维拉帕米逆转胰腺癌化疗耐药的研究

目的　探讨多药耐药蛋白P 170拮抗剂维拉帕米对胰腺癌细胞株化疗耐药的逆转作用。方法　采用RT PCR法对胰腺癌细胞株SW 1990和CAPAN 1中多药耐药基因MDR1mRNA的表达进行半定量分析 ;罗丹明外排试验检测胰腺癌细胞株中P 170的功能 ;MTT比色法评估胰腺癌细胞株对化疗药物的敏感性 ,并比较单纯化疗与化疗联合维拉帕米对其的疗效差异。结果　RT PCR检测结果显示MDR1mRNA在SW 1990中的表达丰度为 0 5 75 0± 0 0 76 4 ,在CAPAN 1中的表达丰度为 0 186 4± 0 0 5 36 ,两者具有显著差异 (P <0 0 1)。罗丹明外排试验表明 :SW1990阳性细胞百分数明显低于CAPAN 1(P <0 0 1) ;维拉帕米可使SW 1990阳性细胞百分数明显增加 (P <0 0 1)。MTT结果表明 :SW1990较CAPAN 1对ADM、MMC耐药 ;维拉帕米可部分逆转其对ADM和MMC的耐药性。结论　MDR1可能参与胰腺癌细胞株化疗耐药 ;中等剂量的维拉帕米联合化疗可逆转具有MDR1表型的人胰腺癌细胞株对ADM和MMC的耐药现象。     

人肝癌HepG2多药耐药细胞系的部分生物学性状研究

目的　研究人肝癌多药耐药 (MDR)的机制 ,建立HepG2多药耐药细胞系并研究其部分生物学性状。方法　应用HepG2细胞系 ,通过培养液中阿霉素 (ADM )的浓度梯度增加法 ,得到肝癌多药耐药株HepG2 /ADM。Westernblot增强化学发光法 (ECL)检测细胞株表面多药耐药基因(MDR1)的表达产物P 糖蛋白 (P 170 )、多药耐药相关蛋白 (MRP)及肺耐药蛋白 (LRP)的表达水平。结果　耐药细胞的倍增时间延长 2 .0 5倍。该耐药模型的P 170表达水平较亲本细胞升高3 .90倍 (P <0 .0 1) ,但MRP及LRP无明显变化。结论　HepG2 /ADM同其亲本细胞相比 ,其耐药性、倍增时间有明显改变 ;多药耐药性主要与MDR1的高表达有关。     

葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义。方法体外培养人胰腺癌细胞SW1990和其耐药亚株SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM,以细胞活性测定（CCK-8法）检测耐药亚株的耐药指数,相对定量荧光实时PCR（RT—PCR）法检测GCS mRNA的表达,免疫印迹法检测GCS蛋白表达水平。结果与亲本株相比,SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM的耐药指数分别为339．7、11．9、56．6。RT—PCR和免疫印迹检测结果显示亲本株和耐药亚株均有GCS mRNA和蛋白的表达,GCS mRNA在3株耐药亚株中的表达均比亲本株有增高趋势,且SW1990／ADM、SW1990／GEM的GCS蛋白表达水平较亲本株升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GCS基因在人胰腺癌细胞株SW1990和其3株耐药亚株中表达阳性,GCS蛋白在SW1990／ADM、SW1990／GEM中呈高表达,表明GCS可能参与胰腺癌耐药株细胞对ADM、GEM的耐药。     

耐药胰腺癌细胞株对放射敏感性影响的初步探讨

目的初步探讨耐药胰腺癌细胞株的耐药性对其放射敏感性的影响。方法选取人胰腺癌细胞株SW1990经氟尿嘧啶（5-FU）、阿霉素和吉西他滨诱导后建立三株耐药细胞亚株（SW1990／FIL1、SW1990／ADM、SW1990／GZ）,通过流式细胞仪及直线加速器照射后进行细胞周期及放射生物学相关参数检测。结果细胞周期分析显示,与亲本株SW1990相比,SW1990／FU与SW1990／Gz的Go／G。期比例增高,G2／M期比例明显降低;SW1990／ADM各细胞周期百分比变化不大。集落实验结果表明,与亲本株SW1990相比,SW1990／FU及SW1990／GZ的存活分数（sir2）分别升高26．9％（P＜0．01）和14．4％（P＜0．01）,差异有统计学意义;SW1990／ADM的sir2升高1．1％,差异不明显。结论耐药胰腺癌细胞株的耐药性对其放射敏感性具有一定影响,胰腺癌耐药细胞株放射敏感周期G2／M期比例降低,从而导致其放射敏感性降低,耐放射性增加。     

