组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

三氧化矿物凝聚体对成人牙髓干细胞增殖和分化的影响

目的:研究不同浓度的三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)对成人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖和分化的影响。方法:体外培养hDPSCs,分别以不同浓度MTA浸提液作用于hDPSCs。采用四甲基偶氮噻唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)法测定MTA对hDPSCs增殖的影响;Von Kossa染色法检测hDPSCs钙化结节的形成;通过酶标仪法检测hDPSCs碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)的活性;运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphopro-tein,DSPP)基因的表达。采用单因素方差分析对数据进行统计学分析。结果:2 mg/mL MTA能促进hDPSCs增殖,其ALP活性也明显高于其他各组,并可见Von Kossa染色呈阳性,有钙化结节形成,且能明显促进牙髓干细胞表达DSPP;而20 mg/mL MTA则抑制hDPSCs的增殖,ALP活性明显低于其他各组,Von Kossa染色阴性;而0.2 mg/mL MTA组及氢氧化钙组未能表现出明显的增殖分化活性。结论:2 mg/mL MTA能促进hDPSCs的增殖,并能诱导hDPSCs向成牙本质细胞方向分化。20 mg/mL MTA抑制hDPSCs的增殖,并且抑制hDPSCs向成牙本质细胞方向分化。     

人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的诱导及鉴定

牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化受多种细胞分化信号的调控。其中 ,骨形成蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、多种生长因子被认为在诱导其分化中起关键作用 ;而碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白和牙本质基质蛋白 - 1常被用作鉴定其分化的特异性指标     

BMP2/Smads通路介导富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞成骨分化的作用研究

目的:基于骨形态发生蛋白2(BMP2)/母亲信号蛋白同源物通路(Smads)通路,分析富血小板纤维蛋白(PRF)对人牙髓干细胞成骨分化的作用.方法:分离纯化牙髓干细胞,流式细胞仪检测并鉴定牙髓干细胞表面抗原标记物,随机分为对照组、PRF组、BMP激活剂组和BMP抑制剂组(简称激活剂组和抑制剂组),检测培养7d、14d后的碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-qPCR检测牙髓干细胞胶原蛋白Ⅰ(COL-Ⅰ)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN) mRNA相对表达水平;茜素红染色观察矿化结节形成;Western-Blot检测牙髓干细胞BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平.结果 ..STRO-1、CD29、CD90表达阳性,符合牙髓干细胞的表型.各组ALP活性随时间延长而升高(P＜0.05),从对照组到抑制剂组、PRF组、激活剂组,牙髓干细胞ALP活性及COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA相对表达水平依次升高,红色矿化结节数目、A值依次增加(P＜0.05).从抑制剂组到对照组、PRF组、激活剂组,牙髓干细胞BMP2、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平依次升高(P＜0.05).结论 ..PRF可能通过激活BMP2/Smads信号通路促进人牙髓干细胞成骨分化.     

白藜芦醇在人牙髓干细胞成牙本质向分化中的调控机制研究

目的：探讨白藜芦醇是否通过上调沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的表达并激活β-catenin信号通路，从而促进人牙髓干细胞（DPSCs）成牙本质向分化。方法：不同浓度白藜芦醇（0、10、15、20、50μmol/L）作用于DPSCs 7天和14天后，利用CCK-8法检测细胞增殖活性。在15μmol/L白藜芦醇作用下，成牙本质向分化诱导培养DPSCs 7天后，检测碱性磷酸酶（ALP）活性；采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的mRNA表达情况；采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测DPSCs分化诱导不同时间（0、3、5、7、14天）后SIRT1的蛋白表达情况。15μmol/L白藜芦醇作用下分化诱导培养DPSCs 7天后，检测SIRT1和活化β连环蛋白（β-catenin）表达水平。采用GraphPad Prism 9软件包对数据进行统计学分析。结果：15μmol/L白藜芦醇对DPSCs 7天和14天的增殖活性...     

Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预干细胞成骨/成牙分化的研究

目的:探讨Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预人牙髓干细胞成骨/成牙分化及其可能的机制.方法:分离纯化和培养人前磨牙牙髓干细胞(HDPSCs),免疫荧光检测牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和波形蛋白(Vimentin),CCK-8检测不同浓度Chir99021对HDPSCs细胞增殖作用的影响.将HDPSCs分为3组培养,第1组正常培养,为空白对照组;第2组成骨诱导液培养,为实验对照组;第3组成骨诱导液+Chir99021培养,为实验组.15 d后用茜素红染色对各组细胞进行钙沉积物检测;qPCR于5、10、15 d检测各组轴抑制蛋白2(axis-inhibition protein2,Axin2)、β连环蛋白(β-catenin)及糖原合成激酶3(GSK-3β)水平;Western blot于5、10、15 d检测各组RUNT相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和Ⅰ型胶原的表达.结果:分离培养后的HDPSCs中DSP和Vimentin呈阳性表达;Chir99021浓度为2000 nmol/L时,细胞增殖情况最明显;茜红素染色显示实验组钙沉积物较其余两组显著增加;实验组中Axin2、β-catenin显著上升,GSK-3β显著下降(P<0.05);Runx2、ALP在实验组及实验对照组中有显著表达(P<0.05),OC在实验组中显著表达(P<0.05);DSPP、Ⅰ型胶原在实验组中显著表达(P<0.05).结论:Chir99021通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进HDPSCs的增殖和成骨/成牙分化.     

镁黄长石对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面黏附、增殖和成骨分化特性。方法:采用酶消法培养山羊乳牙牙髓干细胞。在生长培养液条件下,应用荧光显微镜观察细胞在材料表面的黏附情况,以CCK-8法检测细胞在材料表面的增殖特性;在矿化培养液条件下,以pNPP法检测细胞在材料表面于1、4、7 d碱性磷酸酶(ALP)活性,并通过实时定量PCR检测4、7 d时成骨标志基因ALP、COL I、OPN和OCN的表达。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与β-TCP相比,山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面伸展更开,在第4天起增长明显加快,ALP活性在4、7 d更高,镁黄长石组的基因表达水平明显上调,其中OCN表达量在第7天显著增加(P<0.01)。结论:山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面能够良好黏附和增殖。与β-TCP相比,镁黄长石能够促进山羊乳牙牙髓干细胞向成骨方向分化。     

miR-148a-3p靶向Wnt1基因对人牙髓干细胞增殖活力及成骨分化的影响

目的：观察微小RNA(miRNA)-148a-3p对人牙髓干细胞（DPSCs）增殖活力及成骨分化的影响，并探讨可能机制。方法：取对数期DPSCs，分为空白组、NC组、inhibitor组、inhibitor+XAV939[无翅型MMTV整合位点家族蛋白（Wnt）/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路抑制剂]组。空白组不处理，NC组转染阴性对照质粒miR-148a-3p NC,inhibitor组转染miR-148a-3p inhibitor,inhibitor+XAV939组转染miR-148a-3p inhibitor并加入XAV939(40μmol/L)。转染48 h后qRT-PCR法检测miR-148a-3p表达量；MTT法检测增殖活力；ELISA法检测碱性磷酸酶（ALP）活性；茜素红染色法检测矿化能力；双荧光素酶实验验证miR-148a-3p靶向基因；Western blot法检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-catenin、Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)以及Wnt1蛋白相对表达量。结果：与空白组...     

瘦素对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的 探讨瘦素(leptin)对体外培养的牙髓干细胞增殖、分化的影响.方法 体外培养牙髓干细胞,采用MTT法及流式细胞技术检测不同浓度瘦素对牙髓干细胞增殖作用的影响,通过碱性磷酸酶、Yon Kossa染色及矿化相关蛋白(DSP、OCN)的免疫组化染色来检测瘦素对牙髓干细胞分化的影响.结果 瘦素对牙髓干细胞增殖没有显著作用,但是对牙髓干细胞的ALP活性呈浓度依赖性促进.Von Kossa染色可见矿化结节形成,DSP及OCN表达阳性.结论 瘦素可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化.     

