25株艰难梭菌多位点序列分型

目的比较两种对艰难梭菌多位点序列分型(MLST)的方案并探讨不同来源艰难梭菌之间的关系。方法选取来自不同人群的25株艰难梭菌,分别用Lemee方案(aroE,ddl,dutA,tpi,recA,gmk,sodA管家基因)和David方案(adk,atpA,dxr,glyA,recA,soda,tpi管家基因)进行多位点序列分型,用START系统及Bionumerics软件分析这些位点及等位基因谱的特征。结果位点分析结果表明,Lemee方案中有2株菌的ddl位点为无效位点,其余的6个管家基因有3～5个等位基因,等位基因之间有3～11个多态性位点。非同义突变/同义突变(dN/dS)为0.000 0～0.261 1;David方案中的7个管家基因有3～5个等位基因,等位基因之间有2～9个多态性位点。dN/dS为0.000 0～0.280 6。等位基因图谱特征结果表明,Lemee方案出现了13个ST型别(ST1/2/3/6/7/13/31/39/48/A/B/C/D),ST6(5)为优势型别;David方案共出现11个ST型别(ST2/3/15/35/37/54/55/92/99/102/117),其中ST54(6),ST37(5)为优势型别。来源于成人和婴幼儿的菌株并未形成各自特异的序列型。结论对于艰难梭菌多位点序列分型,David的方案更可取,ST与宿主人群的来源没有明显的相关性。     

中国副溶血弧菌多位点可变数目串联重复序列分型方法的建立

目的建立适合中国分离的副溶血弧菌的多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）方法。方法以我国不同来源的420株副溶血弧菌为研究对象,针对现有的12个可变数目串联重复序列（VNTR）位点使用PCR扩增,产物进行毛细管电泳,对不同位点及其组合的分型能力结果进行分析。结果副溶血弧菌的12个VNTR位点中,VPTR7的扩增率比较低（71.90%）,VP1-17不具备多态性（Nei值＝0.00）,VP2-07的稳定性差;6个位点的组合（VP1-10、VPTR1、VPTR3、VPTR5、VPTR6、VPTR8）分型方案可将420株副溶血弧菌分为311个MLVA型,并可区分相同的ST型菌株。结论6个位点的MLVA分型方案经济性和区分度最优,建立了适合中国分离副溶血弧菌的MLVA分型方案。     

某院产ESBLs大肠埃希菌多位点序列分型研究

目的了解郑州大学附属肿瘤医院临床和环境中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌多位点序列分型(MLST)及其遗传进化关系,为监测产ESBLs菌株的流行和医院感染控制提供依据。方法采用基因扩增和测序的方法对26株产ESBLs大肠埃希菌7个管家基因进行序列分析,并与MLST数据库比对,得到每个菌株相应的等位基因号。结果 26株产ESBLs大肠埃希菌获得16种序列分型(ST),其中3株为ST69型、3株为ST131型。结论产ESBLs大肠埃希菌遗传背景多样化,ST131型和ST69型为本研究主要型别,其它型别散在分布。     

无乳链球菌的分子分型及耐药特征分析

目的了解北京一家三级医院临床分离无乳链球菌的血清型、耐药性、毒力基因的特征及多位点序列分型（MLST）特征。方法收集2018年一家医院住院患者分离到的无乳链球菌,通过聚合酶链式反应方法进行分子血清型分型和毒力基因检测,用MLST方法进行分子分型,通过VITEK 2药敏分析仪对菌株耐药性进行分析。结果该院2018年分离到31株无乳链球菌,MLST以序列分型（ST）10为主,占29.03%,其次为ST17、ST19、ST1、ST12、ST24和ST485,另有2株菌为新的ST;血清型分型以Ⅰb 为主,占45.16%,其次为Ⅲ、Ⅴ及Ⅰa型。 31株无乳链球菌中对氨苄西林、奎奴普汀、利奈唑胺和万古霉素全敏感,对四环素耐药率最高（64.52%）,其次为左氧氟沙星（58.06%）和克林霉素（38.71%）。 克林霉素耐药仅发现于Ⅰb 和Ⅴ型。本研究的31株无乳链球菌,hylB、cylE、cfb和lmb毒力基因检测均为阳性;毒力基因bac和fbsA在不同分型中携带率有差异,其中bac及fbsA在Ⅰb型中携带率较高。结论本研究基于MLST分型和血清分型,表明不同型别间耐药性和毒力基因的差异,提示Ⅰb和Ⅴ型的耐药性及Ⅰb型的毒力需要引起关注。     

