河弧菌AL536_RS29525基因功能研究

目的 探讨河弧菌基因组中VflT6SS2核心基因簇上游paar基因簇中AL536_RS29525的序列特征、对VflT6SS2分泌功能和杀菌活性的影响以及可能的调控机制.方法 利用Muscle、GeneDoc软件进行AL536_RS29525基因编码产物的序列特征分析;同源重组技术构建AL536_RS29525的缺失株...     

河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇中vgrG操纵子的调控研究

  目的  探究河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇hcp-vgrG中vgrG操纵子的调控。   方法  使用荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测野生株和VfqI-VfqR系统缺失株中vgrG的mRNA水平。 利用启动子-lux报告质粒系统检测冷光值,确定vgrG启动子在河弧菌野生株、缺失株、回补株中的活性差异。 在大肠埃希菌中,导入VfqR过表达质粒,检测vgrG启动子-lux报告质粒冷光值,确定VfqR可否激活vgrG启动子。  结果  ?vfqI、?vfqR和?vfqI-vfqR缺失株中vgrG mRNA水平和启动子活性均显著低于野生株;在?vfqR中回补VfqR表达质粒pSRvfqR和在?vfqI中分别添加3-oxo-C₁₀-HSL、C₁₀-HSL和3-oxo-C₁₂-HSL AHLs分子均能恢复vgrG启动子活性,并且3种AHLs分子效果大体一致。 在大肠埃希菌中过表达VfqR并添加上述3种外源AHLs,对vgrG启动子活性没有影响。  结论  VfqI-VfqR密度感应系统在启动子水平正性调控vgrG操纵子,并且该调控作用是间接的。     

鲍曼不动杆菌Hcp基因原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的 获取鲍曼不动杆菌Ⅵ型分泌系统（T6SS）核心组分溶血素共调节蛋白（Hcp）。方法 根据ATCC17978菌株Hcp基因序列设计并合成一对含XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点的特异性引物,利用PCR方法扩增Hcp基因全长,定向克隆至含His标签的pET-28a(+)载体,采用PCR、双酶切和测序技术验证载体是否构建成功,进而转化Escherichia coli (E.coli) BL21(DE3)菌株,以IPTG诱导表达Hcp蛋白,分析目的蛋白的表达方式及最佳表达条件,通过Western blot鉴定目的蛋白,超滤管浓缩并保存。结果 获得了预期500bp左右的Hcp基因,并成功克隆至pET-28a(+)质粒,经IPTG诱导表达,成功纯化出Hcp融合蛋白。结论 成功获得鲍曼不动杆菌Hcp基因的原核表达产物,为深入研究T6SS及Hcp奠定了基础。     

一株精氨酸双水解酶阴性河弧菌的分子遗传学分析

目的赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶阴性、精氨酸双水解酶阳性和阿拉伯糖发酵实验是区分河弧菌和其他非凝集弧菌的特征性化学指标。本研究对发现的1株精氨酸双水解酶阴性的河弧菌Ma-2531进行了分子遗传学分析。方法利用多对特异性引物对精氨酸双水解酶代谢通路的arc操纵子区基因簇进行普通聚合酶链反应(PCR)扩增,并对产物进行测序分析,同时比较Ma-2531和精氨酸双水解酶阳性菌株EF85003的生长曲线和培养液pH值的变化。结果针对arcBCA基因簇序列的3对引物arc-F/arc-R、arc-F/arc-rev和arc-ck-up/arc-R均为阴性扩增,而其上下游序列特异性的引物对arc1-up/arc1-dn和arc72695-up/arc75219-dn分别扩增出预期大小的目的条带。arc1-dnRev/arc72695-upRev引物对的扩增产物序列分析显示该扩增片段包含transposase IS4序列,进一步的对比分析表明包括精氨酸双水解酶系统arcBCAD基因簇及上游的天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基和催化亚基编码基因在内的约8.6 kb的大片段发生了缺失。生长曲线和pH值测定显示菌株Ma-2531和EF85003没有明显差异。结论菌株Ma-2531中插入序列的转座导致了该菌株精氨酸双水解酶这一鉴定生化指标阴性的结果,但这种变化应只是随机和罕见的,使河弧菌生化代谢表现出多样性。     

