构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验

目的：构建携带人血管内皮细胞生长因子121cDNA的腺病毒表达载体，探讨应用血管内皮细胞生长因子基因治疗缺血性疾患的可行性。方法：实验于2003—05／2004—02于解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室（创伤烧伤复合伤国家重点实验室）完成。穿梭质粒pDC315和Ad5腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE1，3Cre由解放军第三军医大学免疫学教研室邹强博士惠赠。pUC18-血管内皮细胞生长因子由第三军医大学高原医学教研室惠赠。BamH I，Xba I，NcoI DNA限制性内切酶均购自Takara公司；鼠抗人血管内皮细胞生长因子121单克隆抗体购自ROCHE公司；用双酶切法将pUC18-人血管内皮细胞生长因子121质粒中的人血管内皮细胞生长因子121cDNA克隆到穿梭质粒pDC315中，与腺病毒质粒pBHGloxdehaE1，3Cre共同转染293细胞并反复扩增，构建携带目的基因的重组腺病毒，并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NTH3T3细胞，用免疫组化方法检测人血管内皮细胞生长因子121在NTH3T3细胞中的表达。结果：（1）重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121的鉴定：重组质粒经XbaI和NcoI酶切后，得到酶切片段长度为651bp的正向连接重组质粒。测序结果也证实作者重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121序列正确。（2）Ad-血管内皮细胞生长因子重组腺病毒构建及滴度测定：pDC315-人血管内皮细胞生长因子121重组质粒和pBHGloxdehaE1，3Cre质粒共转染293细胞后7d，部分293细胞出现CPE，10d后出现CPE的细胞明显增多，约2周时绝大多数细胞出现CPE，而对照组未转染质粒的细胞未见CPE现象。最终重组腺病毒Ad-人血管内皮细胞生长因子121滴度为1．0&;#215;10^10-4．3&;#215;10^11PFU／mL。（3）血管内皮细胞生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达：重组腺病毒转染NIH3T3细胞48h后行细胞免疫组织化学染色，结果显示细胞人血管内皮细胞生长因子121染色阳性，阳性染色主要位于细胞浆中，而未转染病毒的细胞染色极弱。结论：构建的携带人血管内皮细胞生长因子121基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达，有可能用于缺血性疾息的基因治疗。     

重组腺病毒载体pDC316-hIL-24的构建及病毒滴度测定

目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达hIL-24基因的重组腺病毒载体（pDC316-hIL-24）,获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体（pDC315-hIL-24）的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。      

以红色及绿色荧光蛋白为标记基因的血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2真核表达载体的构建及其在293-T细胞中的共表达

背景：血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用。 目的：构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体，共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2日在293-T细胞内的表达和定位。 设计：随机对照实验。 单位：解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室。 材料：实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成。pCDNA3.1（＋）/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学Dr.Bostrom惠赠；pDsRed1-N1由Professor Roger Y.Tsien,University of Califormia,San Diego,USA惠赠。pUC18/血管内皮细胞生长因子165，293-T cells由本实验室保存。 方法：根据已知的人血管内皮生长因子165序列，设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物，用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段，定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中，构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1；同时，构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体。以DOTAP为介导，将重组质粒共转染293-T细胞，48h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达，使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达。 主要观察指标：质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达。 结果：重组质粒经酶切，聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确，目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达，激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞中共定位的情况。 结论：成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体，两者共转染后能在真核细胞中表达，为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具。     

重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达

目的构建并制备鼠白细胞介素-15(mIL-15)重组腺病毒(rAd-mIL-15),感染HEK293细胞,为肝细胞肝癌的免疫治疗奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增mIL-15,将扩增产物连接到穿梭载体pDC316上,构建重组穿梭质粒pDC316-mIL-15。在Lipofectamine2000脂质体介导下将腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-mIL-15共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-mIL-15。随后在HEK293细胞中包装扩增病毒并测定病毒滴度。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果重组腺病毒质粒经PCR鉴定,证实含有mIL-15基因,重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×1010 PFU/mL。结论采用细胞内同源重组方法可成功构建含mIL-15基因的重组腺病毒,并可获得高滴度病毒,其能高效感染HEK293细胞,能为进一步研究奠定基础。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达

本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础。设计含有NotⅠ和EcoRⅤ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白。结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和NotⅠ、EcoRⅤ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558×1010pfu/ml。病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25%。经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白。结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础。     

重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达

目的：制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞，观察过氧化氢酶表达水平。方法：将过氧化氢酶cDNA亚克隆至pShuttle-CMV中，将其和pAdEasy-1在细菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat，再转染Ad-293细胞，包装成重组腺病毒颗粒；经纯化获取重组腺病毒AdCat。转染血管平滑肌细胞，Westem blot鉴定细胞中过氧化氢酶表达。结果：正确构建了重组腺病毒载体，获得高滴度重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞后过氧化氢酶高表达。结论：重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达，为用过氧化氢酶基因进行再狭窄的防治打下了基础。     

细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景:腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法.目的:观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性.设计、时间及地点:基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成.材料:合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供.pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pint.AV.spaT质粒、pint.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司.方法:通过动态模板PCR基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165.将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pint.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pint,AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B转染293细胞.主要观察指标:以DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率.结果:重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒.荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%.线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B共转染293细胞,12-14 d后会出现细胞病变效应.分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带.结论:以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒.