半巢式PCR和PCR RFLP法诊断耐青霉素肺炎链球菌的比较

目的 评价半巢式PCR和PCR-RFLP法用于诊断肺炎链球菌青霉素耐药性的价值.方法 收集130株肺炎链球菌临床分离株和50株健康人定植株,琼脂稀释法测定青霉素最低抑菌浓度(MIC),半巢式PCR、PCR-RFLP法测定对青霉素耐药性.结果 健康人定植株均对青霉素敏感,临床分离株青霉素敏感率、中介率、耐药率分别为25....     

半巢式PCR和PCR-RFLP法诊断耐青霉素肺炎链球菌的比较

目的评价半巢式PCR和PCR-RFLP法用于诊断肺炎链球菌青霉素耐药性的价值。方法收集130株肺炎链球菌临床分离株和50株健康人定植株,琼脂稀释法测定青霉素最低抑菌浓度(MIC),半巢式PCR、PCR-RFLP法测定对青霉素耐药性。结果健康人定植株均对青霉素敏感,临床分离株青霉素敏感率、中介率、耐药率分别为25.4%、23.1%和51.5%;当MIC为0.25～0.5μg/ml时,半巢式PCR法检测青霉素耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为86.7%、98.6%、86.7%和98.6%;当MIC≥1μg/ml时,对应值分别为96.2%、97.6%、97.4%和96.4%。而PCR-RFLP法诊断中介株的敏感性仅34.2%;诊断耐药株的阳性预测值仅67.5%。结论半巢式PCR法优于PCR-RFLP法,可用于对耐青霉素肺炎链球菌的快速检测;PCR-RFLP敏感性不高,可用于分子流行病学分析。     

肺炎链球菌经典血清分型与分子分型两种方法比较

目的 比较肺炎链球菌经典血清分型法与分子分型法,为建立快速、准确的血清分型方法提供依据。方法 选取2013年10月～2015年2月肇庆市第一人民医院住院患者分离的150株肺炎链球菌为研究对象,分别采用经典荚膜肿胀法和多重PCR法进行血清分型。比较两种方法的分型率及血清分型结果,用两独立样本的非参数检验对分型率高的几种血清型进行统计分析对比,并计算结果的总符合率、灵敏度及特异度。结果 肺炎链球菌经典荚膜肿胀法分型率为53.3%,血清群以19群(32.7%),6群(7.3%)和23群(4%)为主,使用单因子血清分得血清型19F(23.3%),19A(2.7%),6C(2%)和23F(2.7%)。多重PCR法分型率为76.0%,血清群以19群(41.3%),6群(10.7%)和23群(10.7%)为主,具体的血清型以19F(32.7%),19A(8.0%),6(10.7%)和23F(9.3%)为主,采用两独立样本的非参数检验进行比较,以血清型结果为19F,19A和23F作对比,统计结果P>0.05,显示两种分型方法结果分布类别上相同,无显著性差异; 两种方法结果总符合率为74.6%; 以多重PCR法验证经典荚膜肿胀法的敏感度,敏感度为70.2%,特异度为100%,显示经典荚膜肿胀法敏感度不及分子分型法。结论 与传统的血清学分型技术相比,分子分型技术具有快速、准确、灵敏及分辨力高等优点,成为可依赖的分型手段。     

乙型肝炎病毒荧光PCR基因分型方法的建立和应用

[目的]建立一种在临床上准确、快速、简便地对乙型肝炎病毒进行基因分型（BCD三型）的方法。[方法]大量分析已分型的HBV基因组序列，寻找出HBV各基因型的型特异性碱基的分布规律，设计型特异性的引物和探针，利用已知全序列HBV建立荧光PCR的基因分型方法。并与PCR-RFLP及S基因测序等分型方法作比较。[结果]荧光PCR方法对已知基因组序列的HBV分型结果与基因组分析完全一致，利用大量随机临床标本摸索的最佳反应条件为94℃，1min；94℃，10s，60℃，30s，40个循环。与PCR-RFLP相比，分型结果一致性在84．0％；与S基因测序分型相比，一致性为96．2％。[结论]利用荧光PCR能灵敏、快速、准确地进行乙型肝炎病毒基因分型，方便临床应用和流行病学调查。     

