柚皮苷抑制低氧/复氧致大鼠心肌细胞系H9c2损伤

目的研究柚皮苷(NAR)对H9c2低氧/复氧(H/R)损伤心肌细胞内质网应激的影响。方法将H9c2心肌细胞随机分为对照组(C组)、低氧/复氧组(H/R组)低氧4 h后复氧24 h、柚皮苷10、20和40μg/mL组。于低氧前6 h给予柚皮苷培养再行低氧4 h后复氧24 h。实验后TUNEL检测心肌细胞凋亡;Western blot检测GRP78、ATF6、Bax及Bcl-2蛋白表达。结果与对照组相比,H/R组细胞凋亡增加,GRP78、ATF6、Bax蛋白表达和Bax/Bcl-2比率显著上调,而Bcl-2蛋白表达显著下调(P0.05);与H/R组比较,柚皮苷3个剂量组均可使细胞凋亡减少,GRP78、ATF6、Bax、Bax/Bcl-2比率下调,Bcl-2上调(P0.05),尤其以柚皮苷20和40μg/mL组作用最显著。结论柚皮苷预处理可以降低细胞凋亡,其机制可能与抑制内质网应激有关。     

Klotho蛋白减轻低氧/复氧诱导的心肌细胞系H9C2损伤

目的研究Klotho蛋白对低氧-复氧诱导的心肌H9C2细胞系损伤的保护作用及其机制。方法将H9C2心肌细胞分为对照组、低氧/复氧组(1%O_2低氧6 h, 5%CO_2以及95%空气培养箱中复氧2 h)和Klotho蛋白(10μg/mL)干预组。通过酶标仪间接测定细胞内钙离子([Ca~(2+)]_i)水平;CCK8法和TUNEL法分别检测细胞活性及细胞凋亡;分光光度法检测细胞中钠ATP酶(Na~+/K~+-ATPase,NKA)和反向模式钠/钙交换体(Na~+/Ca~(2+)-exchange,NCX)的活性。结果体外培养的H9C2细胞低氧/复氧(6 h/2 h)处理后可明显降低H9C2细胞活性(P0.05);增加细胞内Ca~(2+)水平和凋亡率(P0.05);降低细胞中Na~+/K~+-ATPase的活性(P0.05);增加反向模式Na~+/Ca~(2+)交换体的活性(P0.05);10μg/mL Klotho蛋白处理可明显减轻上述损伤。结论 Klotho蛋白可减轻低氧/复氧诱导下的H9C2细胞内钙超载,最终减少该细胞系细胞的凋亡。     

紫草素减轻低氧-复氧致大鼠心肌细胞系H9c2损伤

目的探索紫草素对低氧-复氧(H/R)损害的H9c2心肌细胞的保护作用。方法将心肌细胞系H9c2分为对照组、H/R组、紫草素(0. 1、1和10μmol/L)干预组,每组3个平行孔; MTT法检测紫草素对H9c2细胞毒性;流式细胞计量术检测细胞凋亡和周期; DCFH-DA检测细胞活性氧水平;生化检测细胞中MDA、8-OHdG和GSH含量;qPCR检测细胞γ-GCS、HO-1和NQO1 mRNA表达; Western blot检测细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、Keap1和Nrf2蛋白表达;免疫荧光检测细胞Nrf2蛋白进核情况。结果紫草素呈浓度-时间依赖性抑制H9c2细胞增殖(P<0. 05); H/R诱导H9c2细胞凋亡、细胞周期阻滞及促进Bax及cleaved caspase-3蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达(P<0. 05),紫草素呈浓度依赖性抑制细胞凋亡、解除细胞周期阻滞及cleaved caspase-3和Bax蛋白表达,增加Bcl-2蛋白表达;紫草素可降低H/R所致活性氧水平、MDA及8-OHdG升高,增高H/R所...     

槐果碱减轻低氧导致的大鼠心肌细胞系H9c2损伤

目的 阐明槐果碱(Sop)对低氧导致的大鼠心肌细胞系H9c2损伤的抑制作用及机制.方法 将H9c2细胞暴露于1％O2环境中,同时加入不同浓度(1、4和16 mmol/L)的Sop培养细胞48 h后,用MTT法测定细胞活力;用试剂盒分别检测LDH释放水平和MDA含量;用流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western blot检...     

