RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价

摘要:目的建立一种基于反转录酶一重组酶介导等温核酸扩增技术( RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA 引物和CRISPR来源RNA( crRNA),优化检测体系中乙酸镁( MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以10°~ 10 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas1 2a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37 C条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1x 102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2, 与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR 法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas 12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。     

建立一种高灵敏的HBV核酸定量检测方法

目的 建立一种高灵敏度的TaqMan实时荧光PCR法用于HBV核酸定量检测,并评估其临床性能。方法 针对HBV保守序列设计引物探针,收集来自国内3家医院共计631例样本,利用本文建立的方法进行HBV核酸定量检测,评估其灵敏度、特异性和重复性,并与普遍采用的对照试剂盒进行比较,评价该方法的临床性能。结果 本文建立的HBV核酸定量检测方法对5 IU/mL的HBV血清和血浆样本的检出率均为100%,且对HBV强阳性、弱阳性和临界阳性样本的阳性检出率均为100%;该方法对于可能存在交叉的15种病原体、内源干扰物及外源干扰物均无交叉反应;与对照试剂的检测结果比较基本相同,对于不一致的样本,经过复检均和本文建立的检测方法结果一致。结论 该方法具有较高的灵敏度,稳定性和重复性好,特异性强,具有较高的临床应用价值。     

可视化等温扩增法快速筛查并分型禽流感病毒

目的:建立一种通用筛查禽流感病毒及其3种亚型的快速核酸检测方法.方法:对20例已知样本扩增禽流感病毒共有的M基因上的一段保守序列快速筛查并确定是否为禽流感病毒,扩增禽流感病毒(H5N1,H7N7,H9N2)3种亚型特异性HA基因上一段序列鉴定禽流感病毒的基因型.采用环介导等温扩增法检测核酸,用肉眼观察双链嵌合染料SYBR Green I荧光显色信号强度.结果:3种禽流感病毒亚型的检测灵敏度均为l0拷贝/管,3组引物间无非特异性扩增.18例阴性,2例阳性,准确性及特异性均为100%.结论:建立的核酸检测方法适合现场快速检测禽流感病毒及其3种亚型.     

禽流感病毒H7N9型 实时荧光定量RT-PCR检测方法的研究

目的 建立一种快速准确诊断禽流感病毒H7N9型的实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法 参照国家生物技术信息中心(NCBI)公布的H7N9基因HA序列,设计特异性引物及TaqMan探针; 构建阳性重组质粒,验证其最低检测拷贝数、重复性及特异度。结果 试验构建的阳性重组质粒,线性关系在6×10² copies/μl～6×10⁸ copies/μl范围内检测结果良好; 用该方法测得最低拷贝数为600 copies/μl,特异度和重复性(CV<1%)良好,无交叉反应; 用该荧光定量RT-PCR检测方法检测8份阳性样品和8份阴性样品,准确率为100%(16/16)。结论 实验建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于禽流感病毒H7N9型的快速检测。     

五重荧光定量RT-PCR法检测甲型流感病毒

目的建立一种五重荧光定量RT-PCR检测并鉴别流感病毒A(Flu A)及血凝素H3、H5、H7基因亚型的方法。方法以人细胞核糖核酸酶P(RNase P)基因为内参照,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针。构建质粒标准品用于分析该方法的灵敏度和重复性,利用不同来源的呼吸道病毒样本进行特异性分析。结果该法检测Flu A、H3、H5、H7以及RNase P质粒标准品的灵敏度均达102copies/m L,特异性达100%,各对引物和探针仅检测出相应的病毒,未有交叉反应,变异系数(CV)≤1.99%。结论建立的五重荧光定量RT-PCR法灵敏度、特异性高,重复性好,可用于检测出多种甲型流感亚型,对甲型流感病毒不同亚型早期诊断具有一定的价值。     

利用包膜RNA技术构建的假病毒颗粒在病原体灭活有效性验证中的应用

目的表达含Sindbis病毒特异性序列的包膜RNA颗粒,评价其在Sindbis病毒灭活中作为有效评价物的可行性。方法构建含Sindbis病毒特异性序列的重组质粒,表达出Sindbis假病毒颗粒。将Sindbis病毒和假病毒颗粒做亚甲蓝光化学灭活处理,然后检测Sindbis病毒感染性,同时荧光定量PCR检测Sindbis病毒和假病毒颗粒核酸损伤,3者数据做相关性分析。结果 Sindbis病毒和假病毒颗粒的核酸损伤程度随着Sindbis病毒感染性降低而增强,10000lux光照20min后感染性不再降低且核酸定量log值也不再有明显下降,与空白对照相比,Sindbis核酸降低值分别与Sindbis病毒感染性降低值和假病毒颗粒核酸降低值呈线性相关性(R2=0.9937和R2=0.9975)。结论提示结合荧光定量PCR检测,假病毒颗粒作为Sindbis病毒光化学灭活的有效评价物具有可行性。     

