B7.1/GM-CSF修饰的PC3-DC融合疫苗在体外抗肿瘤免疫效应

目的:制作B7.1/GM-CSF修饰的DC融合疫苗,并观察其在体外的特异性抗肿瘤免疫效应。方法:制备完整表达GM-CSF的PC3细胞,从前列腺癌患者外周血中分离DC,应用电融合法融合DC和GM-CSF-PC3,构建B7.1/GPI蛋白并锚定于融合细胞表面;应用免疫荧光观察融合细胞形态及锚定稳定性;流式细胞进行融合细胞表形测定;ELISA试剂盒检测IFN-γ分泌情况;MTT及LDH试剂盒测定融合细胞刺激同源异体T淋巴细胞增殖和细胞毒性效应。结果:成功制备GM-CSF-PC3细胞及B7.1/GPI蛋白, 成功分离DC并表达DC分子标记;B7.1/GM-CSF融合疫苗高表达DC分子标记及前列腺癌标记;T细胞增值实验证明融合疫苗具有强烈的免疫刺激活性;细胞毒性实验证明了融合细胞具有比对照组更有效的肿瘤杀伤作用。 结论:电融合技术可成功诱导DC与GM-CSF-PC3融合,体外试验中特定修饰的融合疫苗可显著的提升抗肿瘤免疫效应。     

四种不同尤文肉瘤树突状细胞免疫疫苗的体内外抗肿瘤免疫应答研究

目的:制备4种尤文肉瘤树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗,并比较和分析其在体内外抗肿瘤免疫反应中的效果.方法:从健康供者体中分离和培养外周血单核细胞,利用粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)和白细胞介素(interleukin-4,IL-4)将单核细胞诱生为DC,并对其表型进行流式细胞仪分析,分别制备4种DC疫苗:(1)融合瘤,将DC与A673细胞进行电融合,并通过流式细胞仪检测荧光双染色融合瘤,以确定其融合率;(2)负载肿瘤裂解物DC,将DC与A673细胞反复冻融物共培养;(3)EWS/FLI1修饰DC,用编码EWS/FLI1的腺病毒转染DC;(4)未作处理的成熟的DC.将各种DC疫苗与组织相容性白细胞抗原(histocompatibility leukocyte antigen,HLA)相配的CD8+T细胞共培养,用ELISA试剂盒检测刺激增殖细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)分泌干扰素γ(interferon γ,IFN-γ)的量,用51Cr细胞杀伤试剂盒检测CTL在不同比例下对A673细胞的杀伤作用.通过腹腔注射人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),皮下接种A673细胞,构建重建人免疫系统的SCID鼠尤文肉瘤模型,应用ELISA试剂盒检测小鼠外周血中IgG的量,以确定免疫重建效果,并接种不同的DC疫苗,检测其对小鼠成瘤的影响.结果:流式细胞术检测出从外周血单核细胞诱生出的CD83、CD80、CD86及HLA-DR高表达的成熟DC.DCs/A673融合细胞的电融合效率达到16.32%.各种DC疫苗都可以诱导出有效的抗肿瘤免疫反应,IFN-γ分泌检测显示,融合瘤组较其他DC疫苗组产生CTL水平高,其后依次为肿瘤裂解物负载组、EWS/FLI1修饰组和未作处理组.而在体外杀伤A673实验中,融合瘤组杀伤效率最高,肿瘤裂解物负载组次之,EWS/FLI1修饰组与未作处理组最低,且后两组间差异无统计学意义.在抑制肿瘤生长的体内实验中,融合瘤组小鼠肿瘤最小,EWS/FLI1修饰组、肿瘤裂解物负载组和未作处理组之间差别不大.结论:尤文肉瘤DC疫苗可以诱导有效的抗肿瘤免疫反应,将各种尤文肉瘤DC疫苗进行体内外综合比较时发现,融合瘤是最佳的尤文肉瘤免疫疫苗.     

