抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用

目的 克隆PAK5-N端基因并诱导其表达,进行多克隆抗体制备,为研究其在牙胚细胞中的生物学功能奠定基础。方法 根据人全长PAK5 cDNA序列．设计引物;利用PCR技术．以PAK5全长cDNA为模板扩增PAK5-N端基因,将扩增产物克隆至pGEX-4T-1载体中,经EcoRI／XhoI双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA测序。以硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆菌BL21中表达。利用GST融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化,通过免疫家兔制备多克隆抗体,并在牙胚细胞中进行了初步研究。结果和结论 成功克隆了PAK5-N端基因．在E-coli中表达了PAK5-NT,并纯化了GST融合蛋白,制备了PAK5特异性抗体。Western blotting表明PAK5在牙胚细胞中过度表达,为其在口腔细胞中的生物学功能研究提供了依据。     

粘附结构蛋白migfilin基因N末端的克隆和抗体制备

目的 克隆migfilin-N末端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物并进行多克隆抗体制备,为研究migfilin与大肠癌的关系奠定基础.方法 根据人migfilin全长cDNA系列,设计PCR引物,以人大肠癌cDNA文库为模板克隆migfilin-N末端基凶,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DNA序列测定.GST-migfilin-N融合蛋白在硫代半乳糖苷诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-migfilin-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.并用纯化的抗migfilin多克隆抗体在不同的细胞株中用Western blotting检测migfilin的表达.结果 成功克隆了migfilin-N端基因片段,表达并纯化了GST-migfilin-N融合蛋白,制备了migfilin特异性抗体.Western blotting检测migfilin在不同细胞株中的表达,结果显示migfilin在肺癌及大肠癌细胞株中高表达.结论 migfilin特异性抗体制备成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

小鼠TLR-2N末端基因的克隆表达和抗体制备

目的 克隆mTLR-2基因氨基端序列,并表达和纯化N端融合蛋白,制备抗mTLR-2 N末端的多克隆抗体.方法 采用PCR技术扩增编码mTLR-2N端1～153氨基酸的基因,并将其克隆到pET32A载体中,测序验证;用大肠杆菌表达融合蛋白,并以Probond树脂柱纯化;免疫家兔制备多克隆抗体,采用免疫组化、流式细胞术及间接ELISA检测抗体特异性及效价.结果 成功构建了融合表达载体pET-N,表达和纯化了相应的融合蛋白,所制备多克隆抗体可与pGEX-N表达的融合蛋白反应,并可结合表达TLR-2的RAW264.7及转染mTLR-2全长基因的CHO细胞.结论 获得了mTLR-2 N末端重组融合蛋白及其可与天然mTLR-2结合的多克隆抗体.     

p21激活的磷酸化蛋白激酶6基因克隆、重组质粒载体的构建和序列分析

目的 测定PAK6在前列腺癌中的表达,探讨PAK6与前列腺癌的关系.方法 根据人全长PAK6cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,进行DAN序列测定.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA,构建了pGEX-4T-1-PAK6-NT重组质粒载体并进行了序列测定.结论 克隆PAK6全长cDNA并进行了序列测定,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.     

FKBP38的原核表达、抗体制备及其应用

目的 构建人FKBP38 N-末端及C-末端原核表达载体并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物,制备兔多克隆抗体并对该抗体用于Western免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测进行评价,为研究FKBP38的功能奠定基础.方法 以人FKBP38 cDNA为模板,根据人FKBP38全长cDNA系列,设计PCR引物分别扩增N-末端(1-207aa)及C-末端(209-387aa),将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P1中,经BamH I/Sa1 I双酶切鉴定.GST-FKBP38-N及GST-FKBP38-C融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-FKBP38-N融合蛋白及GST-FKBP38-C融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化.使用纯化的抗FKBP38多抗以Western免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测FKBP38的表达与细胞内的定位.结果 成功构建FKBP38 N-末端及C-末端原核表达载体,表达并纯化了GST-FKBP38-N融合蛋白及GST-FKBP38-C融合蛋白,制备并纯化了FKBP38特异性抗体.该抗体用于Western免疫印迹检测FKBP38在不同细胞株中的表达,特异性强、效价高;用于免疫荧光检测FKBP38在细胞内主要定位于线粒体上;用于免疫组织化学检测FKBP38在乳腺组织细胞呈现胞浆阳性.结论 FKBP38特异性抗体制备成功,该抗体可用于FKBP38的免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测,为深入研究FKBP38的功能奠定基础.     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

抗nestin多克隆抗体的制备

目的: 在大肠杆菌中融合表达编码小鼠nestin 肽链C段的cDNA序列,制备特异性多克隆抗体;方法: 采用RT-PCR的方法获得编码小鼠nestin 肽链C段的cDNA序列,将测序正确的片段克隆入pET-32 a,构建pET-32 a-nestin-C表达载体.在大肠杆菌BL-21中IPTG诱导下表达6×His-nestin-C融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗鼠nestin血清,以Western Blotting和免疫组化方法分析其特异性.结果: 6×His -nestin-C融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,Western Blotting和免疫组化结果显示制备的抗体具有较高的特异性.结论: 构建了pET-32 a-nestin-C表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达.该多克隆抗体效价高、特异性好.     

胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的 构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础.方法 从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不合信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度.结果 成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体.结论 成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础.     

人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

目的：构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法：以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6 为模板,PCR扩增出 PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX-5X-1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coli BL21中,采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达, 采用Western blotting 法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果：EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段（5 000 bp）和PAK6 1-55(165 bp)、PAK6 56-210(465 bp)、PAK6 211-410（600 bp）及PAK6 385-681（891 bp） 4个片段。Western blotting检测, PAK6各截短区域质粒GST-PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论：成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。     

人VIGILINN端融合蛋白的表达及亚细胞定位

目的 原核表达人VIGILIN N端基因,制备抗人VIGILIN的多克隆抗体,对人VIGILIN作亚细胞定位.方法 用PCR扩增人VIGILIN基因N端,克隆到表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达.产物经 Glutathion Sepharose 4B纯化后免疫新西兰白兔制备抗人VIGILIN N端融合蛋白抗体,采用ELISA和Western blot鉴定抗体的效价及特异性.通过细胞免疫荧光染色,观察VIGILIN在细胞中的分布.结果 在28 ℃、1 mmol/L IPTG诱导3 h的最优条件下成功表达GST-VIGILIN N端融合蛋白,抗体ELISA滴度为1:16000,Western blot证实抗体特异性较高,VIGILIN在细胞质和核中均有分布,核中的分布集中在核膜内侧和靠近DAPI染色显著的区域. 结论 成功表达人VIGILIN N端融合蛋白和制备兔抗人VIGILIN抗体,并应用于亚细胞定位,为研究人VIGILIN的性质和功能奠定基础.     

人L-选择素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建人L-选择素原核表达载体,表达并纯化人L-选择素重组蛋白,制备兔抗人L-选择素多克隆抗体。方法：利用人L-选择素cDNA的N末端胞外结构区153个氨基酸的开放阅读框架(ORF),通过PCR方法扩增出人L-选择素目的片段。将扩增的基因插入表达载体pQE40的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间,再经转化使其在大肠杆菌M15中表达,产生含6-His-tag的融合蛋白。融合蛋白经Ni亲合层析柱纯化和SDS-PAGE分析后,用以免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。最后经Western blotting检测和斑点杂交（DIBA）进行抗体效价测定。结果：酶切鉴定和DNA测序显示,pQE40-L-选择素重组表达载体含有人L-选择素N末端结构区153个氨基酸的cDNA序列;通过在大肠杆菌M15中的表达和纯化分析,获得了蛋白含量为600 mg·L^-1的人L-选择素蛋白;通过免疫新西兰白兔和抗体效价测定,得到抗血清效价达1∶1 000的多克隆抗体。结论：人L-选择素蛋白可在M15大肠杆菌中高效表达,其多克隆抗体效价较高。     

人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备

目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a( )及pET24a( ),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

果蝇Bves蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究细胞粘附分子Bves在肿瘤的发生及转移过程中的作用,需要获得Bves蛋白并制备其抗体。方法根据Flybase网站所提供的Bves基因序列,以果蝇的总RNA为模板进行PCR扩增,得到Bves部分编码序列,随后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。重组表达质粒经酶切测序鉴定后,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,并用IPTG诱导融合蛋白的表达,使用活化的Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化后得到的His-Bves融合蛋白免疫注射新西兰大白兔制备Bves多克隆抗体,并用Western blot对抗体效价进行检测。结果和结论获得了Bves原核表达重组融合蛋白及高效价的兔抗Bves多克隆抗体,为后期深入研究Bves基因的功能奠定了基础。     

UROC28基因的原核表达及抗UROC28多抗制备和初步应用

目的: 在原核细胞大肠杆菌中融合表达UROC28基因产物,分离、纯化后制备其特异性多克隆抗体,并初步应用于肿瘤标本的检测,为进一步研究该分子的功能和组织分布等提供条件. 方法: 利用DNA重组技术将UROC28基因克隆入融合表达载体pRSET-c质粒,并在大肠杆菌BL-21中融合表达目的蛋白,回收后制备兔抗血清,Western blot鉴定抗体后,应用该抗体对前列腺癌石蜡切片进行免疫组化染色. 结果: His-UROC28融合蛋白的Mr约为22 000,与预期相符;融合蛋白占菌体总蛋白的20%. 目的蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,Western blot结果显示制备的抗UROC28多克隆抗体具有较高的特异性,无明显交叉反应,并成功在前列腺癌组织标本中检测UROC28的表达. 结论: 本研究成功构建了UROC28融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达. 制备了该分子的多克隆抗体,经初步验证其效价高、特异性好,为深入研究UROC28的功能及其与疾病的关系创造了条件.