卵泡刺激素和卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的：研究卵泡刺激素和卵丘颗粒细胞对体外培养的卵母细胞核成熟的影响。方法：未成熟卵母细胞来自人绝经期促性腺激素刺激后的小鼠卵巢。所得生殖泡期卵母细胞分成裸卵组和卵丘-卵母细胞复合物组，在分别添加0．1，0．5和1u／mL卵泡刺激素的合成人输卵管液培养液和不添加卵泡刺激素的合成人输卵管液培养液（对照组）中培养36h。培养过程中在倒置显微镜下观察各组卵母细胞生殖泡破裂和第一极体出现。出现第一极体的卵母细胞判为核成熟。结果：裸卵各卵泡刺激素组与对照组的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率差别无显著性意义（P〉0．05）；卵丘-卵母细胞复合物各卵泡刺激素浓度组比对照组卵丘-卵母细胞复合物有更高的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率（P〈0．05）；但各卵泡刺激素浓度组间卵丘-卵母细胞复合物的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率差别无显著性意义（P〉0．05）。卵丘-卵母细胞复合物各组的卵母细胞生殖泡破裂发生率和第一极体排除率明显高于裸卵各组（P〈0．05）。结论：（1）卵丘细胞对卵母细胞的核成熟有重要作用。（2）卵泡刺激素对卵丘-卵母细胞复合物中卵母细胞核成熟有促进作用，其作用可能是通过颗粒细胞介导的。（3）卵泡刺激素对卵母细胞核成熟的促进作用可能主要是促进减数分裂的恢复。     

保留卵丘细胞对短时受精结果的影响

目的:探讨保留卵丘细胞对短时受精结果的影响。方法:行短时受精的患者47例,获卵数均大于10个,精卵结合后4h,根据是否去除卵丘细胞将患者的卵母细胞随机分为两组:无卵丘细胞组,共389个卵母细胞;有卵丘细胞组,共402个卵母细胞。观察卵丘细胞对短时受精的正常受精、多精受精、卵裂率、优质胚胎及胚胎利用率的影响。结果:无卵丘细胞组与有卵丘细胞组,多精受精率分别为11.6%及5.5%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01),两组的正常受精率(71.9%vs76.6%)、1PN受精率(4.9%vs5.2%)、未受精率(10.5%vs12.7%)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。无卵丘细胞组与有卵丘细胞组的卵裂率(98.6%vs99.4%)、优质胚胎率(67.0%vs72.9%)、胚胎利用率(86.2%vs87.3%)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:短时受精时,在保证患者受精的情况下,将剩余的卵母细胞保留卵丘细胞,可以降低多精受精的发生。     

卵母细胞和受精卵的扫描电镜制样方法

卵母细胞和受精卵的扫描电镜制样方法项晓人，成国祥，袁莉民卵母细胞和受精卵由于其量少珍贵而成为扫描电镜制样技术中的一个难题，至今用扫描电镜研究卵和受精卵超微结构的范围只限于鼠类。而过去研究人员用口吸移管（ｍｏｕｔｈｐｉｐｅｔｅｅ）移卵、以大量卵球弥补制...     

近交系小鼠体细胞核移植胚胎的构建和鉴定

背景：体细胞核移植技术己成功用于多种动物的克隆，但其过程中核移植技术的成功率较低。 目的：通过对卵母细胞不同去核方法的对比分析，观察其对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响，并利用微卫星DNA技术进行核移植囊胚鉴定，幸刀步建立小鼠体细胞核移植技术平台。 设计、时间及地点：以卵母细胞为观察对象的对比实验，于2005—09/2007-10在广西医科大学医学科学实验中心及动物实验中心完成。材料：选用C57BL／6小鼠卵母细胞为受体、BALB／c小鼠卵丘细胞为供体。取600枚受体卵母细胞，根据去核方法不同分为3组。每组200枚。 方法：①盲吸法：吸出卵母细胞第1极体及其附近的适量胞质。②蔗糖辅助去核法：以含蔗糖显微操作液预处理卵母细胞，吸出可见的细胞核等遗传物质。③荧光染色去核法：Hoechest33342预处理卵母细胞，在紫外光下用去除遗传物质。乙醇联合二甲氨基嘌呤进行重构胚激活，激活后卵裂培养基液滴中培养。根据Mouse Genome Database设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物，提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB／c小鼠、受体C57BL／6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA，使用巢式聚合酶链反应扩增选定的序列。最终扩增出4个微卫星位点DNA片段，即D3Mit28，D11Mit258，D12Mit136及D14Mit50。主要观察指标：比较3种去核方法的去核率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数差异。对巢式聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。 结果：①盲吸去孩法的去核率、处理重构胚的体外发育能力均低于荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法（P〈0.05）。②荧光染包去核法的去核率高于蔗糖辅助去核法（P〈0.05），两组的囊胚率及囊胚细胞数差异均无显著性意义（P〉0.05）。③巢式聚合酶链反应可扩增微量基因组DNA。通过微卫星DNA序列的扩增，证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同，而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。 结论：荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法适用于小鼠核移植，可支持小鼠体细胞核移植胚胎的早期发育。微卫星分析证实体细胞核移植囊胚为供体BALB/c小鼠的克隆，微卫星DNA分析可用于小鼠体细胞核移植囊胚的鉴定。     

