冻干重组人三突变型HIF-1α腺病毒生物学效应考察

目的研究冻干对重组人三突变型HIF-1α腺病毒(Ad-HIF-1α-564/402/803)生物学效应的影响。方法将前期构建的Ad-HIF-1α-564/402/803在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化,X-Gal染色法测定重组腺病毒转染效率,在适宜的条件下制成冻干剂。采用MTS试剂盒观察冻干前后Ad-HIF-1α-564/402/803对hMVECs增殖的影响。分别在冻干前、冻干后1 d、6月、12月四个时间点提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定重组人三突变型HIF-1α腺病毒基因;并在4个时间点以Ad-HIF-1α-564/402/803转染hMVECs,提取蛋白进行western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果 X-gal染色显示MOI为100pfu/cell时,转染效率趋于稳定。冻干前后重组人三突变型HIF-1α腺病毒对hMVECs增殖影响无显著差异(P>0.05)。经PCR及基因测序鉴定,在四个时间点,腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或突变,HIF-1α蛋白表达无差异(P>0.05)。结论冻干能够长期保持重组人三突变型HIF-1α腺病毒的高生物活性。     

突变型HIF-1α基因对人骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

目的 探讨突变型低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）基因对体外诱导环境人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells ,hMSCs）分化成心肌样细胞(cradiomyocyte-like)过程中的影响。方法 重组腺病毒Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402和Ad-HIF-1α564/803以最佳转染复数转染体外5-氮胞苷（5-azacytidine, 5-aza）诱导的hMSCs,诱导培养后第4周,提取细胞浆蛋白,一步法酶联免疫分析检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量;Western blot测定HIF-1α及VEGF蛋白表达水平。结果 5- aza诱导hMSCs第4周cTnI值 ：Ad-HIF-1αnature(0.426 ±0.001)、Ad-HIF-1α564(0.424±0.002)、Ad-HIF-1α564/402 (0.428±0.005)、Ad-HIF-1α564/803（0.441±0.003）、空白组（0.411±0.010）、Ad-LacZ（0.410±0.016）,各实验组有显著性差异（P<0.05）;Ad-HIF-1α564/803 组cTnI表达高于Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402三组（P<0.05）。Western blot结果显示Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402和Ad-HIF-1α564/803 四组HIF-1α及VEGF蛋白表达水平均较Ad-LacZ组高,有显著性差异（P=0.000）, 但Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402和Ad-HIF-1α564/803 与Ad-HIF-1αnature相比,各组间两种蛋白表达均无显著性差异(P<0.05)。结论 野生型HIF-1α 基因及突变型能促进5-aza诱导的hMSCs向心肌样细胞转化,为HIF-1α及hMSCs 在心肌再生中的联合应用奠定了实验基础。     

重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α对血管新生的影响

目的 研究重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(Ad-HIF-1α-Ala564-Ala402-Ala803,简称Ad-HIF-1α-564/402/803)对体外血管新生的影响.方法 将前期构建的Ad-HIF-1α-564/402/803在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化,终点稀释法测定病毒滴度,提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定三突变型HIF-1α基因;X-GaI染色法测定重组腺病毒转染效率;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null分别转染hMVECs后,观察hMVECs在Matrigel上毛细血管管腔样结构的形成情况;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null和PBS分别转染鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型后,利用Image Pro Plus6.0软件收集数据并计算各组CAM血管面积比.结果 经PCR及基因测序鉴定,扩增纯化后的腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异,病毒滴度达10 11～10 12PFU/ml;X-gal染色显示MOI为100 pfu/cell时,转染效率趋于稳定;Ad-HIF-1α-564/402/803转染hMVECs后Matrigel上的管腔数目显著多于Ad-HIF-1α-nature组、Ad.Null及对照组;基因转染CAM 72h后,Ad-HIF-1α-564/402/803组CAM上微小血管数目较Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组明显增多;Ad-HIF-1α-564/402/803组血管面积比与Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组相比,差异有统计学意义(P值分别为0.01、0.000、0.000).结论 Ad-HIF-1α-564/402/803能明显促进hMVECs毛细血管管腔样结构的形成,同时可以促进CAM模型上微小血管新生,证实了Ad-HIF-1α-564/402/803在常氧情况下对血管新生有一定的促进作用.     