丙泊酚减轻H2O2诱导的心肌细胞系H9C2损伤

目的研究丙泊酚对过氧化氢(H_2O_2)诱导的心肌细胞系H9C2损伤及活性氧(ROS)水平的影响。方法将心肌细胞分成对照组、H_2O_2处理组和15、30和60μmol/L丙泊酚干预组。MTT检测细胞活力;二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;流式细胞计量术检测细胞凋亡;Western blot检测细胞中激活型caspase-3(cleaved caspase-3)、胞质和线粒体中细胞色素C(cytochrome C)蛋白水平;黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性;钼酸铵法检测过氧化氢酶(CAT)活性;二硫代二硝基苯甲酸法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量;二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯法检测ROS活性;JC-1法检测线粒体膜电位。结果与对照组比较,H_2O_2处理组细胞活力降低;LDH漏出率和凋亡率升高;cleaved caspase-3蛋白水平及胞质中cytochrome C水平升高;线粒体cytochrome C水平降低;SOD、CAT和GSH-Px活性降低;MDA及ROS含量升高;线粒体膜电位下降(P0.05)。与H_2O_2处理组比较,15、30和60μmol/L丙泊酚组细胞活性升高;LDH漏出率降低;凋亡率和cleaved caspase-3水平降低;胞质中cytochrome C蛋白水平减少;线粒体中cytochrome C水平升高;细胞SOD活性、CAT活性和GSH-Px活性升高;MDA含量和ROS含量降低;线粒体膜电位升高(P0.05)。结论丙泊酚可以减轻H_2O_2诱导的心肌细胞损伤,减少细胞凋亡并降低细胞ROS水平。     

右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 观察右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组:正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后,再经缺氧/复氧处理。采用倒置显微镜观察各组H9C2心肌细胞形态的变化,检测各组细胞培养基中LDH的含量,CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率,试剂盒检测caspase-3活性,TUNEL法检测细胞凋亡并计算凋亡指数。结果 与Control组相比,H/R组细胞皱缩,大量死亡,细胞活力降低,培养基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,细胞凋亡指数增加,统计学意义显著（P＜0.01）;Dex预处理可明显改善H/R处理后细胞形态,提高细胞活力,减少LDH含量和caspase-3活性,降低细胞凋亡指数,统计学意义显著（P＜0.01）。结论 Dex可通过减少H9C2心肌细胞缺氧/复氧引起的细胞凋亡减轻损伤。     

BM-MSCs来源外泌体介导铁死亡减轻大鼠心肌细胞系H9c2缺氧/复氧损伤

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)来源外泌体对大鼠心肌细胞系H9c2缺氧/复氧(A/R)损伤的保护作用及其分子机制。方法 构建H9c2细胞A/R损伤模型；采用电镜、Western blot鉴定BM-MSCs来源外泌体(BM-MSCs-exos);PHK26红色荧光标记外泌体并观察H9c2细胞内吞现象；采用CCK-8法检测细胞活力，EdU细胞增殖实验检测细胞增殖活性；铁死亡相关检测试剂盒测定Fe²⁺、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量，流式细胞测量术检测活性氧自由基(ROS)水平。结果 成功鉴定BM-MSCs-exo并观察到H9c2细胞内吞外泌体；与A/R组比较，A/R+BM-MSCs-exo组细胞活力与增殖能力得到明显改善(P<0.05);铁死亡标志蛋白GPX4、SLC7A11升高，转铁蛋白受体1(TFR1)表达降低(P<0.05); Fe²⁺离子、MDA、ROS水平降低，GSH水平升高(P<0.05)。铁死亡诱导剂Erastin处理后，发现BM-MSCs-exo对H9c2细胞A/R损伤的保护作用显著降低(P...     