福建省福州市食源性疾病暴发事件副溶血弧菌基因组遗传特征分析

目的 获得福建省福州市四起暴发事件分离的副溶血弧菌序列分布特点，并分析不同菌株间遗传关系。方法 对19株副溶血弧菌进行全基因组序列测定，使用相应的生物信息学软件对测序数据进行基因组装和基因预测，借助相关数据库获得不同菌株的多位点序列分型、耐药基因和毒力基因情况，采取最大似然法构建系统发育树。结果 19株副溶血弧菌依据7个管家基因分型，得到4种序列型（ST），其中ST3为优势型，1株菌暂定为未知型。全部菌株均携带β-内酰胺类和四环素类抗生素耐药基因，同时携带影响宿主细胞致病力的重要毒力基因。2种喹诺酮类耐药基因和trh毒力基因仅在F265菌株中检出。全基因组系统发育树进化分析结果显示，暴发菌株被分成3个进化分支，E2019、E2020-1和E2020-2的菌株主要集中在lineage B进化分支，E2018的菌株均在lineage C进化分支。结论 四起暴发事件由ST3克隆复合体主导，并伴随其他ST型别菌株的影响。同起暴发事件分离菌株具有遗传多样性，菌株测序数据为暴发事件溯源提供技术支持。     

多位点序列分型及其应用

多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。这种方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列，分析菌株的变异。MLST操作简单，结果能快速得到并且便于不同实验室的比较，已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究。随着测序速度的加快和成本的降低，以及分析软件的发展，MLST逐渐成为细菌的常规分型方法。     

深圳市南山区腹泻患者弯曲菌感染及病原学特征分析

目的获得本地区秋季腹泻患者弯曲菌的感染现状及病原学特征。方法收集深圳市南山区2018年9 — 11月腹泻患者的粪便标本,采用双孔滤膜法分离培养弯曲菌并应用荧光聚合酶链式反应（PCR）方法进行菌种鉴定。 应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）对分离菌株进行分子分型,应用琼脂稀释法获得菌株对11种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。 根据菌株的序列分型（ST）结果,结合既往菌株分型数据进行本地区菌株的遗传聚类分析。结果共采集腹泻患者粪便标本150份,其中男性患者74例,女性患者76例,年龄在1～86岁之间。 150份粪便标本中共分离到弯曲菌18株,检出率为12.00%（18/150）。 菌种鉴定发现,空肠弯曲菌占77.78%（14/18）,结肠弯曲菌占22.22%（4/18）。 14株空肠弯曲菌可分为11种PFGE带型,8个ST型别,以ST9763最多（35.71%,5/14）,是本研究新发现ST型别。 14株空肠弯曲菌对四环素全部耐药,对红霉素、阿奇霉素、泰利霉素、庆大霉素、链霉素及克林霉素100.00%敏感。 ST型别最小生成树聚类分析结果表明,不同宿主来源菌株没有显著聚集性,腹泻患者分离菌株分布在不同来源的组群中。结论采用双孔滤膜法提高了腹泻患者中弯曲菌的检出率。本地区弯曲菌的感染仍以空肠弯曲菌为主, 分离菌株对四环素类、喹诺酮类抗生素呈现较高的耐药特征,分离的空肠弯曲菌ST呈弥散分布特点。     

上海市一例肠出血性大肠埃希菌O157∶H7感染病例的病原学分析

目的通过流行病学调查与病原菌鉴定，并结合既往相关菌株资料，对2016年6月上海市腹泻病综合监测中报告的1例肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157∶H7感染病例进行病原学分析。方法对患者开展流行病学调查。 采集标本后进行菌株分离培养、生化鉴定并确定血清型；利用聚合酶链式反应（PCR）检测所携带的毒力基因；采用微量肉汤稀释法进行药敏试验；应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术进行分子分型；通过全基因组测序获取序列信息进行多位点序列分型（MLST）及单核苷酸多态性分析。结果流行病学调查未发现可疑传染源。 患者样本分离出EHEC O157∶H7；携带eae、stx2基因；对进行试验的16种抗生素均敏感；菌株图谱带型与以往监测中分离菌株带型均不相同；MLST分型为ST11型，与以往分离菌株核心基因组差异较大。结论上海市较长时间无检出EHEC O157∶H7菌株的病例记录，通过对此次分离的菌株的全面检测，确定了其毒力基因、耐药性和MLST型别，并发现新的PFGE带型，其核心基因组与以往菌株呈现出一定差异，值得进一步关注。     