树突状细胞-结直肠癌细胞融合疫苗的制备及生物学特性的研究

目的：研究树突状细胞（DC）与结直肠癌（Lovo）细胞融合疫苗的制备及其生物学特性。方法：①应用PEG融合技术融合树突状细胞和Lovo细胞，制备融合疫苗。②通过描记细胞生长曲线、倒置显微镜和激光共聚焦显微镜、流式细胞仪检测观察细胞生物学特性。③通过检测疫苗的克隆形成率、促进T淋巴细胞增殖能力和疫苗的成瘤活性来观察疫苗的安全性和免疫学效应。结果：融合疫苗呈悬浮生长，具有两种亲代细胞的形态结构特点，CD80、CD83、CD86等在融合细胞表面的表达较单纯DC显著丰富；融合细胞不出现明显的细胞倍增；融合疫苗在软琼脂上培养21d，未见明显的细胞克隆形成；通过^3H—TdR掺人法检测融合细胞刺激T淋巴细胞增殖情况，发现融合疫苗可强烈刺激T淋巴细胞增殖；融合疫苗接种于裸鼠体内观察30d，未见肿瘤组织生长。结论：融合细胞具有作为抗肿瘤疫苗应具备的低增殖能力和不成瘤的安全性；融合疫苗可明显促进T淋巴细胞的增殖能力说明将其作为抗结直肠癌特异性免疫治疗方法有进一步研究的意义。     

黏蛋白1(MUC1)致敏的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤实验研究

目的 研究以CpG作为免疫佐剂,应用黏蛋白1（MUC1）致敏树突状细胞（DC）制备疫苗在体外诱导的特异性抗肿瘤作用。方法 健康人外周血采用密度梯度离心法,分离外周血单核细胞（PBMC）,应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子体外培养诱导DC,观察细胞形态,并通过流式细胞术检测成熟DC细胞标志物CD80、CD86。再应用CpG作为免疫佐剂,MUC1作为抗原致敏DC制备疫苗,致敏的DC与T细胞混合培养,观察其诱导T淋巴细胞增殖能力。诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）与肿瘤靶细胞以5：1、10：1、20：1的效靶比共孵育,MTT法检测CTL杀伤活性。结果 DC表型检测结果为CD80+细胞占70.4％,CD86⁺细胞占72.0％,呈现成熟DC表型。MUC1致敏的DC疫苗与淋巴细胞混合培养显示,DC疫苗具有刺激T细胞增殖活化的作用,其中DC+CpG+MUC1组明显高于MUC1+DC或CpG+DC组,差异有统计学意义（P<0.01）。DC疫苗诱导产生的特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用较单独T细胞组或DC组明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）。并随着效靶比增大,其杀伤作用呈逐渐增强。结论 经CpG和MUC1致敏的DC疫苗在体外可诱导产生特异性抗肿瘤免疫效应。     

肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率

目的:探讨胃癌细胞抗原致敏的树突状细胞(DC)诱导T淋巴细胞(T lymphocyte)增殖和杀伤胃癌细胞的效率.方法: 应用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞,经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhlL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α),体外诱导培养获取成熟DC,流式细胞术检测DC表面CD83,CD80,CD86及HLA-DR表型;同时经重组人白细胞介素2(rhlL-2)诱导扩增T淋巴细胞,检测CD3,CD4,CD8及CD56表型.以人胃癌OCUM-2MD3细胞株冻融抗原致敏DC,然后刺激T淋巴细胞,得到肿瘤抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL).MTT法检测致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响和致敏DC活化的特异性CTL对胃癌细胞的体外杀伤效率.结果: 体外诱导人外周血单个核细胞,可获得大量形态典型、具备强烈刺激增殖能力、且高表达CD80,CD86的DC及高表达CD3的T淋巴细胞;MTT法检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC组刺激T淋巴细胞增殖指数显著高于未致敏DC组和对照组(P<0.01);流式细胞术检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC主要刺激T淋巴细胞增殖为CD8 的CTL(60.58±8.43)%,经胃癌细胞抗原致敏DC刺激后,对胃癌细胞的杀伤效应显著增加,致敏DC组对胃癌细胞杀伤活性(71.57±4.83)%,较未致敏DC组(12.53±1.62)%和单纯T淋巴细胞组(10.45±1.40)%作用更为显著(P<0.01),而且随着效靶比增加,其杀伤效应亦显著增加.结论: 胃癌细胞抗原致敏DC可显著刺激T淋巴细胞增殖为CD8 CTL,进而发挥其高效杀伤胃癌细胞的作用.     