大鼠心肌细胞和心肌细胞系H9C2表达弹性蛋白

目的 检测弹性蛋白在大鼠心肌细胞和H9C2心肌细胞系内的表达。 方法 取新生和成年SD大鼠各5例的新鲜心脏，冷冻切片；取20只新生3 d SD大鼠心脏，通过0.05%胰蛋白酶和0.075%Ⅱ型胶原酶消化法，获取原代心肌细胞；免疫组织化学和免疫荧光技术检测大鼠心肌组织、原代心肌细胞和H9C2心肌细胞系的弹性蛋白表达;ELISA法检测培养的H9C2心肌细胞系上清中的弹性蛋白。 结果 在大鼠心肌细胞、H9C2心肌细胞系和新生、成年大鼠心肌组织上均发现心肌肌钙蛋白T和弹性蛋白的共表达。免疫组织化学结果发现，弹性蛋白在成纤维细胞、平滑肌细胞和细胞间质内均有表达。H9C2心肌细胞培养液的上清中检测到少量的弹性蛋白。 结论 大鼠心肌细胞表达弹性蛋白，可能参与心肌细胞的势能和细胞间质弹性纤维的构建。     

尼古丁促进高糖/高脂培养的大鼠心肌细胞系H9C2凋亡

目的研究在不同浓度尼古丁(Nic)条件下高糖/高脂(HGHL)对大鼠心肌细胞系H9C2凋亡的影响。方法体外培养H9C2细胞,给予不同浓度Nic(6×10^-8、6×10^-7、6×10^-6mol/L)2 h后,HGHL(33 mmol/L葡萄糖和500μmol/L棕榈酸酯)培养24 h,CCK8法检测细胞增殖;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞活力;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3及caspase3的表达及ERK1/2、JNK和p38MAPK磷酸化水平;流式细胞计量术测定细胞凋亡和上清液ROS水平。结果与对照组相比,HGHL和尼古丁联合HGHL均显著抑制细胞活力,增加上清液中LDH水平(P<0.001);HGHL及Nic+HGHL细胞凋亡率显著增加(P<0.001)及cleaved-caspase3蛋白表达明显增加(P<0.01);Bcl-2/Bax蛋白表达显著下降(P<0.01);在Nic+HGHL组,ROS水平表达最显著(P<0.001);HGHL能激活MAPK磷酸化,Nic+HGHL组ERK1/2磷酸化水平显著升高(P<0.01);ROS清除剂(NAC)能显著减少caspase3蛋白表达水平(P<0.001)。结论尼古丁、HGHL能导致H9C2细胞损伤并增加其凋亡,其发生与ROS及MAPK信号通路密切相关。     

敲除Dock180抑制大鼠H9C2心肌细胞系增殖和促凋亡

目的探讨敲除细胞质移动蛋白1(Dock180)对大鼠H9C2心肌细胞系增殖和凋亡的影响及其机制。方法用CRISPR/Cas9系统构建single guide RNA(sgRNA)Dock180质粒,并将其包装成敲除Dock180重组慢病毒再进行筛选,建立敲除Dock180的H9C2心肌细胞稳定株。实验分为A:阴性慢病毒组(Cas9)、B:敲除Dock180组、C:阴性慢病毒低氧组、D:敲除Dock180低氧组。RT-PCR检测各组细胞Dock180 mRNA表达水平,Western blot检测相关蛋白的表达水平,MTT检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 B组和D组Dock180 mRNA和蛋白无表达;分别较A组和C组,B组和D组p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低(P0.01),Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01);较A组,C组Dock180 mRNA和蛋白表达降低,p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低,Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01);较B组、D组p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低,Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01)。结论敲除Dock180可抑制H9C2心肌细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用可能通过p-ERK1/2、Bax和Bcl-2分子介导。     

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ通过介导凋亡加重H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinase II,Ca MKII)在H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中的作用。方法:H9c2心肌细胞随机分为4组:正常对照(control)组、Ca MKII特异性抑制剂KN-93(1μmol/L)对照(KN-93)组、H/R组和KN-93+H/R组,其中KN-93组及KN-93+H/R组先用1μmol/L KN-93预处理2 h后,再进行其它处理。倒置显微镜观察各组H9c2心肌细胞的形态变化,CCK-8法检测各组H9c2心肌细胞的活力,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测各组培养基中LDH的活性,Western blot法检测Ca MKII及其底物受磷蛋白(phospholamban,PLN)的磷酸化水平以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达,TUNEL染色和流式细胞术观察细胞凋亡。结果:与control组相比,KN-93组各项指标均无显著性差异;H/R组细胞皱缩,大量死亡,细胞活力明显降低,培养基中LDH活性明显升高(P0.01),Ca MKII及PLN的磷酸化水平和cleaved caspase-3的蛋白水平显著增加(P0.01),TUNEL染色阳性细胞数和流式细胞凋亡率显著增加(P0.01);1μmol/L KN-93干预H/R可明显改善细胞形态,增加细胞活力,降低培养基中LDH活性(P0.01),减少Ca MKII和PLN的磷酸化水平以及cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05),降低TUNEL染色阳性细胞数和流式细胞凋亡率(P0.01)。结论:Ca MKII通过介导细胞凋亡参与H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