安徽省马鞍山市分离的枸橼酸杆菌的分子分型

目的 了解中国安徽省马鞍山市分离到的枸橼酸杆菌的分子流行病学特征。方法 2007-2011年从安徽省马鞍山市的腹泻患者粪便、食品和食品加工者肛拭分离到62株枸橼酸杆菌,包括13株弗氏枸橼酸杆菌、41株杨氏枸橼酸杆菌和8株布氏枸橼酸杆菌。所有菌株用Xba Ⅰ酶切进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型和扩增7个管家基因的多位点序列分型（MLST）分析。结果 PFGE将62株枸橼酸杆菌分成43个带型（PTs）,MLST将其分成53个ST型别（STs）。CITX01.CN0039是PFGE的优势带型,由2007-2008年间从食品和腹泻患者粪便分离的7株杨氏枸橼酸杆菌组成。53个ST型别分成5个ST序列群,ST序列群39个优势菌株来自腹泻患者粪便、食品和食品加工者肛拭分离的枸橼酸杆菌。从腹泻患者粪便、食品和食品加工者肛拭分离得到的枸橼酸杆菌具有相同的PTs和STs。结论 在食品和人群中监测枸橼酸杆菌对预防和控制枸橼酸杆菌引起的腹泻是必要的。     

2006–2017年辽宁省脑膜炎奈瑟菌分子分型研究

目的 对2006 — 2017年辽宁省流行性脑脊髓膜炎（流脑）患者、密切接触者分离的17株脑膜炎奈瑟菌（Nm）进行分析,了解菌群种类及分子分型特征。 方法 采用多位点序列分型技术,应用Splits Tree软件、eBURST方法进行菌株遗传进化和聚类分析。 结果 17株菌株共有11种不同序列型（ST）,分属于ST-5、ST-4821、ST-11克隆群和其他无序列群分类（UA）。ST-5 complex/subgroup Ⅲ所占比例最多,占47.06%（8/17）,来自A群的患者5株,密切接触者3株,ST-7型为主要优势型别。ST-4821克隆群有ST-4821型和ST-5664型。ST-4821型来自1例2012年的C群患者,ST-5644型来自1例2012年的B群密切接触者。ST-11克隆群仅1株为ST-11型,来自2009年W135群的密切接触者。B群和不可分群6株有6种ST型,呈多样性,不存在优势序列群。其中ST-12994为新发现ST,来自2017年密切接触者。 结论 辽宁省流脑菌株分子基因型别多样性,存在多个克隆群,ST-5 complex/subgroup Ⅲ克隆群为A群优势克隆群。初步揭示了辽宁省Nm的遗传进化关系,为流脑疾病控制和预防提供了有力科学依据。      

我国施万菌分布及其分子特征分析

目的 探索中国施万菌的种群分布、分子流行病学特征及遗传进化关系,为施万菌的流行病学监测和进化研究提供依据。方法 利用基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）联合gyrB基因测序进行施万菌种水平鉴定;利用7个管家基因（16S rRNA、gyrA、gyrB、infB、recN、rpoA和topA）进行多位点序列分型（MLST）,利用BioNumerics 7.1软件对各个序列类型（ST）构建最小生成树。结果 本研究共收集全国201株施万菌,鉴定到10个不同的菌种,其中海藻施万菌所占数量最多。不同分离来源中的施万菌种分布有所差异,临床和食品来源的施万菌种分布相似。MLST将施万菌实验室分离株划分成136个ST型和15个克隆复合体（CCs）,其中CC12为海藻施万菌优势克隆群。结论 我国分布的施万菌病原谱丰富多样,提示这些菌株具有高度的遗传多样性。     

2006-2016年四川省猪链球菌血清2型多位点序列分型分析

目的 了解四川省2006-2016年猪链球菌血清2型菌株的分子流行病学特征,分析10年间分离株之间的关联,为四川省人感染猪链球菌病防控提供参考依据。方法 通过聚合酶链反应法扩增猪链球菌基因组上的7个管家基因片段并进行测序,对2006-2016年四川省猪链球菌病例样本中分离的27株猪链球菌血清2型菌株进行多位点序列分型分析。结果 27株猪链球菌血清2型菌株分为2个ST型,其中19株为ST7型,其余为ST1型;2006-2007年以ST7型为主,2007年后主要为ST1型。结论 近年四川省人感染猪链球菌病均为散发,未出现暴发疫情,可能与流行菌株的ST型变化相关。     