小鼠卵母细胞miR-135的表达对胚胎发育的影响

目的:探究小鼠卵母细胞miR-135的表达对胚胎发育的影响。方法:实时荧光定量PCR(real-time polymerasechainreaction,real-timePCR)检测小鼠不同发育质量囊胚中miR-135的表达。小鼠卵母细胞注射miR-135抑制剂(miR-135 inhibitor)后,再体外受精(in vitro fertilization,IVF),分析不同质量囊胚构成比;检测植入前胚胎发育过程中2细胞期、4细胞期、桑椹胚和囊胚的数量;使用荧光染色观察囊胚中囊胚中胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)的表达及分布;将囊胚植入小鼠后,观察发育后胎儿的冠臀长度。结果:miR-135在高质量发育的囊胚中高表达。卵母细胞注射miR-135抑制剂后,再进行IVF,高质量囊胚比例降低和植入前胚胎发育迟缓;显微镜下观察发现:囊胚中IGF1R的表达无明显改变,但分布模式出现变化,表达集中于基底膜上;植入后胎鼠的冠臀长度明显变短。结论:抑制小鼠卵母细胞miR-135的表达会抑制胚胎发育。     

白藜芦醇对小鼠超排卵子质量的影响

目的 研究白芦藜醇（RSV）对小鼠超排卵效果及胚胎发育的影响。方法 以2~3月龄的CD-1小鼠为研究对象,在超排卵同时腹腔注射RSV（RSV组）或二甲基亚砜（DMSO组）,观察RSV对小鼠超排卵子质量的影响。选取了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、卵巢和睾丸组织的模板DNA,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分别检测沉默信息调节因子（SIRT1） mRNA在这三者中的表达情况。另外获取小鼠P1卵丘细胞,设置DMSO组、RSV（1 μmol/L）组和EX-527（SIRT1的抑制剂,10 μmol/L）组,使用荧光免疫染色检测各组SIRT的相对荧光强度、qRT-PCR检测各组的mtDNA相对表达量。 结果 RSV组的卵裂率和囊胚率均高于DMSO组（P均< 0.05）。体外实验结果显示,SIRT1 mRNA的相对表达量在卵巢是MEF的15~25倍（P < 0.001）。小鼠P1卵丘细胞在经RSV处理后SIRT1荧光相对强度升高（P < 0.001）。在用RSV和EX-527分别处理小鼠卵丘细胞48 h后,RSV组mtDNA相对表达量高于DMSO组（P < 0.001）,而EX-527组mtDNA相对表达量低于DMSO组（P < 0.01）。结论 小鼠超排卵时补充RSV能够显著改善卵子的发育潜能。     

玻璃化冷冻与程序化冷冻对小鼠MⅡ期的卵母细胞及经单精子卵胞浆注射得到的胚胎发育潜能的影响

目的评估两种冷冻方法对小鼠卵母细胞和单精子卵胞浆注射(ICSI)胚胎发育潜能的影响,以期为辅助生殖领域人卵母细胞的冷冻保存和胚胎发育潜能的研究提供实验依据。方法分别用玻璃化冷冻与程序化冷冻对小鼠MⅡ期的卵母细胞进行冷冻保存,解冻后存活的卵母细胞用于ICSI注射,然后将得到的胚胎体外发育并进行胚胎移植。用卡方和单因素的方差分析进行统计学分析,并比较两种方法冻存的卵母细胞解冻后的存活率,ICSI胚胎的2-细胞率、8-细胞率、囊胚率和妊娠率等。结果采用玻璃化冷冻法冷冻的MⅡ期卵母细胞存活率为81.6%,明显高于程序冷冻法组的70.7%。两组得到的胚胎在2-细胞形成率方面没有差异,但是8-细胞率和囊胚发育率差异均有统计学意义。两组假孕母体的妊娠率(63.6%和50.0%)和幼崽出生率(20.0%和12.4%)均没有统计学差异。结论与程序化冷冻相比,玻璃化冷冻对于小鼠MⅡ期卵母细胞的保存效果较好。解冻后卵母细胞用于ICSI,玻璃化冷冻组的胚胎得到较高的8-细胞率和囊胚发育率。但这两组的囊胚移植得到的妊娠率和出生率没有差异。     