SOCS1 受抑的新型肝癌树突状细胞疫苗制备及功效的初步研究

目的探讨抑制SOCS1表达对LIGHT激活的肝癌树突状细胞疫苗效应的作用。方法用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞(BMDC),体外负载肝癌细胞HepA可溶性抗原,并用LIGHT和SOCS1反义寡核苷酸(AS1)处理DC,制备负载肝癌抗原DC疫苗;流式细胞仪检测疫苗细胞CD40及CD86表达和ELISA测定其IL-12、IL-1分泌水平以确定DC疫苗细胞的成熟度;通过体外细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性、淋巴细胞增殖反应和IL-6、TNF-β分泌水平测定分析疫苗细胞的抗肿瘤免疫应答。结果负载肝癌抗原DC疫苗在LIGHT和AS1的双重作用下,疫苗细胞的成熟标志CD40、CD86、IL-1和IL-12增高(P<0.01),能增强诱导CTL活性、刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-6、TNF-β能力(P<0.01)。结论抑制SOCS1能提高肝癌DC疫苗的成熟度,并增强疫苗细胞诱导抗肿瘤免疫应答。     

肝癌细胞HepG2与肝癌患者树突状细胞融合瘤苗的体外效应

目的将肝细胞癌(HCC)患者树突状细胞(DCs)与肝癌细胞HepG2融合制备瘤苗,检测其体外诱导同源T细胞产生特异性抗HepG2的免疫效应.方法以血细胞分离机分离富集HCC患者外周血单个核细胞(PBMCs),应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhlL-4)体外诱导培养DCs;聚乙二醇融合DCs与肝癌细胞HepG2,MTT法测定融合细胞(DCs/HepG2)刺激同源T淋巴细胞增殖分化能力,细胞毒性实验检测DCs/HepG2诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HepG2的特异性杀伤作用.结果融合细胞DCs/HepG2高表达成熟DC表面分子,其中CD8390.4%,CD8087.7%,CD8684.4%,HLA-DR98.5%;其刺激同源T淋巴细胞增殖的能力显著高于HepG2和DCs;DCs/HepG2活化的CTL对HepG2具有显著杀伤作用,其杀伤率为(63.5±4.6)%(效靶比例为20∶1).结论HCC患者外周血DC融合HepG2细胞可有效诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫效应,可能成为HCC免疫治疗的有效途径.     

树突状细胞的诱导及抗肿瘤作用探讨

目的：从人外周血诱导树突状细胞（DC）,分析其免疫学特性及抗肿瘤作用。方法：分离人外周血DC前体细胞,采用rhGM-CSF、rhIL-4和肿瘤抗原联合诱导,分析DC表型,采用混合淋巴细胞反应检测DC激发T淋巴细胞增殖能力;乳酸脱氢酶4h释放法检测肿瘤抗原致敏DC与CD3AK混合物的杀瘤活性。结果：DC前体细胞经rhGM—CSF、rhIL-4和肿瘤抗原共同诱导2周,可获得大量成熟DC,其中第7～15天,DC增殖最明显。至第15天,DC纯度达90％以上。DC具有典型的树突状或裙褶样突起,高表达CD86、CD40、HLA—DR、CD83、CDIa分子,能强烈刺激T淋巴细胞增殖。CD3AK细胞与肝癌抗原致敏DC的混合物具有很强的杀伤BEL-7402肝癌细胞的作用,杀伤率显著高于CD3AK细胞（P〈0．01）。结论：可从人外周血诱导培养获得大量功能成熟的DC,能激活T淋巴细胞增殖和显著增强CD3AK细胞的抗肿瘤活性。     

SOCS1受抑的新型肝癌树突状细胞疫苗制备及功效的初步研究

目的探讨抑制SOCS1表达对LIGHT激活的肝癌树突状细胞疫苗效应的作用。方法用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞（BMDC），体外负载肝癌细胞HepA可溶性抗原，并用LIGHT和SOCS1反义寡核苷酸（AS1）处理DC，制备负载肝癌抗原DC疫苗；流式细胞仪检测疫苗细胞CD40及CD86表达和ELISA测定其IL-12、IL-1分泌水平以确定DC疫苗细胞的成熟度；通过体外细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性、淋巴细胞增殖反应和IL-6、TNF-β分泌水平测定分析疫苗细胞的抗肿瘤免疫应答。结果负载肝癌抗原DC疫苗在LIGHT和AS1的双重作用下，疫苗细胞的成熟标志CD40、CD86、IL-1和IL-12增高（P〈0．01），能增强诱导CTL活性、刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-6、TNF-β能力（P〈0．01）。结论抑制SOCS1能提高肝癌DC疫苗的成熟度，并增强疫苗细胞诱导抗肿瘤免疫应答。     