肺炎链球菌TaqMan实时荧光定量PCR的建立及临床应用

目的：建立TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌的方法,应用于临床儿童社区获得性肺炎（CAP）标本的快速筛查。方法根据 GenBank公布的肺炎链球菌自溶酶基因（lytA）设计引物和探针,建立实时荧光定量 PCR,并对体系进行优化;同时以痰培养法做双盲对照,应用于1504份 CAP患儿标本检测。结果 TaqMan实时荧光定量 PCR菌液的最低检出限可达18.75 cfu/PCR,无交叉反应,特异度好;对1504份儿童CAP标本检测,141份肺炎链球菌实时荧光定量PCR阳性,其中140份肺炎链球菌痰培养阳性,该方法灵敏度为100％,特异度为99.93％。从样品处理到结果报告仅需2.5 h。结论 TaqMan实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于儿童CAP中肺炎链球菌的初筛和指导抗生素的的合理使用。     

南昌地区多重耐药肺炎链球菌的分子分型

摘要：目的：了解南昌地区多重耐药肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia,SP）的分子流行病学特征。 方法：收集南昌地区3家教学医院临床分离的SP 66株,用盒式聚合酶链反应（BOX-PCR）对23株临床分离的SP进行基因分析;用多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST)对其中7株多重耐药SP进行分子遗传学分析,了解其与国际流行株关系。 结果：23株SP用BOXPCR检测共分为11型,15个亚型。7株多重耐药SP MLST分型共检出７种序列型,分别为ST320、ST236、ST983、ST790、ST5747、ST5748、ST5749,其中ST5747、ST5748、ST5749为国际上首次发现。 结论：南昌地区多重耐药SP增加是由于耐药克隆株的播散,主要克隆株来自国际流行克隆CC236 (Taiwan^19F-14 Clone)的传播。     

沙门菌玻片凝集血清分型与多重荧光PCR血清分型检测试剂盒方法比较

目的探讨在肠道多病原监测中,沙门菌多重荧光PCR血清分型检测试剂盒的适用性,扩展沙门菌的分子分型和鉴定方法,提高分型效率,以更快更好地应对由沙门菌引起的腹泻事件。方法利用沙门菌多重荧光PCR血清分型检测试剂盒和传统玻片凝集血清分型方法,对2013 — 2018年北京市丰台区肠道多病原监测中分离获得的95株沙门菌进行分型分析,比较2种结果的符合程度。结果采用传统玻片凝集法,95株沙门菌被分为21种血清型。 采用多重荧光PCR血清分型检测试剂盒,85株沙门菌被分为17种型别,10株菌无法分型,包含Salmonella Goldcoast、S. London、S. Senftenberg、S. Thompson、S. Panama、S. Othmarsche 6种血清型。 在试剂盒成功分型的85株菌中,83株菌的分型结果与玻片凝集法一致,符合率为97.65%。结论在沙门菌分型中,玻片凝集法应用良好,多重荧光PCR血清分型检测试剂盒与前者分型结果一致性高,检测效率显著提升,对不常见血清型的鉴定有待扩充,2种方法联合使用可全面提高实验室对沙门菌的分型检测效率和准确率。     

多重聚合酶链反应在肺炎链球菌血清学分型中的应用

肺炎链球菌是儿科感染中常见的病原菌之一。基于荚膜多糖抗原的特点,传统荚膜肿胀实验可将肺炎链球菌分为46个血清群,90多种血清型。近年来随着分子生物学技术的发展,多重聚合酶链反应(MPPCR)技术不断成熟并逐步代替常规的荚膜肿胀实验,用于血清学分型。该技术具有简便快速、成本相对较低等优点,能有效的监测临床上肺炎链球菌流行血清型。     

多重巢式PCR检测恶性疟和间日疟原虫

目的建立鉴别诊断恶性疟原虫(P.f)和间日疟原虫(P.v)的多重巢式PCR法。方法针对P.f、P.v 18S rRNA基因设计外引物和内引物,优化引物浓度与退火温度,建立可扩增出两种疟原虫基因片段的多重巢式PCR,并检测54例疑似疟疾临床标本,以镜检法为金标准评价敏感性和特异性等指标。结果该方法可扩增出162 bp(P.f)和112 bp(P.v)基因片段,并能检出混合感染。该方法检测P.f,敏感性为87.50%、特异性为63.33%;检测P.v,敏感性为69.23%、特异性为68.29%。结论所建立的多重巢式PCR方法能可靠诊断疟疾并鉴别虫种,敏感性高,在混合感染的诊断方面具有优越性。     

TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

Discrimination of Streptococcus pneumoniae from other upper respiratory tract streptococci by arbitrarily primed PCR

Objectives: In the clinical laboratory, identification of Streptococcus pneumoniae can be confused with other streptococci. Conventional biochemical tests such as optochin sensitivity and bile solubility can give inconsistent results. This report presents a method to distinguish true S. pneumoniae from other upper respiratory tract streptococci when conventional tests fail.