人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究

目的：探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。方法：用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达。体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况,通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达,未成骨诱导细胞作为对照。结果：人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD44、CD90、CD105,阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性,21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成,对照组为阴性。成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达,OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。结论：经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,形成钙盐沉积和矿化结节,ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。     

牙本质支架体外诱导兔骨髓干细胞分化

目的：探讨将人牙本质作为组织工程支架的可行性,采用不同的方式处理牙本质片,观察牙本质片处理后诱导兔骨髓基质干细胞贴壁附着生长的规律及成骨分化潜能。方法：将兔的骨髓基质干细胞分别接种于经机械去除前期牙本质加EDTA-柠檬酸脱矿处理（A组）,标准根管预备-EDTA处理（B组）的牙本质片上,体外培养1周,扫描电镜观察细胞与牙本质片的附着情况,碱性磷酸酶、茜素红及Vonkossa染色观察兔骨髓基质干细胞成骨分化。结果：兔骨髓基质细胞附着在2种方式处理的牙本质片上生长良好,贴附紧密。B组牙本质片上细胞碱性磷酸酶表达阳性率高达80％,茜素红、Vonkossa染色观察到钙结节数量多于A组。结论：经标准根管预备一EDTA处理的人牙本质能有效促进骨髓基质干细胞增殖及成骨分化,可能成为一种理想的成骨生物支架,并为牙体牙髓疾病的治疗提供了新的思路。广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻1012400lA一42）     

成体人牙髓干细胞的分离与鉴定

目的从成体人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，初步探讨其分化潜能。方法选取年轻患者因正畸或阻生拔除的健康第三磨牙，取出牙髓，采用酶消化及过滤法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，检测STRO-1的表达。体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节形成、牙本质涎蛋白(DSP)表达、Oil Red—O染色、PPARr2基因表达等方面进行检测。结果克隆来源细胞STRO-1表达阳性。在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达DSP，已向成牙本质细胞方向发生了分化。成脂肪诱导后，Oil Red—O染色阳性，可检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可以分离培养出干细胞，在体外能有效增殖并保持低分化状态。     

rhBMP-2/rhTGF-β_1联合应用对兔成骨样细胞增殖及分化的影响

目的: 探讨转化生长因子β(transforming growth factors beta,TGF-β)、与骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)联合应用对兔成骨样细胞增殖及分化的影响。方法: 体外培养兔成骨样细胞,采用四唑盐比色法和碱性磷酸酶试剂盒检测两种生长因子对兔成骨样细胞增殖及分化的影响。结果: 100ng/ml rhBMP-2促进兔成骨样细胞的分化,对增殖无明显作用。不同浓度的rhTGF-β1均可促进成骨样细胞的增殖,对分化无明显作用。二者在同时应用时,其作用部分或完全抵消。结论:在本实验条件下,rhBMP-2、rhTGF-β1联合应用时无协同效应。     

姜黄素通过调控Wnt通路改善牙周膜干细胞成骨分化能力

目的:探讨姜黄素对人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的影响。方法:取第4~6代的PDLCs进行实验,用CCK-8实验检测姜黄素对PDLCs增殖活性影响,通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节染色以及ALP、OCN和Runx2等成骨相关基因的表达水平来探讨姜黄素对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响,同时检测姜黄素对经典Wnt通路及其配体的影响。结果:姜黄素对PDLSCs的增殖能力无影响。与对照组相比较,姜黄素能增加PDLSCs的ALP活性、上调ALP、OCN和Runx2等成骨相关基因的表达、增加矿化结节数量(P<0.05)。姜黄素能阻断Wnt信号通路,但加入Wnt信号通路激动剂(氯化锂)后,PDLSCs的成骨分化能力显著下降。结论:姜黄素能通过抑制Wnt信号通路,增强牙周膜干细胞成骨分化能力。     

Notch信号通路参与BMP-6对人牙髓细胞增殖分化作用的研究

目的:本研究通过观察骨形成蛋白-6(BMP-6,bone morphogenetic protein-6)对人牙髓细胞(hDPCs,humandentalpulp cells)增殖和成牙本质向分化的影响,以及Notch信号在其中可能的作用,初步探讨骨形成蛋白-6在牙髓损伤修复中的作用与机制。方法:采用组织块酶消化法体外培养hDPCs,分别应用BMP-6和γ-分泌酶抑制剂DAPT单独或共处理第3-5代hDPCs,采用CCK8法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP,alkalinephosphatase)试剂盒检测ALP活性,茜素红染色法检测矿化结节形成情况,观察牙髓细胞的增殖及成牙本质向分化能力。结果:CCK8结果显示,BMP-6促进hDPCs增殖,DAPT抑制hDPCs增殖,而经DAPT预处理的hDPCs,BMP-6对其促增殖作用减弱,与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05);ALP结果显示,BMP-6可促进hDPCs的ALP活性,DAPT则明显抑制其ALP活性,与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05),且DAPT可减弱BMP-6对细胞ALP活性的增强作用,与BMP-6组比较具有统计学差异(P<0.05);茜素红染色结果显示,BMP-6处理组矿化结节数量最多,BMP-6和DAPT共处理组次之,DAP7处理组最少。结论:BMP-6可促进hDPCs增殖和成牙本质向分化能力,而阻断Notch信号,可抑制BMP-6对hDPCs的促增殖及促成牙本质向分化作用。     