不同大肠癌细胞裂解物负载健康人外周血DC瘤苗的体外试验研究

目的探讨3种大肠癌肿瘤细胞裂解物负栽的健康人外周血树突状细胞（DC）刺激同体和异体T淋巴细胞增殖活化的作用。方法对血站来源的健康人外周血采用密度梯度离心法,分离获得DC前体细胞,用临床应用药物GM—CSF、TNF—a和试验用试剂rhlL-4联合诱导培养扩增Dc,制备3种大肠癌细胞裂解物,体外致敏DC,显微镜观察Dc形态演化过程,电镜拍摄微观形态特征,流式细胞仪鉴定DC表型,ELlSA法检测肿瘤抗原致敏DC分泌IL-12水平,检测致敏DC刺激T淋巴细胞分泌的IL—lO和IF阿7水平,3H—TdR法检测成熟DC（mDC）诱导同体和异体T淋巴细胞增殖能力。结果DC形态学呈现典型树突状分化特征,mDC表达特征性免疫表型CDla、CD83,共刺激分子CD86、HLA—DR,分泌高水平IL—12,mDC与同体和异体T淋巴细胞共培养均能有效刺激T淋巴细胞增殖活化,T淋巴细胞不分泌IL-10,分泌较高水平IFN-了,3W480细胞株在各项指标上都具优势,3H—TdR法检测提示mDC不仅可以刺激同体淋巴细胞增殖,同样有效激活异体T淋巴细胞。结论来源于血站的健康人外周血是-种方便的DC前体细胞原料。联合细胞因子的培养方法可以成功诱导出成熟的DCl型细胞,引起Thl型细胞免疫反应;3种大肠癌肿瘤细胞裂解物,尤其是Sw480细胞株裂解物抗原性质稳定,能够有效促进DC分化,提高DC成熟度;负载裂解物的DC不仅刺激同体T淋巴细胞增殖,也可有效激活异体T淋巴细胞增殖,因此应用健康人异体来源的DC瘤苗刺激患者T淋巴细胞增殖,从而产生抗肿瘤免疫反应的设想是可行的。     

MAGE-A3抗原肽负载树突状细胞诱导乳腺癌患者免疫应答的研究

目的研究MAGE-A3抗原肽负载对乳腺癌患者树突状细胞(DC)的功能的影响,探讨其是否可以在体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答.方法体外培养HLA-A2乳腺癌患者外周血来源的DC,并经孵育携带MAGE-A3抗原肽,用以刺激CTL,用3H-TdR渗入法检测抗原肽负载前后DC刺激同种淋巴细胞增殖能力(MLR),并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL对靶细胞的杀伤效应.结果DC:T为1:10时,单纯DC组刺激能力显著高于抗原肽负载组DC(DC-P)(P＜0.05),但当DC:T低于1:20时后DC-P组刺激能力显著强于单纯DC组(P＜0.05).DC-P组和单纯DC组所激发的CTL对细胞株MCF-7,Sk-Br-3,MDA-MB-435s的杀伤活性有显著性差异,而对细胞株Raji无显著性差异,DC-P组对细胞株MCF-7,Sk-Br-3,MDA-MB-435s的杀伤活性明显高于对细胞株Raji的杀伤活性.结论负载MAGE-A3抗原肽的DC在体外可以诱导乳腺癌患者特异性的CTL免疫应答,为临床以DC为基础的过继免疫治疗的应用提供理论基础.     