云南省保山市蚊虫中检测到基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒

目的 调查云南省保山市蚊虫及其自然感染虫媒病毒状况，为蚊媒病毒病防控提供参考依据。方法 2015年9月采用诱蚊灯法在保山市隆阳区农村人房和畜圈采集蚊虫标本，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）用于检测蚊虫标本中黄病毒属、甲病毒属、布尼亚病毒属和流行性乙型脑炎病毒（乙脑病毒）等相关病毒核酸，阳性者进行C/prM基因序列测定、同源性和系统进化分析。结果 共捕获蚊虫3种8 202只，三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）、中华按蚊（Anopheles sinensis）和骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus）构成比依次为88.50%（7 259只）、11.43%（937只）和0.07%（6只）。蚊虫标本分30批进行RT-PCR检测，14批三带喙库蚊中检测到乙脑病毒核酸，并获得14株乙脑病毒C/prM基因核苷酸序列。同源性和进化分析表明，14株乙脑病毒与基因Ⅰ型乙脑病毒同在一个进化分支，并与2007年保山市腾冲县和2010年德宏傣族景颇族自治州（芒市和瑞丽市）的基因Ⅰ型乙脑病毒具有较近的进化关系。结论 三带喙库蚊为保山市的优势蚊种和乙脑病毒主要传播媒介，当地存在基因Ⅰ型乙脑病毒流行，此为近10年保山市首次检测到基因Ⅰ型乙脑病毒。     

柯萨奇病毒A组5型实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

目的 建立柯萨奇病毒A组5型(CVA5)特异的一步法实时荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)核酸检测方法。方法 以流行于遵义地区的CVA5病毒株和NCBI基因库中随机下载的CVA5 VP1基因序列作为参考序列,分析这些序列的保守区域,在其保守区设计特异性的引物与Taqman探针,建立检测CVA5的一步法实时荧光RT-PCR。通过构建含CVA5 VP1保守区域的重组质粒,绘制标准曲线,并对检测方法的灵敏度、特异性、重复性及临床样本检出限进行评价。利用该方法对遵义地区273份未明确分型的肠道病毒阳性样本进行检测,将检出的部分CVA5阳性产物进行测序。结果 成功建立一种基于实时荧光RT-PCR的CVA5检测方法,该方法在10⁴～10⁹copy/mL范围内具有良好的线性关系(R²>0.999),平均扩增效率为102.26%。灵敏度高,对临床样本的检出限为10³copy/mL。该方法的特异性强,与柯萨奇病毒A组2型(CVA2)、柯萨奇病毒A组4型(CVA4)、柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、丙型肝炎病...     

寨卡病毒荧光定量PCR检测方法的建立与验证

目的建立基于一步法实时荧光定量PCR技术的寨卡病毒检测方法。方法通过分析寨卡病毒全基因组核酸序列,根据其NS5基因片段,设计特异性引物,构建重组质粒,经体外转录后获得寨卡病毒RNA,即阳性标准品,建立标准曲线,利用RT-PCR方法对检测体系做灵敏性、重复性试验,以寨卡病毒GZ01毒株与Huh7.5.1细胞RNA混合或加入寨卡病毒的血浆标本对本方法测试。结果建立的标准曲线线性关系良好,灵敏度较高,检测下限可达0.1 PFU/mL,标准曲线方程:Y=-3.353X+36.345,相关系数(CV)可达0.999。该方法特异性较好,对登革病毒和丙肝病毒核酸检测无交叉反应,可检出寨卡病毒感染的细胞样品和血浆样品中的寨卡病毒。结论成功建立了1种基于实时荧光定量PCR的寨卡病毒核酸检测的高灵敏性方法。     

诺瓦克病毒ORF1-ORF2序列核酸片段克隆的构建

目的构建诺瓦克病毒核酸片段克隆。方法选取诺瓦克病毒阳性标本,应用RT-PCR方法扩增目标片段,将其克隆到质粒,通过酶切、测序鉴定。结果成功构建诺瓦克病毒核酸片段克隆。结论成功地获得了可作为核酸检测阳性对照的诺瓦克病毒核酸片段克隆,为该病毒的分子生物学检测和进一步研究奠定了基础。     

一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价

目的 探讨一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的适用性及有效性。方法 选取流感病毒H3亚型、乙型Yamagata系细胞株和甲型H1N1型鸡胚株各1株,对其倍比稀释液及2015年北京市流感病原学监测阳性的67份咽拭子样本,同时采用快速提取法及离心柱提取法提取病毒核酸,经实时荧光PCR法进行定性、定量检测,检测结果采用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果 快速提取法提取细胞培养液、鸡胚培养液中流感病毒核酸的最低检测限高于离心柱法10倍,咽拭子样本则高100倍;快速提取法提取核酸后检测到的病毒载量均低于离心柱法,其中对含有病毒量较高的毒株检测到的病毒载量低于离心柱法10倍,而对病毒量较少的咽拭子样本,则低100倍;快速提取法稳定性优于离心柱法;提取后的核酸-80℃保存10 d后冻融复测,快速提取法核酸损失量大于离心柱法。67份离心柱提取法检测阳性咽拭子样本使用快速提取法提取核酸后检测,两种方法阳性符合率总计为92.54%,其中10～102拷贝/ml组,阳性符合率为76.92%,102～103拷贝/ml组,阳性符合率为92.59%,103拷贝/ml组,阳性符合率为100%。结论 快速提取法具有稳定性高、易于操作、不易污染的优势,适用于细胞培养液、鸡胚培养液等病毒含量较高的大量样本中流感病毒核酸提取,适于检测样本量大、人手不足、设备欠缺的基层实验室使用;但-80℃冻融后核酸损失量较大,不宜反复冻融后使用;传统的离心柱法对于病毒含量较少的咽拭子样本及核酸需被反复冻融使用时具有优势。     

