精浆LDH-X活性（827.3±46.8）U/L与60例生育组LDH-X活性（616.1±22.4）U/L比较,差异有统计学意义（P〈0.01）,不育组精子LDH-X的活性（8.45±3.62）mU/106小于生育组（16.1±10.6）mU/106,差异有统计学意义（P〈0.01）。两组的精浆及精子中LDH-X的比值比较,差异有统计学意义（P〈0.01）。两组的精液密度、精子活动率及精子活力无统计学差异。结论精浆及精子LDH-X活性检测能够反应精子的质量、生育功能以及对受精过程的预期,对选择辅助生育的方法有指导意义。     

用免疫化学分析仪测定正常人精液中p30的含量

本文报道在贝克曼免疫化学系统分析仪上,用抗p30血清,测定108份正常人精液中p30的含量,测得其含量范围为0.2996～4.3913mg/ml。经平方根变换,统计分析:偏度系数G_1=0.0237,峰度系数G_2=-0.8854,呈平方根正态分布。均数为1.6236mg/ml,标准差为0.1641mg/ml。     

人钠/二羧基转运蛋白2融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的：观测和鉴定人钠／二羧基转运蛋白2(hSDCT2)在大肠杆菌中的表达，并分离、纯化其蛋白产物。方法：应用：DNA重组技术，构建重组表达质粒pGEX-hSDCT2；IPTG诱导其表达。采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B亲和层析纯化GST-hSDCT2，经Factor Xa酶切和二次亲和层析后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting进行鉴定。结果：成功构建hSDCT2基因融合蛋白载体，SDS-PAGE及Western Blotting显示GST-hSDCT2融合蛋白表达于原核细胞，蛋白产量约占菌体总蛋白量的25％。经酶切及二次纯化后，获得纯化的hSDCT2蛋白。结论：人钠／二羧基转运蛋白2可在大肠杆菌中稳定表达。     

人类精浆及小鼠精子诱导免疫抑制效应的研究

我们用凝胶过滤获得部分纯品后发现,在体外能抑制人PBL的NK-A;小鼠静脉注入也有明显抑制效应。为模拟同性恋活动。肛门灌注精浆及其抑制因子和小鼠精子后,其抑制效应更明显。对上述免疫抑制效应与AIDS易感性的可能关系作了简要讨论。     

人血浆中MBL-MASP复合物的纯化与分离

目的从人血浆中分离纯化甘露聚糖结合凝集素(MBL)和MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASP)。方法用非活化Sepharose 4B两步亲和层析纯化MBL-MASP复合物．再以Sephacryl S-300柱凝胶过滤将MBL和MASP分离。在纯化MBL—MASP复合物的整个过程中，除凝胶过滤缓冲液外，均加入丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟(PMSF)和金属蛋白酶抑制剂1．10-邻二氮杂菲(1，10-phenanthroline)．并控制温度在4℃。结果获得高度纯化的MBL和酶原形式的MASP。SDS—PAGE和Western blotting表明所纯化的MBL相对分子质量为28000和32000肽链构成的功能性多聚体；配体结合测定和酵母菌凝集试验证实所纯化的MBL具有生物学活性：结论建立了一种比较简便的同时分离纯化MBL和MASP酶原的方法。     

精液pH值与精液参数及精浆生化的相关性研究

目的探讨精液pH值与精液参数及精浆生化之间的相关性,明确精液pH值在精液质量检测中所具有的价值。方法收集河南省中医院中西医结合生殖中心2009年1月-2011年3月资料完整的男性不育症患者精液分析及精浆生化记录616份,建立Excel数据库,采用SPSS 16.0统计软件,对精液pH值与精液参数及精浆生化进行相关性分析。结果精液pH值和受试者精浆弹性蛋白酶、精液A级精子百分率、前向运动精子百分率及存活精子百分率呈正相关性(P<0.05);与精浆酸性磷酸酶、精浆锌呈负相关性(P<0.05);与年龄、精浆果糖、精浆α-糖苷酶、精液白细胞、精液量、液化时间、精子浓度、正常形态精子数量无明显相关性(P>0.05)。结论精液pH值和精液参数及精浆生化的多项数值均具有相关性,进一步研究精液pH值的影响,对于男性不育症患者的诊疗具有重要意义。