活细胞工作站技术在小鼠卵母细胞实时观察中的应用

摘要：目的：将活细胞工作站（LCS）应用于实时观察小鼠卵母细胞后期成熟和极体排放过程。 方法：运用LCS技术平台,利用hoechst 33342标记DNA,同时结合明场观察,实时记录小鼠卵母细胞后期成熟和第二极体排放过程。 结果：在建立最适工作条件后,成功将LCS技术平台应用于小鼠卵母细胞观察,获得了第二极体排放的实时影像。 结论：LCS技术可成功地应用于小鼠卵母细胞观察,为进一步扩展LCS应用范围,获得卵母细胞及早期胚胎生长发育过程的实时影像打下良好的基础。     

小鼠单个不同阶段卵母细胞新抑癌印迹基因RB1的表达

目的 研究新抑癌印迹基因RB1 在小鼠单个不同阶段卵母细胞中的表达.方法 采用改良 单细胞RT-PCR 方法检测RB1 在单个不同阶段卵母细胞中的mRNA 表达.结果 RB1 在小鼠单个卵母细胞 GⅤ、MⅠ、MⅡ均有检测到正常表达,不同卵母细胞的RB1 表达量不同,其中8 个MⅡ期卵母细胞,3 个卵母 细胞明显表达,1 个表达较弱,其余4 个无明显表达.结论 RB1 在小鼠不同阶段卵细胞中均有表达,但是不 同细胞RB1 存在明显表达的差异.新印迹基因RB1 的研究有助于研究卵母细胞成熟及胚胎生长发育,尤其 使用单细胞进行研究,更有利于对表观遗传学深入研究探讨.     

卵母细胞的体外成熟

卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM)是指将GV期或GV前期的卵母细胞在体外培养,达到次级卵母细胞(MII),能够正常受精、发育和着床,包括完整的卵泡培养[1]和单纯的卵丘复合体培养.目前应用于辅助生殖技术的主要限于后者.     

颗粒细胞凋亡对卵母细胞发育潜能的影响

未成熟卵体外培养成熟（IVM）是近十几年在辅助生殖领域新兴起来的一种助孕技术。其主要原理是模拟体内卵母细胞的发育成熟环境，使从卵巢采集的未成熟卵母细胞在体外培养成熟，然后予以受精，胚胎培养和移植，获得妊娠 。目前体外培养的卵母细胞的成熟率低及受精率低，形成的胚胎发育潜能差，常不能继续发育到囊胚阶段而导致着床失败。     

铅对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

目的：探讨铅对小鼠生殖作用的影响。方法：采用小鼠卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了铅对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精的影响。结果：铅对小鼠卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率并可降低体外受精率和超排卵的卵母细胞数量,随着培养时间的延续,卵母细胞的第一极体的释放率和体外受精率都有显著提高,结论：铅可以破坏卵母细胞减数分裂进行,降低卵母细胞的受精能力,影     

牙齿修复相关转基因研究：显微注射法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠G0代的实验观察

目的：为便于进行规模化的转基因研究，构建一种四环素调控性转基因体系中的工具小鼠系。方法：实验于2002—06／10在上海南方模式生物研究中心完成。以cβ—actin启动子取代pTet—on—NSE质粒中的NSE启动子，构建转基因载体pTet-on-CX；将XhoⅠ酶切线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核，移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后，经PCR及Southern Blotting检测阳性小鼠。结果：注射的受精卵共存活603枚，移卵后产仔64只，阳性6只。阳性鼠分别传代开始建系。结论：通过显微注射的方法获得pTet—on—CX转基因工具小鼠的G0代，为规模化的转基因研究(包括与牙齿修复有关的基因，如牙本质涎磷蛋白基因)奠定了基础。     

