用重组酶介导等温核酸扩增技术检测烟曲霉

目的建立检测烟曲霉的重组酶介导等温核酸扩增技术(RPA)方法。方法筛选针对烟曲霉ITS1-2靶DNA序列的特异性引物。建立RPA快速检测烟曲霉方法并进行条件优化。分析RPA特异性和敏感性并与Taq PCR结果进行比较。结果RPA检测烟曲霉的优化条件为:引物长度:18~30 bp;产物长度:200~700 bp;扩增温度:37~42℃,最低在27℃也可实现扩增;扩增时间:15~40 min,15 min即可达到凝胶电泳可检测的产物量;只需简单的恒温加热设备。RPA和Taq PCR可检测到的最低DNA浓度均为100 ng/m L。RPA仅对烟曲霉有特异性扩增,对黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、中国红酵母均无交叉扩增反应。结论建立的针对烟曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的RPA检测方法,可以快速、特异、灵敏地鉴定和检测烟曲霉。     

基于重组酶介导等温扩增技术建立人腺病毒14型快速检测方法及初步应用评价

目的 基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification, RAA)开发一种快速、准确的人腺病毒14型检测方法。方法 根据人腺病素14型(human adenovirus serotype 14, HAdV-14)的Hexon基因序列,使用Primer 6.0软件设计特异性引物及探针,并构建阳性质粒标准品,优化反应条件,建立一种快速RAA检测方法,并对该方法的灵敏度及特异度进行评价。收集2017～2022年中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院发热性呼吸综合征患者的咽拭子50份,应用建立的实时荧光RAA测定法进行检测,结果与实时荧光PCR检测结果进行比较。结果 最终确定了最佳引物探针组合为HAdV14-F1-4,HAdV14-R1和HAdV14-P;经反应条件优化,40℃进行RAA扩增效果最佳;该方法灵敏度为10¹ copies/μl,当质粒标准品浓度为10⁴,10³,10²和10¹ copies/μl时,批内变异系数均<5%;5...     

环介导等温扩增技术检测呼吸道病毒方法的建立及应用

目的 探讨在呼吸道病毒检测中建立环介导等温扩增技术(LAMP)的可行性,并评价其临床应用价值.方法 建立乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒的LAMP检测方法,应用本方法和直接免疫荧光法(DFA)平行测定74份鼻咽拭子标本的3种呼吸道病毒的感染标志物.并以DFA为参考方法,比较两种检测技术在检出率、灵敏度、特异度等方面...     

逆转录环介导等温扩增检测人星状病毒1型

目的:建立一种快速检测人星状病毒1型的逆转录环介导等温扩增方法.方法:针对人星状病毒ORF1a序列设计特异引物,并优化反应条件.对1株人星状病毒1型实验株和7株其他肠道病毒对照株,及80份临床粪便标本进行检测,并与RT-PCR法比较,确定该方法的特异性、灵敏性和实用性.结果:60℃反应需时1.5 h,可通过肉眼目测或电泳检测判定结果.该方法特异性较好,粪便标本中人星状病毒1型检出限为5 pg/管.临床粪便标本检测结果与RT-PCR法一致.结论:本方法实用性强,有望用于人星状病毒1型现场监测和流行病学调查.     

重组酶聚合酶扩增结合Cas12a输血相关病原体核酸检测方法的可行性

目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)结合Cas12a检测输血相关病原体的可行性。方法 1)根据输血相关病原体HIV、HBV、HCV基因组保守区设计、筛选相应Cas12a crRNA。2)据crRNA靶序列区叠瓦状设计RPA巢式扩增内、外侧引物,凝胶电泳法和荧光探针法筛选巢式RPA内、外侧引物。3)通过质粒或病毒模拟标本梯度稀释,将含不同拷贝数或含量的靶序列RPA扩增,扩增产物以Cas12a检测评价RPA结合Cas12a的检测下限。4)用HIV、HBV、HCV相应近源病毒HTLV、WMHBV、HGBV的同源序列的重组质粒来评价所选crRNA的特异性。结果建立起RPA结合Cas12a核酸检测系统,16份重组质粒的检测下限为10 cp,8份EcoHIV病毒模拟标本的检测下限为1 fg,HIV、HBV、HCV 3种重组质粒及RPA扩增产物的交叉检测间未出现错误检出;10例HIV阳性确证标本的检测结果均为阳性。结论 RPA结合Cas12a检测HIV、HBV、HCV核酸是1种检出限和特异性均较好的核酸检测方法。     

环介导等温扩增法与重组酶聚合酶扩增法用于孕妇B族链球菌定植筛查的价值

目的 探讨环介导等温扩增法(LAMP)与重组酶聚合酶扩增法(RPA)应用于孕妇B族链球菌(GBS)定植的筛查价值。方法 选取2018年5月至2019年7月在徐州医科大学附属沭阳医院采集的68例孕35～37周孕妇阴道及直肠拭子作为主要检测标本,培养GBS菌株后提取菌株基因组DNA,应用LAMP及RPA反应引物进行基因扩增,确定LAMP及RPA的灵敏度、特异性差异及时效性指标。结果 LAMP的基因扩增时间为45 min,产生结果需69 min, LAMP测定需要恒温仪温度为63℃;RPA的基因扩增时间为15 min,经凝胶成像产生结果共需要130 min,经免疫金试纸条检测产生结果仅需20～30 min,仪器需要使用恒温仪38℃、电泳仪和凝胶成像仪或免疫金试纸条。对标本检测发现,LAMP共检出6例阳性、62例阴性,与16s rRNA测序结果完全一致;而RPA电泳法共检出7例阳性(假阳性1例),61例阴性;RPA免疫金试纸条检测与LAMP测定结果一致。结论 LAMP及RPA对设备依赖程度较低,RPA基因扩增速度快,LAMP总耗时相对较短,且具有可视性,RPA扩增后采用免疫金试纸条诊断的灵敏度...     