胰腺癌细胞株耐药与凋亡相关基因的改变

目的探讨凋亡相关基因的改变与胰腺癌细胞耐药的关系。方法利用含有18000条人类基因的cDNA基因芯片对人胰腺癌细胞株SW1990及其耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的差异表达基因进行筛选。结果人胰腺癌细胞株SW1990与耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的共同差异表达基因有170条,其中6条与细胞凋亡相关。结论凋亡相关基因hSiah2、TIA1、CDC2、PDCD2、MAPK6及MAP4K3可能参与了胰腺癌耐药过程的发生,可能成为新的胰腺癌耐药相关基因。     

胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药机制的研究

目的探讨胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药的可能机制。方法以体外诱导建立的人胰腺癌耐药株SW1990/Fu为模型,通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学(ICC)方法测定耐药相关基因在SW1990/Fu产生获得性耐药前后的变化;罗丹明外排实验检测SW1990/Fu细胞膜上的P-gp泵功能。结果RT-PCR结果显示多药耐药基因1(MDR)和肺耐药相关蛋白基因(LRP)在SW1990/Fu中的表达率分别为0.97±0.23和0.95±0.34,而在SW1990中的表达率仅分别为0.67±0.19和0.53±0.16,两者差异有统计学意义(P<0.05);多药耐药相关基因(MRP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST-π)在2株细胞中的表达水平无明显变化。ICC与RT-PCR的结果一致。在罗丹明浓度为0.5mg/L时,只检测到(11.4±2.5)%的SW1990/Fu细胞内有荧光染科积蓄,在亲本细胞中罗丹明阳性细胞为(57.9±5.4)%,而在P-gp阴性的HL60细胞中,(99.5±3.3)%的细胞内存在罗丹明的积聚。当罗丹明浓度增加时,其在SW1990/Fu细胞内的积聚也明显增加。结论耐药基因MDR1和LRP表达增强可能是胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药的主要机制。     

肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药模型的建立及其耐药机制

目的 建立肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药细胞株并探讨其耐药机制.方法 通过阿霉素浓度递增筛选出SMC7721/ADM肝癌多药耐药细胞株并建立裸鼠移植瘤模型;噻唑蓝(MTr)检测各组移植瘤对化疗药物的耐药性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测MDR1和BCRP在各组移植瘤中的表达.结果 SMC7721/ADM对阿霉素,丝裂霉素,5-Fu的耐药性均较亲本细胞明显降低(P<0.01);其移植瘤对3种化疗药物的IC50.均明显低于亲本细胞(P<0.05);SMC7721/ADM细胞中MDR1 mRNA表达是亲本细胞的40.13倍(P<0.01);BCRP mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05).其移植瘤中BCRP mRNA表达是亲本细胞移植瘤的3.69倍(P<0.01);而MDR1 mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05);SMC7721/ADM细胞株中两种蛋白表达显著高于亲本细胞株(P<0.01);SMC7721/ADM移植瘤中BCRP蛋白表达显著高于亲本移植瘤(P<0.01),而两者中MDR1表达差异无统计学意义(JP>0.05).结论 MDR1和BCRP在SMC7721/ADM多药耐药的不同阶段起作用并介导肝细胞癌对不同药物的耐药性.     