2011－2016年江苏省苏州市脑膜炎奈瑟菌分子流行特征分析

目的 对2011 – 2016年江苏省苏州市分离于患者、健康人群和密切接触者的脑膜炎奈瑟菌（Nm）进行血清群鉴定,了解苏州市Nm的血清群及遗传进化关系。 方法 采用乳胶凝集和多位点序列分型方法,对分离到的33株Nm的7个管家基因序列进行测定,并与PubMLST数据库中序列进行比对,确定等位基因谱型及序列型,采用Cluster 3.0分析菌株间的进化关系。 结果 33株Nm中B群占66.67%（22/33）,W135群占24.24%（8/33）,C群、Y群和未分群各占3.03%（1/33）;2011年分离的3株W135群属于高致病性克隆系ST-11 complex/ET-37 complex,2012 – 2013年分离的B群5株属于高致病性克隆系ST-4821 complex。 结论 2011 – 2016年苏州市Nm主要以B群为主,W135群次之,基因型以多克隆系并存,出现高致病性克隆系ST-11 complex/ET-37 complex W135群和ST-4821 complex B群,提示应密切监测菌株型别,预防流行性脑脊髓膜炎的暴发流行。      

光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌环境分离株的氟康唑敏感性与多位点序列分型分析

目的 分析分离自树叶、树皮和腐殖质的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌,对其进行耐药性分析和分子流行病学分型,比较环境分离株与临床分离株的进化关系,为流行病学调查及有效控制侵袭性假丝酵母菌感染提供理论支持。 方法 2017年9月采集云南省境内环境标本,分离培养提取菌株DNA进行转录间隔区测序鉴定;使用微量肉汤稀释法进行氟康唑药敏实验;采用多位点序列分型进行分子流行病学分型;利用eBURST分析菌株亲缘性。 结果 采集环境标本200份,分离光滑假丝酵母菌3株和热带假丝酵母菌10株。 13株环境分离株均对氟康唑敏感。 3株光滑假丝酵母菌的序列型均为ST3,10株热带假丝酵母菌被分为7个二倍体序列（DST）,包括4个新DST型（DST813 ~ DST816）。 eBURST分析显示,光滑假丝酵母菌均为CC3型,CC730是热带假丝酵母菌环境株的主要型别。 结论 环境分离株与临床分离株存在相同的起源株。 树叶、树皮或腐殖质中的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌可能对人类健康造成危害,是人类假丝酵母菌感染的潜在来源。      

医院感染光滑念珠菌耐药性及流行病学分析

目的分析仁济医院光滑念珠菌的基因分型以及不同基因型光滑念珠菌的药物敏感性结果,以了解仁济医院光滑念珠菌的耐药性和流行情况,并探讨两者间是否存在相关性。方法运用多位点序列分型(MLST)技术,对34株光滑念珠菌的6个管家基因进行测序分析,利用Clustalx软件与MLST数据库进行序列比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(ST)。利用Clustalx软件绘制进化树,同时通过eBURST程序将菌株分为各个克隆系,以比较不同基因型之间亲缘关系的远近。采用ATB FUNGUS半自动真菌鉴定和药物敏感性分析系统进行药物敏感性试验,结合基因分型结果,运用Ridit分析方法探究两者的联系。结果 34株光滑念珠菌经MLST分型,得到6个ST,其中ST-7 27株,占总数的79.4%(27/34);ST-10 3株,占总数的8.8%(3/34),其余4型(ST-3、ST-15、ST-43、ST-55)各1株。34株光滑念珠菌对氟胞嘧啶、两性霉素B 100.0%敏感,对伏立康唑和氟康唑的敏感率分别为97.1%和91.2%,伊曲康唑抑菌效果差,敏感率仅11.8%。以ST-7为标准组,氟康唑、伏立康唑及伊曲康唑药物组中ST-10组及其他ST组均包含标准组的平均Ridit值。结论 ST-7为仁济医院光滑念珠菌中优势菌株;光滑念珠菌的耐药谱与基因型相关性差。     