Design and Methods: We used arbitrarily primed polymerase chain reaction with the single primer M13 universal as a method to distinguish S. pneumoniae from other upper respiratory tract streptococci.

Results: The fingerprint pattern of S. pneumoniae was established by amplifying DNA of S. pneumoniae type strains 1–48 and of other common upper respiratory tract streptococci at three different DNA concentrations with the single primer M13 universal. From these type strains, a common arbitrarily primed-polymerase chain reaction pattern was identified characterized by two predominant bands of equal intensity at 800 base pairs and at 1100 base pairs. Fingerprint patterns of viridans streptococci were easily distinguishable from those of S. pneumoniae. Many of the clinical isolates used in this study were equivocal by conventional tests but were distinguishable by their fingerprint patterns.

Conclusions: Our results indicated that the fingerprint pattern of S. pneumoniae is species specific and distinguishes true S. pneumoniae of clinical isolates from other streptococci when conventional biochemical tests are unclear.     

呼吸道合胞病毒A与B亚型多重荧光PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种新的呼吸道合胞病毒(RSV)分型检测方法,用于快速检测和监测。方法针对RSV G基因设计引物、探针,并引入人β-actin基因(ACTB)作为内参质控,建立RSV-A、RSV-B多重荧光PCR检测方法。使用多种常用呼吸道病原体及体外转录RNA产物考核其特异性和灵敏度。并对2015年1月至12月广州两家医院的儿童急性呼吸道感染患者进行检测。结果所建立的多重检测方法未见非特异性反应。RSV-A、RSV-B和ACTB分别可检测低至4、8和12 copies/μL的RNA模板,且分别在10~1×10~(10)copies/μL、100~1×10~(10)copies/μL和100~1×10~(10)copies/μL时具备良好的线性关系,线性相关系数r2均大于0.99。儿童急性呼吸道感染患者监测中,RSV-A为期间优势亚型。结论本研究所建立的RSV-A、RSV-B多重荧光PCR检测方法,具有较好的特异性、灵敏度、可操作性,可用于相关研究。     

Emergence of Streptococcus pneumoniae of serotype 19A in France: molecular capsular serotyping, antimicrobial susceptibilities, and epidemiology

We have studied 457 Streptococcus pneumoniae isolated in 2007 from adults and children. For all isolates, both latex agglutination and molecular capsular typing were performed. Antibiotic resistance patterns were determined. S. pneumoniae 19A was the most frequently isolated serotype (34.7%) both in children and adults. It represented 12.8% of the strains isolated from invasive infections in adults and 27.0% in children and 63.6% (110/173) of strains isolated from acute otitis media. Between children and adults, no difference concerning antibiotic susceptibility was observed for penicillin, amoxicillin, cefotaxime, and erythromycin in strains isolated from invasive diseases. Comparing antibiotic susceptibilities according to the serotype, the 19A isolates appeared to be the least susceptible to penicillin (3.2%) and erythromycin (4.5%), followed by serotypes 19F and 14. We confirm the predominance of serotype 19A among S. pneumoniae responsible for invasive and noninvasive diseases either in children or adults in France.     

艾滋病相关支原体多重实时荧光聚合酶链反应检测方法的初步建立

目的 建立一种快速、灵敏和特异的艾滋病相关支原体(穿透支原体、发酵支原体和梨支原体)多重实时荧光聚合酶链反应(Multiplex real-time PCR)检测技术。 方法 使用Beacon Designer 7.0软件在穿透支原体和发酵支原体的ftsZ基因以及梨支原体的rpoB基因保守区域设计多重引物及荧光探针,建立并优化艾滋病相关支原体Multiplex real-time PCR检测体系。分别使用3种支原体阳性质粒标准品评价体系的灵敏度,使用8种其他支原体、14种常见致病菌和人类基因组核酸评价该体系的特异度,并与普通聚合酶链反应(PCR)检测方法进行比较。 结果 该Multiplex real-time PCR方法对穿透支原体和发酵支原体检测灵敏度为103拷贝,约为普通PCR的10倍,对梨支原体检测灵敏度为102拷贝,约为普通PCR 100倍。该体系对8种其他支原体、14种常见致病菌和人类基因组均不能扩增。 结论 本研究建立的Multiplex real-time PCR方法可同时快速、准确的检测穿透支原体、发酵支原体和梨支原体。有望用于临床标本检测,完善对艾滋病相关支原体的检测能力。     