应用基因芯片技术筛选胰腺癌多药耐药相关基因

目的应用基因芯片技术筛选胰腺导管腺癌（PDAC）获得性多药耐药（MDR）相关基因。方法通过含人类全基因组的寡聚核苷酸基因芯片（Affymetrix HG U133 2．0plus）筛查人胰腺癌细胞株SW1990与多药耐药细胞亚株SW1990／5-FU,SW1990／ADM和SW1990／GEM之间的表达基因差异,并进行生物信息学分析。结果与亲本株SW1990相比,3株耐药细胞亚株中表达均有差异的基因共有165条;其中上调表达基因43个,下调表达基因122个。差异表达基因的功能分类包括：抗氧化还原、细胞凋亡、细胞周期、信号转导、细胞黏附相关的基因等。聚类分析发现差异基因中的PRDX4簇、TNKS2簇及CCDC5簇可能与耐药发生密切相关。结论胰腺癌对化疗的多药耐药是复杂的多基因作用的结果。本试验初步建立了胰腺癌多药耐药发生相关的总体基因表达改变图谱,为胰腺癌多药耐药发生机制的研究提供了新的靶点。     

人结肠癌耐药细胞系SW480/ADM的建立及其生物学特性

目的　建立人结肠癌SW4 8 0耐阿霉素细胞系 (SW4 8 0 /ADM) ,研究其耐药机制及逆转。方法　应用人结肠癌细胞系SW4 8 0,以递增阿霉素 (ADM)浓度的方法,体外连续培养建成一株SW4 8 0 /ADM。观察该细胞生长规律。用MTT比色法检测该耐药细胞系的多药耐药性;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布、细胞表面多药耐药基因 (MDR)的表达产物P-糖蛋白 (P gp) 、多药耐药相关蛋白 (MRP)及谷胱甘肽硫转移系统 (GSH/GST)的表达;用高效液相色谱仪检测耐药细胞内阿霉素含量。结果　SW4 8 0 /ADM细胞与SW4 8 0细胞相比,生长缓慢,倍增时间延长,细胞周期分布发生改变;SW4 8 0 /ADM细胞较SW4 8 0的阿霉素半数抑制浓度 (IC50 )增大 1 3. 2 2倍,并对多种抗癌药物产生耐药性。SW4 8 0 /ADM细胞表面MDR的表达产物P gp,MRP和GSH/GST的表达均较SW4 8 0细胞显著升高 (P< 0. 0 1 )。SW4 8 0 /ADM细胞内阿霉素含量明显低于SW4 8 0细胞。结论　SW4 8 0 /ADM细胞对阿霉素的耐药是获得性的,并呈多药耐药性特征,可用于对人结肠癌耐药、逆转和MDR机制等方面的研究。     

Hedgehog信号通路相关蛋白在人胰腺癌SW1990耐药株中的表达及意义

目的:探讨Hedgehog信号通路蛋白在人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株SW1990中的表达,为克服胰腺癌获得性耐药提供实验基础。方法:采用浓度梯度递增法建立人胰腺癌SW1990耐药株,采用噻唑蓝法测定SW1990亲代与耐药细胞IC50。实时荧光定量PCR检测亲代与耐药细胞mRNA中hedgehog信号通路成员Shh、SMO、Gli-1的表达差异。Western印迹法检测亲代与耐药细胞中上述蛋白质的表达。结果:人胰腺癌耐药株SW1990的IC50从亲代的(3.1±0.2)μmol/L提高到(232.2±12.3)μmol/L。荧光定量PCR结果显示耐药株中Shh、Gli-1的表达提高了(12.07±1.71)倍和(4.15±0.42)倍。亲代SW1990中未检测到SMO表达,而耐药细胞中却可以检测到SMO的表达。Western印迹结果同样显示,人胰腺癌SW1990耐药细胞株中高表达上述蛋白质。结论:人胰腺癌耐药株中高表达部分hedgehog信号通路蛋白。针对hedgehog信号通路的靶向治疗可能为克服胰腺癌耐药提供新的理论基础。     

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1与胰腺癌细胞获得性耐药的关系

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶1（MKP-1）在介导胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu产生获得性耐药过程中的可能机制。方法 采用Northern印迹杂交和Western蛋白免疫印迹杂交方法,检测MKP-1在体外诱导建立的人胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu、亲本细胞株SWl990和胰腺癌细胞株MiaPaCa-2中的表达,分析MKP-1在SW1990／Fu产生获得性耐药前后的变化。结果 Northern印迹杂交结果显示,在SWl990／Fu、SWl990和MiaPaCa~细胞株中均检测到2400bp的MKP-1mRNA,MKP-1在SWl990／Fu的表达水平明显低于SWl990和MiaPaCa-2。在蛋白水平上,Western蛋白免疫印迹杂交结果也表明,与SWl990和MiaPaCa4相比,MKP-1蛋白在SWl990／Fu细胞中的表达水平明显降低。结论 MAPK家族的关键调节酶MKP-1可能参与SWl990／Fu获得性耐药的产生,推测细胞信号转导系统的改变可能是导致胰腺癌细胞产生获得性耐药的机制之一。     

吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究

目的 建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ,并探讨SW1990/GZ和胰腺癌肿瘤干细胞的相关性.方法 应用间歇浓度梯度倍增法建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ;倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法计算耐药指数(RI);荧光定量PCR检测ABCB1、ABCC1及ABCG2基因的表达水平;裸鼠皮下种植瘤试验观察SW1990和SW1990/GZ的成瘤能力;流式细胞仪通过侧群细胞(SP)法和表面特异抗原标记法(CIM4+CD24+)检测肿瘤干细胞含量.结果 在形态学上,SW1990/GZ较SW1990发生明显改变;SW1990/GZ的耐药指数是亲代SW1990的77.2倍;与亲代SW1990相比,耐药株SW1990/GZ中ABCB1、ABCC1及ABCG2的表达水平明显增高(P<0.01),裸鼠皮下成瘤能力增强(P<0.01);耐药株SW1990/GZ中SP细胞比例为(11.0±1.0)%,亲代SW1990中SP细胞比例为(4.6±0.9)%,CD44+CD24+细胞在两者中的比例分别为(8.7±0.8)%和(1.1±0.4)%(P<0.01).结论 吉西他滨耐药胰腺癌细胞株SW1990/GZ能高效富集胰腺癌肿瘤干细胞,CD44与胰腺癌获得性耐药关系密切,可能为克服胰腺癌获得性耐药提供新的治疗靶点.     

多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控

目的 检测多药耐药相关基因（MDR1）及其蛋白（P-gP）在胰腺癌细胞株的表达,初步探讨胰腺癌发生先天性耐药的机理。方法 选择8株人胰腺癌细胞株,采用RT-PCR方法检测MDR1mRNA在胰腺癌细胞中的表达;通过免疫细胞化学方法检测P-gP的表达;以流式细胞仪检测胰腺癌细胞对罗丹明的外排情况,评价P-gP泵功能;最后通过P-gP抑制物维拉帕米与化疗药物联合应用,检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MDR1mRNA在胰腺癌细胞株SW1990中的表达最高,除PCT-2未检测到MDR1的表达外,其余6株细胞均有MDR1的微弱表达;免疫细胞化学染色结果证实P-gP在SW1990中的表达明显高于其他细胞株。57．9％±5．4％的SW1990细胞内有罗丹明蓄积,而在P-gP阴性对照细胞中,99．5％±3．3％的细胞内存在罗丹明的积聚,两者差异有统计学意义（P〈0．05）。P-gP抑制物维拉帕米与阿霉素或表阿霉素联合应用时可以部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。结论 MDR1及P-gP在人胰腺癌细胞中存在一定量的表达;维拉帕米联合阿霉素可以明显抑制P-gP阳性细胞的生长。     

免疫细胞化学技术检测P－糖蛋白在人膀胱癌MDR细胞亚株中的表达

为探讨肿瘤细胞耐药性，以人膀胱癌细胞株ＢＩＵ－８７为亲本，以递增阿霉素剂量的方法，历时８个月，成功地诱导建立了一株耐药细胞亚株ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ。通过生物学鉴定发现此细胞对阿霉素的相对时受度较亲本细胞提高了６．３倍，对阿霉素类似物柔红霉素、表阿霉素及天然生物碱类抗癌药长春新碱、鬼臼乙叉甙有明显的交叉耐药性，对顺铂、丝裂霉素则无交叉耐药性。为进一步阐明其耐药机理，应用链霉亲和素－生物素免疫细胞化学技术对其耐药性进行研究发现，约７５％的ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞Ｐ－ｇｐ过表达，而亲本细胞均为阴性。由此结果表明，ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ耐药性的产生主要是由于Ｐ－ｇｐ膜泵功能增强介导产生细胞内药物外溢增多所致，是其产生耐药性的主要原因，ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ的建立为进一步针对Ｐ－ｇｐ药泵功能逆转其抗药性的研究奠定了实验基础。