不同HIF-1α基因诱导人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的效能差异

目的 研究腺病毒介导的野生型及突变型低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1 α)基因诱导人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)向心肌细胞(cardiomyocyte)分化过程中的效能差异.方法 重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1αnative、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402及Ad-HIF-1 α564/803分别以最佳转染复数转染体外5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导的hMSCs,于诱导培养后第6周提取细胞浆蛋白,应用酶联免疫分析检测法或Western blot检测法分别测定其中的心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、HIF-1α、VEGF及Nkx2.5蛋白表达水平.结果 经5-aza诱导hMSCs第6周cTnI值为:对照组(0.700±0.013)、Ad-LacZ组(0.702±0.006)、Ad-HIF-1αnative组(0.729±0.004)、Ad-HIF-1 α564组(0.741±0.008)、Ad-HIF-1 α564/402组(0.764±0.009)及Ad-HIF-1α564/803组(0.804±0.021),各实验组cTnI表达差异有统计学意义(P＜0.05),其中尤以Ad-HIF-1 α564/803组cTnI表达水平最高,与前述其它各组相比差异有统计学意义(P值均＜ 0.05).Western blot结果显示:与Ad-LacZ组相比,Ad-HIF-1αnative组、Ad-HIF-1 α564组、Ad-HIF-1 α564/402组、Ad-HIF-1 α564/803组HIF-1α、VEGF及Nkx2.5蛋白均升高(P＜0.05),其中以Ad-HIF-1 α564/402组HIF-1α蛋白表达水平最高(P值均＜0.05),以Ad-HIF-1 α564/803组VEGF及Nkx2.5蛋白表达水平最高(P＜0.05).结论 野生型及不同突变型HIF-1α基因均可促进hMSCs向心肌细胞分化,尤以Pro564Asn803双突变型HIF-1α基因(HIF-1α564/803)作用最强.     

HIF-1α基因转录活性位点在人骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞中的作用

目的研究HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因转录活性位点—Asn803位点在人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)分化成心肌细胞中的作用。方法重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1αnative、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402及Ad-HIF-1α564/803分别以最佳转染复数转染体外5-氮胞苷(5-azacyti-dine,5-aza)诱导的hMSCs,于诱导培养后第6周:(1)提取细胞浆蛋白,应用酶联免疫分析检测心肌肌钙蛋白I(cT-nI)含量,Western blot测定HIF-1α及VEGF蛋白表达水平;(2)更换含有120μmol/L姜黄素的心肌细胞诱导液培养1h,后用心肌细胞诱导液继续培养11h,接着用RT-PCR检测细胞中VEGF mRNA表达水平的变化。结果经5-aza诱导hMSC s第6周后,与Ad-LacZ组、Ad-HIF-1αnative组、Ad-HIF-1α564组及Ad-HIF-1α564/402组相比,Ad-HIF-1α564/803组cTnI、VEGF表达水平最高,与前述其它各组相比差异有显著性(P值均<0.05)。经120μmol/L姜黄素抑制后VEGF mRNA表达水平较未抑制组平均减少了(50.9±4.6)%。然而,在CBP/p300活性受同等抑制条件下,Pro564Asn803双突变型HIF-1α基因组VEGF mRNA表达水平虽然较未抑制组减少了约40%,但仍显著高于Pro564单突变型HIF-1α基因组(P<0.05)。结论 HIF-1α基因转录活性位点(Asn803)在HIF-1α促进hMSCs向心肌细胞分化中起关键作用。     