Evaluation of two real-time PCR chemistries for the detection of Chlamydophila pneumoniae in clinical specimens

Chlamydophila pneumoniae is an atypical bacterial respiratory pathogen that is responsible for 3–10% of community-acquired pneumonia cases. We report the evaluation of two distinct real-time PCR assays for rapid and specific detection of C. pneumoniae. We tested 401 clinical specimens, finding 5.7% positive, and confirmed a localized outbreak.     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应（PCR）方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白（hilA）基因、变形杆菌溶血素（hpmA）基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用PrimerPremier5．0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401bp、256bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16（4^3）正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为：94．07pg沙门菌DNA,140．85ng变形杆菌DNA,1．41ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4h培养后样品的最低检测限度分别为：沙门菌10^0菌落形成单位（CFU）／mL、变形杆菌10^1CFU／mL、金黄色葡萄球菌10^0CFU／mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白(hilA)基因、变形杆菌溶血素(hpmA)基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用Primer Premier 5.0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401 bp、256 bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为:94.07 pg沙门菌DNA,140.85 ng变形杆菌DNA,1.41 ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4 h培养后样品的最低检测限度分别为:沙门菌100菌落形成单位(CFU)/mL、变形杆菌101CFU/mL、金黄色葡萄球菌100CFU/mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价

  目的  建立一种鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法,并进行应用效果评价。  方法  选择鼠疫菌染色体YPO0393基因与pMT1质粒caf1基因为靶基因,设计合成YPO0393-内标模板、特异性引物和TaqMan荧光探针,构建鼠疫多重荧光定量PCR内标检测体系;对非鼠疫菌DNA、不同稀释浓度鼠疫菌DNA、野外监测样本进行检测,评价该方法的特异性、灵敏性、重复性和应用效果。  结果  采用多重荧光定量PCR内标方法,8株鼠疫菌DNA均出现明显的扩增曲线,12株非鼠疫菌DNA未显示扩增曲线,提示该方法特异性良好。 不同浓度的鼠疫EV76疫苗株DNA,检测最低限为22.5×10?4 ng/μL,变异系数为0.99～3.42,提示灵敏性、重复性较好。 105份野外监测样本中,荧光定量PCR内标方法检测阳性的6份,与普通PCR方法检测结果一致,4份样本分离培养出鼠疫菌且采用PCR方法检测阳性。  结论  通过设置双靶基因与内标对照,本研究建立的鼠疫多重荧光定量PCR内标方法可降低检测假阳性率,特异性、灵敏性和重复性理想,可用于鼠疫快速检测。     

Development of a polymerase chain reaction assay to detect the presence of Streptococcus pneumoniae DNA

In this study, we have developed a chemically sensitive and specific polymerase chain reaction (PCR) assay to detect the presence of Streptococcus pneumoniae genomic DNA. The target DNA sequence was a 322-base pair segment of the S. pneumoniae DNA polymerase I gene (pol I). PCR products of pure cultures of a set of pneumococcal serotypes commonly associated with human infection could be amplified in water and in blood cultures of clinical isolates containing S. pneumoniae. We were able to detect 2 fg of purified S. pneumoniae DNA. There were no false-positive reactions when the assay was performed on samples containing the following clinically encountered bacteria: Haemophilus influenzae type B, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas spp. nontypeable H. influenzae, Staphylococcus aureus, coagulase-negative staphylococci, and Streptococcus pyogenes. The addition of EDTA and citrate-anticoagulated whole blood to the PCR reaction mixture inhibited the PCR assay, whereas the addition of lithium heparin, sodium heparin, and sodium polyanetholesulfonate-anticoagulated whole blood to PCR reaction mixture did not interfere with the ability to detect the presence of S. pneumoniae DNA.