浙江地区临床分离粪肠球菌的多位点序列分型及耐药性分析

目的对粪肠球菌进行多位点序列分析(MLST),探讨浙江地 区粪肠球菌的分子分型与耐药性的相关性。方法收集2018年1～8月 浙江地区多家医院临床分离的粪肠球菌,总计74株;根据粪肠球菌的7个管家基因序列对74 株菌株进行多位点序列(MLST)分型;同时对该74株菌株进行药敏实验,分析MLST与药物耐药 性的相关性。结果74株菌分为20个ST型,3个型别为新的型别。ST1 6和ST179是浙江地区的优势型别菌株,同属于CC16克隆复合体,两者占所有菌株的55%以上 ,其中ST16包含21株菌(占28.38%),其次为ST179,包含20株菌(占27.03%),再次是ST4和 ST6,各包含6株(占8.11%)。药敏结果显示,粪肠球菌耐药程度高的抗生素主要是四环素及 红霉素,其耐药率分别为89.2%和73%,不同ST的粪肠球菌均对这两种抗生素产生耐药。ST1 79与ST16两者耐药谱相似,区别主要是ST179对利福平均为敏感,而ST16有部分(33.3%)会 对利福平产生耐药;另外,ST6对喹诺酮类药物及高浓度的庆大霉素耐药,ST4型的粪肠球 菌会对青霉素产生耐药。结论目前浙江省粪肠球菌分离菌株主要以 CC16(包含ST16与ST179)克隆株为主,不同MLST分型的菌株与耐药可能有一定的相关性,仍 需验证。     

产KPC-2 肺炎克雷伯菌的MLST 和wzi 分型分析

目的探讨产KPC-2肺炎克雷伯菌的多位点序列分型(MLST)并确定其wzi分型。方法收集南京鼓楼医院2012—2014年分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌108株,采用改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株,PCR和DNA测序技术鉴定KPC-2编码基因。对产KPC-2菌株,用MLST技术分析其遗传相关性,并用PCR技术对其进行wzi分型。结果 108株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中,72株产KPC-2。72株产KPC-2菌株经MLST分型分为9个不同克隆型,其中ST11(61/72,84.7%)最为流行,其次为ST15(4/72,5.6%);72株产KPC-2细菌有7种wzi分型,wzi209(K47荚膜型)最为流行(58/72,80.6%),其次为wzi64(K64荚膜型)(6/72,8.3%)。结论产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11型在我院存在克隆播散,大多为wzi209,荚膜型为K47,需加强感染控制措施。     

江苏省东台地区家畜非O157产志贺毒素大肠埃希菌耐药性及多位点序列分型分析

  目的  了解江苏省东台地区家畜来源非O157产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）抗生素耐药表型、耐药基因,以及多位点序列分型（MLST）情况。  方法  于2019年5月,江苏省东台市采集家畜粪便样本301份（羊粪便231份,牛粪便70份）,分离非O157 STEC菌株。 采用改良微量肉汤法测定菌株对21种抗生素最小抑菌浓度（MIC）;通过全基因组测序技术对O∶H血清型、耐药基因和多位点序列型别进行预测。  结果  在68株非O157 STEC中,有32株对至少1种药物耐药。 其中,STEC对四环素耐药率最高（42.6%）,其次分别对阿奇霉素（36.8%）、复方新诺明（35.3%）、链霉素（32.3%）、氯霉素（30.9%）、环丙沙星（29.4%）等9种抗生素耐药;共识别出25种耐药基因,其中,氨基糖苷类耐药基因和叶酸途径抑制剂类耐药基因携带率最高（44.1%）,其次为四环素类耐药基因tet(A)（42.6%）;MLST将分离株分为13种ST型,其中ST43（19.1%）和ST155（16.2%）比例较高。 最小生成树显示,具有相同血清型的STEC菌株多聚集在一起。 STEC中4种ST型别（ST25、ST40、ST43、ST675）分别与引起肠溶血性尿毒综合征相关的肠出血性大肠埃希菌（HUSEC）聚类成簇。  结论  江苏东台地区家畜中非O157 STEC耐药形势复杂,且存在多重耐药现象。 此外,该地区STEC菌株对人群存在潜在威胁,家畜作为非O157 STEC宿主应引起重视。     

2016-2019年江苏省南京市人感染副溶血弧菌分子特征分析

  目的  了解江苏省南京市副溶血弧菌临床分离株的分子特征,为其防控提供参考。  方法  收集2016—2019年从腹泻和食物中毒患者分离的副溶血弧菌临床分离株并进行血清型分型,运用聚合酶链式反应（PCR）方法检测菌株的tlh、tdh、trh、toxRS/new、ORF8五种毒力基因,采用多位点序列分型（MLST）对菌株进行分子分型分析。  结果  2016—2019年共收集93株临床分离株,菌株优势血清型为O3∶K6（65/93,69.9%）,均携带tlh基因,73株属于tdh+trh- toxRS/new+的大流行菌群,非大流行菌群菌株中有5株为tdh-trh-非致病株。 共检出13个ST型,以ST3为主（68/93,73.1%）。  结论  南京地区副溶血弧菌以O3∶K6、ST3型大流行菌群菌株为主,非大流行菌群、非致病株并存。