腺病毒介导的HIF-1α基因对人骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞的影响

目的研究腺病毒介导的野生型及突变型低氧诱导因子lot（hypoxia induciblef actor—1α,HIF—1α）基因对体外诱导环境人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）分化成心肌细胞（cardiomyocyte）中的作用。方法重组腺病毒Ad—LacZ、Ad—HIF—1αnative、Ad—HIF—1αAd—HIF—1α564/402及Ad—HIF—1α564/803分别以最佳转染复数转染体外5-氮胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导的hMSCs,于诱导培养后第6周提取细胞浆蛋白,应用酶联免疫分析检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量,Westernblot测定HIF-1α、VEGF及Nkx2．5蛋白表达水平。结果经5-aza诱导hMSCs第6周cTnI值为：对照组（0．700-＊-0．013）、Ad—LacZ组（0．702±0．006）、Ad—HIF-1αnative组（0．729±0．004）、Ad—HIF—1α564组（0．741±0．008）、Ad—HIF—1α564/402组（0．764±0．009）及Ad—HIF—1α564／803组（0．804±0．021）,各实验组cTnI表达差异有显著性（P〈0．05）,其中尤以Ad-HIF—1α564/803,组cTnI表达水平最高,与前述其它各组相比差异有显著性（P值均〈0．05）。Westemblot结果显示：与Ad—LacZ组相比,Ad—HIF—1αnative组、Ad—HIF—1α564组、Ad-HIF-1α564/402组、Ad-HIF-1α564,803组HIF-1α、VEGF及Nkx2．5蛋白均明显升高（P〈0．05）,其中以Ad—HIF-1α564/402组HIF—1α蛋白表达水平最高（P值均〈0．05）,以Ad—HIF—1α564／803组VEGF及Nkx2．5蛋白表达水平最高（P〈0．05）。结论野生型及突变型HIF-1α基因均可促进hMSCs向心肌细胞分化,且HIF—1α564/803突变型作用最强。     

突变型HIF—1α基因对人骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响术

目的探讨突变型低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor—1α,HIF-1α）基因对体外诱导环境人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）分化成心肌样细胞（cardiomyocyte—like）过程中的影响。方法重组腺病毒Ad—HIF-1αnature、Ad—HIF-1α564、Ad—HIF-1α564／402和Ad—HIF—1α564／803以最佳转染复数转染体外5-氮胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导的hMSCs,诱导培养后第4周,提取细胞浆蛋白,一步法酶联免疫分析检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量;Western blot测定HIF-1α及VEGF蛋白表达水平。结果5-aza诱导hMSCs第4周cTnI值：Ad—HIF—1αnature（0．426&#177;0．001）、Ad—HIF—1α564（0．424&#177;0．002）、Ad—HIF—1α564／402（0．428&#177;0．005）、Ad—HIF—1α564/803（0．441&#177;0．003）、空白组（0．411&#177;0．010）、Ad—LacZ（0．410&#177;0．016）,各实验组有显著性差异（P〈0．05）;Ad—HIF—1α564/803组cTnI表达高于Ad—HIF—1α nature、Ad—HIF-1α564/803、Ad—HIF-1α564/803三组（P〈0．05）。Western blot结果显示Ad—HIF—1αnature、Ad—HIF—1α564、Ad—HIF—1α564／402和Ad—HIF-1α564／803四组HIF-1α及VEGF蛋白表达水平均较Ad—LacZ组高,有显著性差异（P=0．000）,但Ad—HIF-1α564、Ad—HIF-1α564／402和Ad—HIF-1α564／803与Ad—HIF-1αnature相比,各组间两种蛋白表达差异均无显著性（P〉0．05）。结论野生型HIF-1α基因及突变型能促进5-aza诱导的hMSCs向心肌样细胞转化,为HIF-1α及hMSCs在心肌再生中的联合应用奠定了实验基础。     

重组腺病毒突变型人低氧诱导因子1α对细胞凋亡调节机制的研究

目的 研究重组腺病毒突变型人低氧诱导因子1α(Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803)对细胞凋亡的调节机制.方法 将重组腺病毒Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803和对照病毒Ad-lacZ感染常氧下LoVo细胞.荧光定量PCR检测不同时间点HIF-1α,p21WAF1/CIP1的mRNA表达水平,Westernblot检测HIF-1α,p21WAF1/CIP1的蛋白表达水平,及Hoechst染色检测loVo细胞的凋亡率.结果 Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803感染LoVo细胞后随着HIF-1αmRNA和蛋白表达水平的增高.p21WAF1/CIP1的mRNA和蛋白表达水平也相应增高,Hoechst染色示Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803组细胞的凋亡率(16.2%)gq显高于对照组(5.5%)(P=0.00).结论 HIF-1α可通过上调p21WAF1/CIP1的表达,诱导细胞周期停滞,促进细胞凋亡.     