卡托普利对病毒性心肌炎小鼠心肌能量代谢的保护作用

目的：探讨病毒性心肌炎(VMC)小鼠心肌能量产生状况，并用卡托普利进行干预治疗。方法：雄性Palb／c小鼠随机分为柯萨奇B3病毒(CVB3)感染组、CVB3感染加卡托普利治疗组和对照组。分别采用电镜和形态计量学方法观察心肌线粒体形态、数量和膜磷脂定位；酶细胞化学法分析线粒体细胞色素氧化酶(CCO)和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性，反相高效液相色谱法测定心肌组织ATP、ADP和AMP含量。结果：感染组小鼠心肌线粒体大量破坏，膜磷脂严重缺失、定位改变，CCO和SDH活性降低，ATP、ADP和AMP含量下降。不同时间点治疗组上述各项指标均较感染组显著改善。结论：VMC心肌线粒体结构严重破坏、功能明显下降，卡托普利能有效保护VMC心肌线粒体结构和功能，改善心肌能量代谢。     

卵母细胞分泌因子在卵巢储备功能减退患者中的表达及对胚胎发育的影响

目的 分析卵母细胞分泌因子在卵巢储备功能减退(DOR)患者卵丘颗粒细胞(CCs)中的表达情况,预测不同的促排卵方案对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响,为DOR不孕女性寻找更有效的促排卵方案。方法 收集接受卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)助孕治疗的80例DOR患者,425份CCs为研究对象,其中微刺激方案组30例171份CCs,促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-A)方案组30例165份CCs, PPOS方案组20例89份CCs,单卵丘颗粒细胞群与卵母细胞一一对应。提取卵母细胞周围CCs的mRNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组CCs中生长分化因子-9(GDF-9)、骨形成蛋白-15(BMP-15)和转化生长因子-β1(TGF-β1)相对表达量。结果 GnRH-A方案组中采用促性腺激素(Gn)天数及Gn剂量明显多于其余两组(P<0.05)。在3种促排卵方案中,MⅡ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量高于MⅠ和GV期;正常受精组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量高于异常受精组;优质胚胎组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量高于非优质胚胎...     

左炔诺孕酮宫内缓释系统治疗子宫肌腺症的患者行超促排卵的结局分析

目的探讨左炔诺孕酮宫内缓释系统(LNG-IUS,曼月乐)治疗子宫肌腺症的同时行超促排卵,对卵母细胞和胚胎发育是否有不利影响。方法回顾性分析在我中心就诊的通过PPOS+LNG-IUS方案治疗的子宫肌腺症155个OPU周期,对照组仅PPOS治疗的267周期,比较两组患者的年龄、不孕年限、体重指数、基础FSH水平、基础LH水平,治疗结束时直径14mm的卵泡数、获卵数、成熟卵数、正常受精卵数、优质胚胎数、有效胚胎总数。结果PPOS+LNG-IUS方案治疗组和对照组相比,年龄、不孕年限、体重指数、基础FSH水平、基础LH水平,治疗结束时直径14mm的卵泡数、获卵数、成熟卵数、正常受精卵数、优质胚胎数、有效胚胎总数等组间比较均无统计学差异(P0.05)。结论 PPOS+LNG-IUS方案,利用左炔诺孕酮宫内缓释系统释放的LNG的浓度阶梯差极大的特性,在LNG持续治疗子宫肌腺症的同时,进行超促排卵和取卵的治疗,对促排卵结果无明显影响,可以得到有发育潜能的胚胎。     

联合使用1-磷酸鞘氨醇和溶血磷脂酸对小鼠卵母细胞体外成熟和受精后胚胎发育的影响

目的通过在成熟培养液中联合添加或单独添加1-磷酸鞘氨醇(S1P)和溶血磷脂酸(LPA)研究对小鼠卵母细胞体外成熟和受精后胚胎发育的影响,以期为优化人卵母细胞的体外成熟系统和提高体外胚胎发育率奠定实验基础。方法 (1)成熟培养液中单独添加50~2 000 nmol/L S1P或1~100μmol/L LPA,体外成熟后的卵母细胞体外受精,得到的胚胎观察并统计卵裂率、8-细胞率、囊胚率。(2)成熟培养液中联合添加不同浓度组合S1P和LPA,体外成熟后的卵母细胞体外受精,得到的胚胎观察并统计卵裂率、8-细胞率、囊胚率。(3)对各组体外成熟得到的卵母细胞进行免疫荧光法染色,以评估MⅡ期卵母细胞纺锤体的完整性。(4)对各组得到的数据应用卡方检验进行分析。结果添加100 nmol/L S1P组的成熟率(81.0%)和8-细胞率(81.9%)显著高于0 nmol/L和2 000 nmol/L组;添加30μmol/L LPA的成熟率(81.8%)和8-细胞率(81.5%)显著高于0μmol/L和100μmol/L组;500 nmol/L S1P+30μmol/L LPA组的成熟率(90.7%)显著高于100 nmol/L S1P组、30μmol/L LPA组合和不添加组;500 nmol/L S1P+30μmol/L LPA组的囊胚率(77.6%)显著高于100 nmol/L S1P组和不添加组。结论联合添加S1P和LPA可能要比单独添加更能促进小鼠卵母细胞成熟,虽然在正常纺锤体百分率方面没有显示出优势,但通过体外受精得到的胚胎得到了较高的囊胚发育率。     