p38β在矿化诱导液诱导的人牙髓细胞成牙本质向分化中的作用

目的研究p38β丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)对矿化诱导液诱导的人牙髓细胞(h DPC)成牙本质向分化的影响。方法体外培养hDPC,Western blot检测hDPC矿化诱导0、3、7、14 d后p38β蛋白表达情况;构建3条慢病毒载体p38β鄄shRNA并分别转染hDPC,Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p38β蛋白及基因表达;设立空白对照组、矿化诱导(OM)组、OM+空载体(NC)组、OM+sh鄄p38β组共4组。成牙本质向矿化诱导1、7、14 d,实时荧光定量PCR检测成牙本质向分化指标牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)的基因表达;Western blot检测成牙本质向分化指标DSPP蛋白的表达;成牙本质向矿化诱导14 d,茜素红染色检测矿化结节的形成情况。结果 Western blot结果表明正常牙髓组织中存在p38β蛋白;成功构建p38β稳定低表达的hDPCs(实时荧光定量PCR显示三条序列干扰效率分别为55.4%、68.3%、54.2%);实时荧光定量PCR显示沉默p38β的hDPCs经矿化诱导后,成牙本质向分化指标DSPP、ALP基因表达水平显著降低,Western blot结果显示成牙本质向分化指标DSPP蛋白表达水平显著降低;茜素红染色结果显示,矿化诱导+sh鄄p38β组与空白对照组较另外两组的矿化结节数量明显减少。结论 p38β在OM诱导的h DPC成牙本质向分化中发挥作用。     

血管生成素4对牙髓干细胞成牙本质向分化的作用

目的 探讨血管生成素4(angiopoietin 4,ANGPT4)对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响。方法 本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准,并获得患者知情同意。将人前磨牙进行固定、脱钙、脱水、包埋和切片,免疫荧光染色观察ANGPT4的表达及定位。体外分离培养人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）,于倒置相差显微镜下观察hDPSCs的生长状态及形态;流式细胞术检测细胞表面相关分子标志物的表达;碱性磷酸酶和茜素红S染色鉴定h DPSCs成牙本质向分化的潜能;油红O染色鉴定hDPSCs成脂向分化潜能。提取hDPSCs成牙本质向诱导后不同时间点的RNA,采用RT-qPCR分析hDPSCs体外成牙本质向分化过程中ANGPT4基因及成牙本质细胞相关基因的表达。采用siRNA基因沉默技术沉默hDPSCs中ANGPT4基因的表达,通过RT-qPCR和Western blot检测沉默效率;在hDPSCs中沉默ANGPT4基因表达24 h后进行成牙本质向诱导,在诱导的第7天和14天分别进行碱性磷酸酶和茜素红S染色,检测沉默ANGPT4后hDPSCs的...     

人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

目的:探索人牙髓细胞条件培养液(HDPSCs-CM)对人牙囊细胞(HDFSCs)向成骨分化的作用.方法:利用胶原酶消化法获得HDFSCs,经纯化鉴定后培养于HDPSCs-CM中;CCK-8检测HDFSCs增殖活性,观察细胞形态改变;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色定性分析细胞成骨能力的改变.qRT-PCR检测HDFSCs中骨膜蛋白(POSTN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)以及骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达情况.结果:经HDPSCs-CM诱导后,HDFSCs形态发生成牙骨质或成骨样改变;诱导组HDFSCs增殖活性受到明显抑制(P<0.05或P<0.01);诱导组ALP染色强于对照组,茜素红S染色矿化结节多于对照组;诱导组POSTN、Col-Ⅰ、ALP、BSP、OPN的表达量明显增高(P<0.05或P<0.01).结论:HDPSCs-CM能促进HDFSCs成骨分化.