腺病毒介导突变体HIF-1α基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察突变体HIF-1α基因在体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)内的表达以及对其增殖的影响.方法 以LacZ为对照,用野生型HIF-1α、单突变体HIF-1α564和双突变体HIF-1α564 803转染体外培养的大鼠VSMCs,Western blot测定HIF-1α蛋白表达:MTS/PES法确定大鼠VSMCs的增殖状态.结果 Western blot结果显示以LacZ组的密度扫描结果为1,HIF-1α564(3.284±0.582),HIF-1α564 803(4.026±0.445)与野生型HIF-1α(2.429±0.765)相比差异有显著性(P＜0.05),HIF-1α564与HIF-1α564 803组之间差异无显著性(P＞0.05).MTS/PMS比色结果显示:转染的第1天HIF-1α(0.242±0.020),HIF-1α564(0.234±0.021),HIF-1α564 803(0.223±0.020)3组均可抑制VSMCs增殖,与对照LacZ组(0.256±0.020)相比差异有显著性(P＜0.05),但是各组间差异无显著性(P＞0.05).转染第3,5,7天HIF-1α564,HIF-1α564 803组较HIF-1α组相比,差异有显著性(P＜0.05),尤以HIF-1α564 803组抑制大鼠VSMCs增殖能力最显著(P＜0.05).第7天HIF-1α564 803组Hoechst 33258与TUNEL双重荧光染色提示大鼠VSMCs发生了凋亡.结论 腺病毒介导的突变体HIF-1α基因能抑制大鼠VSMCs的增殖,突变体较野生型HIF-1α抑制作用更强,且双突变体HIF-1α564 803能诱导大鼠VSMCs发生凋亡.     

人3突变型低氧诱导因子1 α真核表达载体和腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的为了深入研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用,构建人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。方法双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,凝胶回收前者酶切片段中大小为300bp的小片段及后者酶切片段中大小为6300bp的大片段,并将两者连接,重组成3突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803,并进行酶切和PCR鉴定。鉴定正确后,采用分子克隆技术,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组3突变型穿梭载体,获得含有3突变型HIF-1α(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架载体Adeno-XTM Viral DNA连接,重组成3突变型腺病毒载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803),再进行酶切及测序鉴定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组3突变型真核表达载体和腺病毒表达载体质粒构建成功。结论成功构建重组人3突变型低氧诱导因子1α真核表达载体(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)和人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。     

不同位点诱变体低氧诱导因子1 α的动物在体表达比较

目的 探讨不同位点诱变体低氧诱导因子1α(HIF-1α)(Ad-H564、Ad-H564/402和Ad-H564/803转染大鼠急性下肢缺血模型后,骨骼肌中HIF-1α的核酸及蛋白表达.方法 建立大鼠急性下肢缺血模型,随机分6组,在骨骼肌中分别注入对照基因Ad-lacZ、野生型HIF-1α基因(Ad-H0)、(Ad-H564、Ad-H564/402和Ad-H564/803和生理盐水(NS),于第1,3,5,7 d处死动物,RT-PCR检测骨骼肌中HIF-1α mRNA的表达,免疫组化法测7 d HIF-1α蛋白表达和28 d的毛细血管密度.结果 3种突变体HIF-1α基因组的HIF-1α mRNA表达均高于Ad-H0组(F=99.380,P=0.000);以7 d的表达量最高(F=24.942,P=0.000);各突变体HIF-1α基因组间相比,以Ad-H564/402组表达量最高,Ad-H564/803组为次,再次为Ad-H564组.各突变体HIF-1α基因组7 d的骨骼肌组织间及间质组织中均可见明显的HIF-1α蛋白表达阳性细胞,28 d均可见明显的CD31蛋白表达阳性细胞.以Ad-H564/803组最为密集,与对照组差异显著.结论 外源性人突变体HIF-1α基因Ad-H564、Ad-H564/402、Ad-H564/803均可促进骨骼肌组织中的HIF-1α核酸及蛋白表达,并促进毛细血管新生,且较Ad-H0的作用更强.各突变体基因组间相比较,Ad-H564/402组HIF-1α mRNA的表达最强,Ad-H564/803组的蛋白表达及促毛细血管新生作用最强.     

氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响

目的 对已构建的突变型人低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala(单突变)和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala(双突变)进行进一步的功能鉴定.方法 将pcDNA3.1+/HIF-1α、pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala分别用脂质体法短暂转染人胚肾上皮细胞(human embryo kidney 293,HEK293);Western blotting法检测正常氧、低氧无钙离子或有钙离子条件下各组转染细胞HIF-1α蛋白水平:RT-PCR法检测正常氧条件各组转染细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达.结果 正常氧条件下,转染突变体的细胞较转染野生型HIF-1α载体的细胞HIF-1α蛋白和VEGFmRNA水平增高;低氧条件下,转染野生型HIF-1α载体的HEK293细胞HIF-1α蛋白水平增高:Ca~(2+)刺激减少低氧时转染野生型HIF-1α载体细胞HIF-1α蛋白水平,但对转染突变体细胞HIF-1α蛋白水平无明显影响.结论 pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala两种突变体产物在蛋白水平上具耐氧和耐蛋白酶降解的特性.

Abstract：

Objective To study the effects of oxygen and calcium on the expression of eukaryotic vectors harboring wild-type or mutated hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in HEK293 cells.Methods HEK293 cells were transiently transfected with pcDNA3.1+/HIF-1α,pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala via lipofectin.Western blotting were used to detect HIF-1α protein after normoxic or hypoxic exposure of the transfected HEK293 cells in the presence or absence of Ca~(2+).The levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA in the transfected cells in normoxic condition was detected using RT-PCR.Results The levels of HIF-1α protein and VEGF mRNA increased in HEK293 cells transfected with the vectors harboring mutated HIF-1α, but not in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors in normoxia.Hyooxia increased the levels of HIF-1α protein in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors,which was inhibited by the application of Ca~(2+). Ca~(2+) showed no inhibitory effect on HIF-1α levels in HEK293 cells transfected with the vectors containing mutated HIF-1α. Conclusion The protein products of pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala in HEK293 cells enhance the cell tolerance to oxygen and protease.     

人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人双突变型HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒表达载体,研究人双突变型低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用.方法 在业已完成的pShuttle2-HIF-1α-Ala564的基础上,用PCR定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-lα-Ala402-Ala564,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒连接,重组成pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为重组Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒.结果 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功.结论 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564(双突变型),为冠心病的突变型HIF-1α基因治疗研究奠定基础.     