用于活体成像的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建

目的构建能稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系以建立可用于活体成像的三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤模型。方法采用磷酸钙共沉淀的方法构建表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,体外感染MDA-MB-231细胞,经G418筛选得到稳定细胞系后,通过活体成像评价感染后细胞表达荧光素酶的情况,并通过MTT法、transwell肿瘤侵袭模型、细胞划痕实验等评价细胞的增殖、侵袭及转移能力是否改变;此外将细胞接种至雌性BALB/c-nu//nu裸小鼠的右侧第2对乳房垫内,构建乳腺癌原位肿瘤模型。利用活体成像系统监测体内肿瘤的生长及转移情况,并通过冰冻切片、HE染色评价细胞系在活体内的稳定性及成瘤能力。结果成功构建能稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的MDA-MB-231细胞系,荧光素酶的活性达到每细胞9689 photons/s,慢病毒的整合没有改变细胞的增殖、迁移及侵袭能力;成功建立了乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型。结论(1)慢病毒以其高效稳定的感染率,应作为标记荧光素酶基因的首选载体;(2)带有荧光素酶的MDA-MB-231细胞在动物体内可被快速而灵敏的检测到,这将为人三阴性乳腺癌转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供一个直观、方便及灵敏的平台;(3)荧光素酶和荧光蛋白基因双标记优于单标记。     

RSRC2影响三阴性乳腺癌细胞增殖迁移及侵袭的初步研究

目的:探究富含精氨酸/丝氨酸卷曲螺旋2（RSRC2）对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法:将RSRC2过表达、降表达和空载体质粒通过慢病毒包装转染至三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中,通过Western blot检测转染效果,通过Transwell 迁移实验、侵袭实验、划痕实验检测RSRC2对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭能力的影响,通过平板克隆形成实验检测RSRC2对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。结果:Western blot结果显示RSRC2过表达和降表达质粒成功转染至MDA-MB-231细胞中,Transwell迁移实验、侵袭实验、划痕实验、平板克隆实验显示,RSRC2过表达的MDA-MB-231细胞其迁移、侵袭及增殖能力减弱,RSRC2降表达的MDA-MB-231细胞其迁移、侵袭及增殖能力增强（均P<0.05）。结论:RSRC2在三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭过程中起着重要的负调控作用。     

IL-15对体外培养的DC致敏的T淋巴细胞的作用研究

目的 通过与IL-2进行比较,观察IL-15激活T细胞反应,增强DC细胞疫苗抗肿瘤的免疫反应.方法 将骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）皮下注射小鼠作为初次免疫,14d后取小鼠脾脏,制备淋巴细胞,与细胞因子（IL-2、IL-15）和BMDCs共同培养作为再次免疫,产生细胞毒T淋巴细胞（CTL）.流式细胞术检测细胞因子（IL-2或IL-15）联合BMDCs刺激小鼠淋巴细胞CD62L、CD69、CD44的表达情况;采用Cr51释放实验检测CTL对Levis肺癌细胞的杀伤作用;采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）检测分泌干扰素γ（IFN-γ）细胞亚群比例.结果 IL-15联合BMDCs疫苗上调CD8＋T细胞表达CD69＋、CD44＋,增强对肿瘤细胞的杀伤活性,并能产生更多的IFN-γ分泌细胞.结论 IL-15可能较IL-2更能增强DC疫苗抗肿瘤的免疫反应,为IL-15和DC疫苗的联合免疫治疗提供重要的试验依据和临床前研究的理论基础.     

抑制NBS1表达对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响

目的 探讨siRNA抑制NBS1基因表达对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。方法通过构建NBS1干扰质粒和阴性空载质粒,并通过腺病毒载体感染MDA-MB-231细胞,Western印迹法明确NBS1基因受干扰情况;CCK-8法检测转染质粒后对MDA-MB-231细胞体外增殖能力的影响;流式细胞法检测感染后实验组和阴性对照组MDA-MB-231细胞的凋亡情况。结果 Western印迹法检测结果表明实验组NBS1蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);CCK-8实验结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组细胞增殖能力受到抑制(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示,实验组较阴性对照组凋亡率上升(P<0.05)。结论抑制NBS1基因的表达可以抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,并促进癌细胞的凋亡。     