重组酶聚合酶扩增技术的研究进展与应用

<正>在核酸检测方面,目前应用最广泛的是聚合酶链反应(PCR),但由于PCR具有对温控设备过度依赖、热循环过程耗时、操作专业化等特点,很难应用于现场检测。而由英国TwistDx lnc公司于2006年开发的重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,则被称为是可以替代PCR的新型核酸检测技术[1]。虽然RPA技术从开发至今只有短短十余年,但其原理却被广泛应用于各个领域。且近年来RPA技术的发展速度达到了一个新的高度。     

核酸扩增技术检测血液病毒方法的建立及质量保证

目前 ,我国血站的血液病毒筛查都是使用免疫学方法 ,应用不同生产厂家的 ELISA试剂盒进行血液的初、复检 ,此筛查方法因检测试剂的敏感性、病毒基因的突变、病毒感染的窗口期等存在一定程度的漏检 ,对安全输血构成了极大危险。笔者采用核酸扩增技术 ( NAT)对无偿献血者血液进行了检测 ,旨在提高血液筛查的特异性和敏感性 ,通过扩增反应过程的质控 ,提高检测结果的准确性。材料与方法1　检测对象及标本处理　来自 2 0 0 0年 7～ 8月份无偿献者 ,血液经 HBs Ag、抗 - HCV、抗 - HIV、梅毒检测后阴性且 AL T≤ 2 5 U的血标本 75 0份 ,…     

环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用

病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断。基于这种情况,该文主要阐述了LAMP的原理、特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展。LAMP技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性、引物设计复杂等不足之处。该文综述了近年来LAMP技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向。     

RNA病毒扩增检测的质控品和标准品研究进展

RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)等的核酸检测对于感染的早期诊断和抗病毒治疗疗效的动态观察具有重要价值。自1983年发明聚合酶链反应(PCR)技术以来，出现了基因扩增的概念。目前多采用核酸扩增技术(NAT)检测病毒RNA，最常用的是逆转录(RT)-PCR方法。核酸扩增检测想得到可靠的结果，必须使用质控品进行严格的质量控制，而对病毒进行定量测定，通常还须有病毒RNA标准品。目前RNA病毒扩增检测的质控品和标准品分为两大类，一是裸露的RNA片段，二是内含特定RNA的病毒样颗粒或称之为带盔甲的RNA(armored RNA)。     

基于单一基因的反转录-环介导等温核酸扩增技术快速检测甲型副伤寒沙门菌

目的建立反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法特异检测甲型副伤寒沙门菌。方法针对甲型副伤寒沙门菌特异保守hsdM基因设计引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP体系。利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株DNA评价该方法的特异性及敏感性。同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本及粪便模拟标本进行敏感性检测,并利用临床样本进行初步验证。结果等温65℃条件下,30~60 min内完成RTLAMP反应,利用该方法检测130株甲型副伤寒沙门菌均为阳性,其他非甲型副伤寒沙门菌均扩增阴性。对纯菌RNA检测中检测下限为50 pg/反应,约为19 000个拷贝/反应。在以全血模拟样本的检测中,敏感性达80 cfu/ml,略高于PCR检测低限。对粪便模拟标本的检测中,对原始样品检测下限为500 cfu/g;增菌后样品检测下限为0.8 cfu/g,比PCR检测低限高2~10倍。临床样本中甲型副伤寒患者血液标本检测均阳性,而伤寒样本检测均阴性。结论建立了敏感性高、特异性好的检测甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP方法,为甲型副伤寒沙门菌感染的快速诊断提供了简易手段,可试用于甲型副伤寒的早期诊断。     

Application of recombinase polymerase amplification method for rapid detection of infectious laryngotracheitis virus

Infectious laryngotracheitis is a significant respiratory disease of chickens that causes huge economic losses due to high morbidity and mortality and reduced egg production. A real-time recombinase polymerase amplification (RPA) assay was developed to accurately detect ILTV. The specific probe and primer sets were carefully designed and screened. The real-time RPA assay was carried out at 39 °C for 30 min, and results were obtained within 15 min. The results of the specificity assay showed no fluorescence signals with other avian-related viruses. The sensitivity of the assay was 1 × 10² copies/μL. The low CV value showed that the assay was reproducible. A total of 115 clinical samples were tested using the real-time RPA assay and the real-time PCR assay in parallel; the coincidence rates of the two detection methods were 100%. The results indicated that the real-time RPA assay is a specific, sensitive, rapid, and useful tool for epidemiological studies and clinical diagnosis, especially in the field and in resource-poor areas.     

高灵敏度等温扩增法可视化检测血液中的病毒核酸

目的探讨便携式、可灵敏、快速检测血液标本中病毒核酸的方法。方法以HBV病毒为例,针对其基因组保守序列设计特异性引物,采用环介导等温扩增法(LAMP)对待测HBV标本做核酸目标序列扩增,以高灵敏双链DNA嵌合荧光染料为指示剂,根据荧光信号指示扩增反应产物的有无;将本法与实时荧光PCR法对临床标本做HBV检测的对照分析。结果建立了血液病毒核酸的可视化检测方法,研制出扩增检测一体化仪器;灵敏度达到可在<1 h完成10 cp/管的HBV核酸扩增反应和产物检测。62例实时荧光PCR检测为HBV阳性的临床标本,本法亦都检测为阳性;而从42例实时荧光PCR检测为HBV阴性的临床标本中,本法检出了6例HBV阳性。结论所建立的方法和装置可实现高灵敏度单管快速检测血液病毒核酸,为特殊现场环境中的血液安全性筛查提供了新的手段。