自噬在高糖高脂引起心肌细胞系H9C2凋亡中的影响

目的探究自噬在高糖高脂(HGHL)引起的心肌细胞系H9C2凋亡中的影响。方法不同浓度高糖高脂处理H9C2心肌细胞不同时间,HE染色并测量心肌细胞表面积;流式细胞计量术检测细胞活性和凋亡率,确定心肌细胞肥大及凋亡的最适浓度和时间;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬指标LC3Ⅱ、自噬信号通路p62/SQSTM1(p62)、Beclin-1、LAMP2蛋白表达以及自噬抑制剂氯喹预处理后cleaved caspase-3蛋白表达。结果HGHL处理后H9C2心肌细胞肥大呈浓度和时间依赖性,36 h最显著(P0.001);细胞凋亡呈浓度和时间依赖性增高,36 h凋亡率约50%(P0.001);与对照组相比,HGHL诱导24 h时LC3Ⅱ蛋白水平显著增加(P0.01),Beclin-1、LAMP2蛋白水平显著下降(P0.05),而p62蛋白水平显著升高(P0.01);与对照组以及干预组相比,氯喹预处理1 h后cleaved caspase-3蛋白表达显著增加(P0.01)。结论 HGHL诱导H9C2心肌细胞肥大并促进其凋亡。HGHL通过同时抑制自噬形成和降解,使自噬体异常堆积,导致细胞凋亡。这表明抑制自噬可能是促进细胞凋亡的重要原因。     

干扰P2X_7R基因对RAW264.7细胞增殖和吞噬的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞P2X7受体(P2X7R)基因的表达,建立稳定干扰细胞株,并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法:用脂质体法将P2X7R shRNA重组质粒转染至RAW264.7细胞,经G418筛选后获得稳定干扰细胞株。细胞分为野生型(WT)组、阴性对照(NC)组和干扰(sh P2X7R)组。Real-time PCR法检测细胞中P2X7R mRNA的表达,Western blot检测细胞中P2X7R蛋白的表达;CCK-8方法检测细胞生长活性,5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U)掺入实验检测细胞增殖活性;流式细胞术分析细胞周期的分布和吞噬情况。结果:P2X7R shRNA能明显抑制RAW264.7细胞的P2X7R mRNA和蛋白的表达,抑制率在80%以上。48 h后,sh P2X7R组细胞的生长速度明显高于NC组和WT组(P0.05),增殖期细胞比例明显升高(P0.05),说明下调P2X7R基因能明显促进细胞增殖。sh P2X7R组的细胞周期出现改变,S期和G2/M期的比例明显上升,增殖指数增高(P0.05)。sh P2X7R组的细胞吞噬活性明显高于NC组(P0.05)。结论:本研究成功构建了稳定干扰P2X7R基因表达的小鼠巨噬细胞株RAW264.7,sh P2X7R能够明显促进RAW264.7细胞的增殖,改变了细胞的吞噬活性。     

Knockdown of NPM1 by RNA interference inhibits cells proliferation and induces apoptosis in leukemic cell line