湖北省荆州市流感监测哨点监测质量及流感病毒核酸检测阳性率影响因素分析

目的比较湖北省荆州市2家流行性感冒（流感）监测哨点医院监测质量及流感病毒核酸检测阳性率（PR）的影响因素,为提高流感监测质量提供参考。方法从中国流感监测信息系统收集 2010— 2018年度荆州市2家流感监测哨点（哨点A、哨点B）的流感样病例（ILI）和病原学监测资料,采用ILI百分比（ILI%）和ILI PR评价2家哨点监测结果。 将医院、病例性别、是否为流行季节、发病与采样时间间隔、采样与检测时间间隔等因素作为自变量,核酸检测结果作为因变量,采用二分类logistic回归分析核酸检测结果的影响因素。结果哨点A和哨点B ILI%分别为2.34%和1.34%,差异有统计学意义（χ2＝3 096.26,P＝0.000）。 哨点A和哨点B的PR分别为13.63%和14.84%,差异有统计学意义（χ2＝4.69,P＝0.030）。 2家哨点医院ILI%、PR变化趋势均一致（r_s＝0.568,P＝0.000;r_s＝0.824,P＝0.000）。 哨点A和哨点B的ILI%和PR变化趋势一致（r_s＝0.306,P＝0.026;r_s＝0.477,P＝0.000）。 logistic回归分析结果显示,PR与医院（OR＝1.15,95% CI:1.05 ~ 1.26）、是否为流行季节（OR＝3.19, 95% CI:2.88 ~ 3.52）有关。结论荆州市流感监测哨点医院整体运行良好,2家流感监测哨点ILI%与PR均存在差异,监测哨点和流行季节是影响PR的主要因素。     

A one-step dipstick assay for the on-site detection of nucleic acid

Objectives

We have developed a one-step nucleic acid dipstick assay (NADA) for visually detecting polymerase chain reaction (PCR) products within 3 min. “One-step” means that there were no additional procedures between amplification and detection.

Methods

This method was achieved through the use of asymmetric PCR and specially designed probes with appropriate melting temperature values. We initially combined one-step NADA with asymmetric capillary convective PCR (ACCPCR), an easy and rapid nucleic acid amplification technique, to construct an on-site nucleic acid diagnostic platform.

Results

We developed a diagnostic assay for the hepatitis B virus based on the ACCPCR-NADA platform to verify its feasibility. It exhibited an analytical sensitivity of three copies per test and a broad detection spectrum including genotype A–I. It also showed 97.9% sensitivity and 100% specificity based on the results observed using 67 serum samples with the Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (COBAS) system as the standard for comparison.

Conclusion

The results provide evidence for the feasibility of using an ACCPCR-NADA platform in practical applications, especially in on-site test.     

基于CRISPR-Cas12a蛋白的副溶血弧菌及tdh基因检测分析

目的 将重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,建立一种快速检测并分型副溶血弧菌的检测方法.方法 通过纯化CRISPR相关蛋白Cas12a,设计和合成RAA引物、crRNA和单链DNA报告分子,建立副溶血弧菌的荧光和试纸条检测方法.采用煮沸法提取细菌核酸,经RAA扩...     

22种呼吸道病原体核酸多重联检试剂盒检测效能评估

目的 通过对1种新型呼吸道病原体核酸多重联检试剂盒检测效能评价,为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、流行性感冒(流感)病毒等叠加流行的大规模检测提供适宜技术方法.方法 收集北京地区急性呼吸道感染病例阳性标本252份,采用4种核酸检测试剂盒(3种核酸多重检测试剂盒A、B、C及1种SARS-CoV-2检测试剂盒D)分别...     

Koutango病毒TaqMan反转录聚合酶链式反应方法的建立

目的建立Koutango病毒(KOUTV)的实时荧光定量TaqMan反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法。方法从GenBank中下载KOUTV基因序列,进行多序列比对分析,针对NS5基因中的高保守序列片段设计KOUTV的特异引物与探针,用4科9种病毒进行检测方法特异性验证,通过平行重复实验验证检测方法稳定性,利用体外转录的RNA标准品建立了KOUTV的NS5基因拷贝数的绝对定量分析模型。结果引物与探针工作特异性良好,同一样品重复检测循环阈值(Ct)的变异系数均小于1.5%,定量分析模型灵敏度达到1.0×10^2拷贝/反应。通过本研究建立的快速检测方法对新疆采集的112批,6328只蚊虫进行了测定,结果均为阴性。结论成功建立了KOUTV的高特异性、高敏感性的TaqMan RT-PCR检测方法,可应用于实验室和临床诊断。