人突变型低氧诱导因子1α对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响

目的:探讨564与402双位点突变的HIF-1α基因(Ad-HIF-1α-564Ala-402Ala,简称Ad-H564/402)在大鼠下肢急性缺血模型中的表达及对血管新生的影响.方法:①将先期构建的Ad-H564/402在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化.用电子显微镜、PCR及测序的方法鉴定并用分光光度计法测定病毒滴度;②构建急性大鼠下肢缺血模型,随机分为4组,分别以Ad-LacZ,Ad-H0,Ad-H564/402和生理盐水(NS)转染术侧下肢骨骼肌,于转染后1,3,5,7 d,应用RT-PCR测定骨骼肌中HIF-1α mRNA的表达量;③基因转染后28 d,选择性下肢动脉造影及血管铸型观察血管密度.结果:①经扩增、纯化后基因突变区信息保存完好,最终滴度达到(6.29±0.26)×1014OPU(optical particle u-nit,光学颗粒单位)/L.②突变体基因Ad-H564/402的相对表达量高于野生型HIF-1α基因(P=0.000);且以第7日最高(P=0.000);经两两比较,不同基因组间及不同转染天数间的表达量均有显著的统计学差异(P=0.000).③基因转染28 d后造影及血管铸型结果显示:Ad-H564/402组的绒毛小血管数大于Ad-H0组及其他各组.结论:①外源性突变体Ad-H564/402基因可促进体内HIF-1α mRNA的表达.②外源性突变体Ad-H564/402基因可促进缺血骨骼肌的侧支血管形成及微血管新生.③突变体Ad-H564/402基因的生物学功能较野生型基因Ad-H0更强.     

人三突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的：为了深人研究人低氧诱导因子1α（HIF-1α）基因对冠心病患者的血管新生作用，构建人三突变型HIF-1α真核表达载体（pShuttle2-HIF-1α-A1a4O2-Ala564-Ala803）。方法：双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-A1a564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803，胶回收前者酶切片段中300bp的小片段及后者6300bp的大片段，并将两者连接，重组成三突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，并进行酶切和PCR鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组三突变型穿梭质粒构建成功。结论：成功构建重组人三突变型HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，为进一步促进基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

大鼠下肢缺血模型中双位点诱变体HIF-1α的促血管新生作用

目的探讨双位点诱变体低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因(Ad-H564/803)在动物体内的表达及生物学功能。方法构建急性大鼠下肢缺血模型,随机分为4组,分别以Ad-LacZ、Ad-H0、Ad-H564/803和生理盐水(NS)转染术侧下肢骨骼肌,于转染后1,3,5,7d,RT-PCR测定骨骼肌中HIF-1αmRNA的表达量;基因转染后28d,选择下肢动脉造影及动脉铸型观察血管密度。结果RT-PCR结果显示:Ad-H564/803组HIF-1αmRNA相对表达量较Ad-H0组高(P=0.000);以转染后7d表达量最高(P=0.000);第3,5,7dAd-H564/803组的表达量均高于其它各组(P=0.000)。基因转染28d后造影显示:Ad-H564/803组的侧支血管密度大于Ad-H0组及其他各组;动脉铸型显示:Ad-H564/803组的绒毛样微血管最为密集。结论外源性双位点诱变体HIF-1α基因(Ad-H564/803)可增强急性下肢缺血模型大鼠骨骼肌内HIF-1αmRNA的表达,促进缺血骨骼肌中的血管新生,且生物学功能较野生型HIF-1α基因更强。     

Construction of mutant HIF-1α lentiviral vector and its anti-degradation effect under normoxic conditions

目的 构建点突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)慢病毒载体,并检测其在常氧条件下的抗降解作用.方法 根据人的HIF-1α基因(NM_001530),对其全长编码区序列进行如下定点突变:803位天冬酰胺突变成丙氨酸,564位脯氨酸突变成丙氨酸,402位脯氨酸突变成丙氨酸.设计并合成3对引物用以导入变异点.PCR扩增序列片段,然后将目的 基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.PacI和AscI酶切鉴定后,用LR重组系统将目的 序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-MT(突变型HIF-1α)及Lenti-WT(野生型HIF-1α).将Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ(对照组)转染293T细胞后,采用qPCR检测目的 基因的表达.转染后的细胞在低氧条件下(2% O2)培养48 h,然后常氧条件下培养48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白在不同氧浓度条件下的表达情况.结果 与WT测序结果对比表明MT已被完成.酶切结果证明已成功构建pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.qPCR结果显示Lenti-MT组目的 基因表达高于Lenti-WT组,且差异具有统计学意义.低氧条件下,HIF-1α在WT组和MT组中的蛋白表达差异无统计学意义.但常氧条件下培养48 h后,WT组目的 蛋白的表达显著下降,而MT组变化不大.上述结果表明MT具有明显的抗降解作用.结论 成功构建了突变型HIF-1α,慢病毒载体在常氧条件下,Lenti-MT具有显著的抗降解作用.     