细胞移植过程中体细胞克隆提高卵母细胞去核率的最佳方法

目的：治疗性克隆应用于临床中需有效解决体细胞克隆及干细胞培养两大技术。观察注射人绒毛膜促性腺激素后不同时间体内成熟卵母细胞MⅡ期染色质与第一极体相对位置，确定以第一极体为标志，盲吸法去核时间和与染色质的位置关系，解决克隆过程中卵母细胞来源与去核率。方法：实验时间为2004-09／11，实验地点为哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室组织工程研究中心层流实验室。4～6周雌性昆明小鼠在明暗循环的环境饲养，做超数排卵处理。卵母细胞用含10mg／L Hoechest33342的M2液染色5min，在Olymopus荧光显微镜下经紫外荧光激发，观察MⅡ期染色质与第一极体的相对位置，并且用不同的角度记录(0&;#176;～30&;#176;，30&;#176;～90&;#176;和90&;#176;～180&;#176;)。Moteic软件测量卵周隙，明确卵周隙变化规律。结果：①注射人绒毛膜促性腺激素12h，开始排卵，可见第一极体的卵母细胞占72．22％，23．08％第一极体已开始退化。排卵后，随着卵母细胞在体内的老化，退化的第一极体增多，到注射人绒毛膜促性腺激素19h退化第一极体的比率达到100％，可见第一极体的卵母细胞比率降到7．14％。②注射人绒毛膜促性腺激素12和14h MⅡ期染色质与第一极体位置比邻，在0&;#176;～30&;#176;区域的卵母细胞较其他时间段多，为61．54％和50％；注射人绒毛膜促性腺激素13和17h的卵母细胞MⅡ期染色质与第一极体位置以在30&;#176;～90&;#176;区域为主；注射人绒毛膜促性腺激素15hMⅡ期染色质与第一极体位置在0&;#176;～30&;#176;和90&;#176;～180&;#176;区域的卵母细胞数相等，为30．77％，且少于30&;#176;～90&;#176;区域的卵母细胞(38．46％)；注射人绒毛膜促性腺激素16，18和19hMⅡ期染色质与第一极体位置在90&;#176;～180&;#176;区域的卵母细胞逐渐增多，注射人绒毛膜促性腺激素19h达到最大值66．67％。③卵周隙随卵母细胞在体内的老化逐渐增大。结论：注射人绒毛膜促性腺激素12h可以进行小鼠卵母细胞去核操作，注射人绒毛膜促性腺激素14h为最佳去核时间。     

印迹基因Snrpn在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达

目的了解印迹基因Snrpn在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达,以分析Snrpn基因表达对人类卵母细胞和早期胚胎发育的影响。方法采用单细胞巢式逆转录多聚酶链式反应(Single Cell Nested RT-PCR)方法,检测人类卵子和植入前各个阶段胚胎的印迹基因Snrpn mRNA表达情况。结果Snrpn在人类卵母细胞GV、MI、MII和植入前胚胎2、4、6、8细胞期都有表达,单卵母细胞扩增成功率为87.5%,单个胚胎为75.8%,平均扩增成功率为79.1%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差异(P>0.05),但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论建立了比较稳定、可靠的单细胞巢式RT-PCR技术检测基因表达。印迹基因Snrpn在人类卵细胞和植入前胚胎的表达对卵子生长和胚胎发育有着重要意义,为早期胚胎阶段该基因表达正常图谱提供实验依据     

体外受精后提前去除卵丘细胞对临床结局的影响

目的观察提前去除卵丘细胞对胚胎质量的影响,进一步探讨其临床应用价值。方法将2009年79月行体外受精胚胎移植治疗的患者随机分为两组,试验组共137个周期,于授精后5h去除卵丘细胞;对照组共146个周期,于授精后16～18h去除卵丘细胞。两组均于授精后16～18h观察受精情况,72h对胚胎进行评分,选择1～3枚优质胚胎进行胚胎移植。分别比较两组的年龄、不育年限、获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率和临床妊娠率。结果两组的优质胚胎率差异有统计学意义（P〈0.01）;但年龄、不育年限、获卵数、受精率、卵裂率、胚胎种植率和临床妊娠率比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论体外受精中提前去除卵丘细胞优质胚胎增加,有助于提高临床累积妊娠率。