人源性荷三阴乳腺癌NOD/SCID小鼠模型建立及其免疫应答

目的建立具有人免疫学特征的NOD/SCID小鼠模型,并观察其对三阴乳腺癌的免疫应答。方法筛选无免疫渗漏NOD/
SCID小鼠24只,分成4组,免疫重建组提前3 d腹腔注射250 mg/kg环磷酰胺（CTX）,后经腹腔注射健康人外周血单个核细胞
（PBMC）同时背部皮下接种人三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231;单纯免疫组只注射CTX 及PBMC;单纯荷瘤组只接种
MDA-MB-231;空白对照组不作任何处理。定期观察各组小鼠生物学及免疫学特征。结果免疫荷瘤组成瘤潜伏期（10~12 d）
较单纯荷瘤组（8~10 d）延长,肿瘤生长速度减缓,第5周末肿瘤体积分别为1244.82±792.82 mm3和4308.77 mm3（P<0.01）,生存
率提高（P<0.01）。接受免疫重建的小鼠外周血人IgG于第2周即可测到,并逐渐上升,较未接受免疫重建小鼠差异有统计学意
义（P<0.01）。外周血中CD3+细胞比例于第2周逐渐下降,但于第9周仍可测到。第9周小鼠脾脏细胞中CD3+T细胞比例高达
55.3%（免疫荷瘤组）及52.7%（单纯荷瘤组）。免疫荷瘤组小鼠脾指数9.64 mg/g明显高于单纯免疫组3.82±0.31 mg/g及空白对
照组1.51±0.14 mg/g。结论成功构建稳定的具有人免疫学特征的NOD/SCID小鼠模型,并观察到其对三阴乳腺癌产生免疫应
答,可为三阴乳腺癌免疫治疗研究提供较为理想的动物模型。
     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的 探讨体外经角蛋白19(K19)致敏的树突状细胞(DC)诱导的细胞毒T细胞(CTL)对MCF-7细胞株的抑瘤作用。方法 经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,³H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,⁵¹Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性。结果 外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高(P<0.01)。在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性(P<0.01),且随着效靶比增加,杀伤作用增强(P<0.01)。结论 DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强。     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的探讨体外经角蛋白19（K19）致敏的树突状细胞（DC）诱导的细胞毒T细胞（CTL）对MCF-7细胞株的抑瘤作用.方法经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,3H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,51Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性.结果外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高（P＜0.01）.在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性（P＜0.01）,且随着效靶比增加,杀伤作用增强（P＜0.01）.结论DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强.     

VEGF通过激活ERK/MAPK通路促进三阴性乳腺癌肿瘤干细胞的形成

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）对三阴性乳腺癌肿瘤干细胞的调控作用并探索其作用机制。方法 通过Oncomine数据库、UALCAN数据库及Human Protein Atlas数据库分别验证VEGF在乳腺癌中的表达情况,分析VEGF表达与不同分子亚型的关系,利用在线数据库分析VEGF的表达情况与乳腺癌预后的关系。选取三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞,加入外源性hVEGF165通过体外微球形成实验观察体外成球能力,并利用Western blot、RT-qPCR等方法检测肿瘤干细胞相关标志物CD44、c-Myc、Nanog、ALDH1的表达以及相关通路的激活情况。结果 利用Oncomine、UALCAN、HPA数据库分析显示,VEGF在乳腺癌中表达较癌旁组织增高（P<0.0001）,其表达与分子亚型相关,三阴性乳腺癌中VEGF表达显著升高。Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果提示高表达VEGF的乳腺癌患者预后更差,总生存期OS缩短,差异具有统计学意义（P<0.0001）。与VEGF低表达患者相比,VEGF高表达的乳腺癌患者无进展生存期、无远处转移生存期以及复发后生存期均显著缩短,差异具有统计学意义（P<0.0001）。体外实验发现加入外源性的hVEGF165后三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的成球能力显著增强,差异具有统计学意义（P=0.0029）。Western blotting、RT-qPCR结果表明乳腺癌MDA-MB-231微球体中VEGF/NRP-1及肿瘤干细胞相关标志物CD44、Nanog、c-Myc的表达量显著升高。加入外源性的hVEGF165促进了肿瘤干细胞相关标志物CD44、c-Myc、Nanog及ALDH1的表达,而CD24的表达量则显著下降,上述作用具有时间依赖性。Western blotting实验提示加入外源性的hVEGF165能够激活三阴性乳腺癌细胞ERK/MAPK通路。 结论 VEGF可能通过激活ERK/MAPK通路促进了三阴性乳腺癌肿瘤干细胞的形成。