突变型HIF-1α慢病毒载体的构建及其在常氧条件下的抗降解作用

目的构建点突变型低氧诱导因子-1α（HIF-1α）慢病毒载体,并检测其在常氧条件下的抗降解作用。方法根据人的HIF-1α基因（NM₀01530）,对其全长编码区序列进行如下定点突变:803位天冬酰胺突变成丙氨酸,564位脯氨酸突变成丙氨酸,402位脯氨酸突变成丙氨酸。设计并合成3对引物用以导入变异点。PCR扩增序列片段,然后将目的基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-mutant/HIF-1α。PacI和AscI酶切鉴定后,用LR重组系统将目的序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-MT（突变型HIF-1α）及Lenti-WT（野生型HIF-1α）。将Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ（对照组）转染293T细胞后,采用qPCR检测目的基因的表达。转染后的细胞在低氧条件下（2%O2）培养48 h,然后常氧条件下培养48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白在不同氧浓度条件下的表达情况。结果与WT测序结果对比表明MT已被完成。酶切结果证明已成功构建pEGFP-N1-mutant/HIF-1α。qPCR结果显示Lenti-MT组目的基因表达高于Lenti-WT组,且差异具有统计学意义。低氧条件下,HIF-1α在WT组和MT组中的蛋白表达差异无统计学意义。但常氧条件下培养48 h后,WT组目的蛋白的表达显著下降,而MT组变化不大。上述结果表明MT具有明显的抗降解作用。结论成功构建了突变型HIF-1α,慢病毒载体在常氧条件下,Lenti-MT具有显著的抗降解作用。     

人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的构建能在哺乳动物细胞得到常氧下高表达的携带HIF-1α突变型HIF-1α-Ala402-Ala 564基因真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564。方法 采用分子克隆技术,在业已完成的pShuttle2-HIF-1α—Ala564的基础上,用连续聚合酶链式反应（PCR）定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α—Ala402-Ala564。结果 经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564构建成功。结论 成功构建重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564,为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定基础。     

Ad-HIF-1α双突变体对急性心肌梗死大鼠心功能的短期影响

目的 研究重组腺病毒低氧诱导因子-1α双突变体基因(Ad-HIF-1 α-564/402)对心肌梗死大鼠心功能的影响.方法 36只雄性SD大鼠建立急性心肌梗死模型,随机分成3组,分别为生理盐水组(Saline组,n=12)、腺病毒空载体组(Ad-Null组,n=12)、Ad-HIF-1 α-564/402组(n=12),分别在术后即刻肌肉注射0.1mL生理盐水、Ad-Null、Ad-HIF-1 α-564/402,病毒滴度1.0×108PFU.术后7d,行心脏超声检查,了解心功能情况;检测血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)含量;氯化三苯基四氮唑法(TT℃)评价心肌梗死面积.结果 基因转染后7d,心脏超声结果显示,Ad-HIF-1 αα-564/402组心功能指标中左室射血分数(LVEF)、心输出量(CO)优于Saline组和Ad-Null组,3组间差异有统计学意义(P＜0.05),Saline组和Ad-Null组差异无统计学意义(P＞0.05),Ad-HIF-1d-564/402组左室短轴缩短率(LVFS)大于其他两组,但3组间差异无统计学意义(P ＞0.05);CK-MB、cTnI在Ad-HIF-1α-564/402组含量较其他两组为低,3组间差异有统计学意义(P＜0.05),Saline组和Ad-Null组差异无统计学意义(P＞0.05);TTC法评价心肌梗死面积,结果示Ad-HIF-1d-564/402组心肌梗死面积百分数小于其他两组,3组间差异有统计学意义(P＜0.05),Saline组和Ad-Null组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Ad-HIF-1α-564/402能减轻心肌梗死大鼠近期心肌损伤,减小梗死面积,改善心功能.