Nucleophosmin (NPM1) is an abundant and ubiquitously expressed phosphoprotein that is known to influence solid tumors progression. However, little is known about the role of NPM1 in leukemia. Here, we knocked down the NPM1 expression by RNA interference to investigate the role of NPM1 in leukemic cells proliferation and apoptosis. The interference vector pNPM1-shRNA was constructed and transfected into the human leukemic K562 cell line. The expression levels of NPM1 mRNA and protein were detected by quantitative real-time PCR and Western blot, respectively. Cells proliferation potential in vitro was assessed by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and colony formation assays. Flow cytometry was used to detect the distribution of cell cycle. Cellular apoptosis was reflected by the relative activities of caspase-3 and caspase-8. The results showed that the expression levels of NPM1 mRNA and protein in K562 cells were significantly reduced after pNPM1-shRNA transfection. The cells growth was significantly inhibited in a time-dependent manner and the number of colonies was significantly reduced in the pNPM1-shRNA transfected cells. Meanwhile, the percentage of cells in G1 phase in the K562/pNPM1-shRNA cells was significantly increased. In addition, there were higher relative activities of caspase-3/8 in the pNPM1-shRNA transfected cells. These results indicate that down-regulation of NPM1 expression inhibits leukemic cells proliferation, blocks cell cycle progression and induces cellular apoptosis. It may implicate a potential target for leukemia gene therapy.     

RNA干扰联合阻断MMS2和REV3基因表达减轻结肠癌细胞系THC8307/L-OHP对奥沙利铂的耐药性

目的 探讨沉默REV3和MMS2逆转结肠癌耐药细胞系THC8307/L-OHP细胞对奥沙利铂(L-OHP)的耐药性.方法 THC8307/L-OHP细胞转染含microRNA片段重组质粒后,用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)和免疫荧光法检测目的基因表达,选择低表达效率具有统计学意义的细胞作为实验组细胞.分别应用MTT法、罗丹明123实验、流式细胞术检测细胞对L-OHP药物敏感度和细胞凋亡.结果 与对照组相比,L-OHP对实验组细胞的半数抑制浓度(IC50)及耐药指数(Rl)减低(P＜0.05),实验组细胞经L-OHP处理后凋亡率显著增高(P＜0.05),实验组细胞MMS2和REV3蛋白表达水平降低(P＜0.05).结论 下调REV3和MMS2在逆转人结肠癌细胞对L-OHP的耐药性和促进肿瘤细胞的凋亡上有一定作用.     

miR-153通过靶向SORBS2促进LPS诱导的心肌H9C2细胞损伤

目的:研究微小RNA-153(miR-153)对脂多糖(LPS)诱导的胚胎大鼠心肌H9C2细胞的炎症因子、细胞活力及凋亡的影响,并探讨其机制。方法:运用LPS建立H9C2细胞损伤模型;将细胞分为anti-miR-Con组(转染anti-miR-Con)、anti-miR-153组(转染anti-miR-153)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-SORBS2组(转染pcDNA-SORBS2)、anti-miR-153+si-Con组(共转染anti-miR-153和si-Con)和anti-miR-153+si-SORBS2组(共转染anti-miR-153和si-SORBS2),转染后用LPS处理。RT-qPCR法检测细胞中miR-153和SORBS2 mRNA的表达;MTT法检测细胞活力;Western blot检测细胞中SORBS2的蛋白表达;ELISA实验检测细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的含量;流式细胞术检测细胞凋亡;双萤光素酶报告基因实验验证miR-153与SORBS2的靶向关系。结果:成功构建LPS诱导的H9C2细胞损伤模型;与对照...     

肌肽对高糖诱导的大鼠H9C2心肌细胞损伤的保护作用及其机制

目的 研究肌肽对高糖诱导受损的大鼠心肌细胞（H9C2）的保护作用及其机制。 方法 用含50 mmol/L葡萄糖的高糖培养液建立高糖损伤模型,实验观察组给予5、15 mmol/L肌肽进行保护。MTT检测各组H9C2心肌细胞活力;ELISA测定培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子浓度含量;试剂盒检测细胞中SOD、MDA、AST和LDH活性;二氢乙锭测定细胞中活性氧含量;免疫印迹测定细胞中bax、bcl-2、p65和IκB-α的蛋白表达。 结果 肌肽预处理组细胞内活性氧含量下降,SOD活性升高,AST和LDH活性减弱,MDA含量降低;其培养液中炎症因子含量明显降低,细胞核中p65蛋白水平降低,胞浆中IκB-α蛋白水平升高,bax和bax/bcl-2比值降低。 结论 肌肽能够减轻高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤,降低细胞炎症反应,其机制可能与ROS/NF-κB信号通路有关。