伤寒沙门菌sRNA S2959增强细菌动力和生物膜形成能力

目的研究伤寒沙门菌小RNA(sRNA) S2959对细菌动力以及生物膜形成能力的影响。方法利用Red重组系统制备伤寒沙门菌sRNA S2959缺陷株(△S2959),同时制备sRNA S2959缺陷株的空载体株(△S2959-pBAD)和回补株(△S2959-p S2959)等相关菌株。通过sRNA S2959缺陷株和野生株的生长曲线实验观察sRNA S2959缺失后对细菌生长的影响;通过细菌sRNA S2959缺陷株、空载体株、回补株的泳动能力实验和生物膜实验观察sRNA S2959对细菌动力以及生物膜形成能力的影响;再用定量PCR(q PCR)方法检测细菌鞭毛相关基因在sRNA S2959相关菌株中的表达水平。结果成功制备sRNA S2959缺陷株和回补株; sRNA S2959缺陷株和野生株在LB和TSB液体培养基中的生长曲线无明显差异;与野生株相比,sRNA S2959缺陷株的泳动能力和生物膜形成能力下调(P0.05),而回补株的泳动能力和生物膜形成能力较缺陷株显著增加(P0.05); q PCR结果显示,高表达sRNA S2959后,细菌鞭毛相关基因(flh D、fli A和flj B)的mRNA水平分别上调大约4、3和6倍。结论伤寒沙门菌sRNA S2959促进鞭毛的表达,进一步上调伤寒沙门菌动力以及生物膜的形成能力。     

浙江湖州地区2017—2020年食源性腹泻患者来源副溶血弧菌特征分析

目的 回顾性分析浙江湖州地区2017—2020年食源性腹泻患者分离的副溶血弧菌毒力基因、血清分型及药敏特征,为当地副溶血弧菌的防治提供科学依据。方法 收集浙江省湖州市5家医院食源性腹泻就诊患者粪便中分离的181株副溶血弧菌,采用副溶血弧菌O、K血清试剂对181株副溶血弧菌进行分型,PCR法检测其毒力基因(tdh、trh、tlh和T3SS1、T3SS2)和遗传标志基因(toxRS/new、orf8),K-B法检测20种临床常用抗菌药物耐药性。结果 浙江湖州地区副溶血弧菌在7、8月份检出最高[56.34%(102/181)],感染人群以青壮年(>20岁且≤40岁)为主[15.86%(83/181)]。181株副溶血弧菌主要血清型为O3:K6型,占53.6%(97/181)。181株副溶血弧菌均携带tlh,164株携带tdh,179株携带T3SS1,167株携带T3SS2α基因,1株携带trh基因,未检出携带T3SS2β基因;130株为大流行菌株,51株为非大流行菌株。181株对氨苄西林(AMP)、哌拉西林(PRL)、阿米卡星(AK)、庆大霉林(CN)、头孢呋辛(CXM)耐药性相对较高...     

MTS1基因ARF启动子基础转录调控区转录活性研究

目的　研究MTS1基因ARF启动子基础转录调控区的转录激活及其与E2 F1转录因子之间的关系。方法　以含ARF启动子基础转录调控区E2 F1结合位点野生型序列的W6重组质粒为模板 ,设计该片段中E2 F1A、B、C结合位点序列突变或缺失的引物 ,用聚合酶链反应构建该区域中E2 F1A、B、C结合位点序列突变或缺失的ZE、ZF、ZG重组质粒。再将W6、ZE、ZF、ZG重组质粒转染进Jurkat细胞 ,检测其荧光素酶报告基因的表达。结果　构建的ZE、ZF、ZG重组质粒经SacⅠ或NaeⅠ酶切鉴定和DNA序列分析得到证实。与E2 F1位点野生型重组质粒W6比较 ,突变型重组质粒ZE、ZF、ZG在Jurkat细胞中荧光素酶报告基因的表达量减少 ,以E2 F1A位点突变的重组质粒减少明显。结论　构建ARF启动子E2 F1A、B、C结合位点序列突变的重组质粒成功 ;MTS1基因ARF启动子基础转录调控区的转录激活可能与E2 F1转录因子的作用有关。     

中国脑膜炎奈瑟菌ST-4821克隆群荚膜基因簇分布特征

目的了解中国脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis,Nm）高致病性ST-4821克隆群（CC4821）荚膜基因簇分布特征,为流行性脑脊髓膜炎的传播扩散机制研究提供依据。方法使用Artemis、MEGA 6、SimPlot和RDP等软件分析41株Nm全基因组序列,分析荚膜基因簇序列差异性、序列重组和基因排布等特征。结果荚膜基因簇ACE区差异较大,重组现象多集中在AC区。 D和D′区有明显差异序列,表明这2个区并非精准复制。 荚膜基因簇存在基因反转现象。结论Nm高致病性CC4821荚膜基因簇呈现多态性、重组和基因反转等多种荚膜调节机制,可能有助于该克隆群菌株的传播扩散。     

乙型肝炎病毒rtA181V/T和rtN236T变异阿德福韦耐药株表达质粒的构建及其病毒学特征

目的构建乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异株（rtA181T／V和rtN236T）表达载体并对其体外复制能力和耐药性等病毒学特征进行体外研究。方法以含1．2倍拷贝HBV DNA全基因的质粒PUC-HBV1．2WT为模板，PCR定点诱变技术构建含阿德福韦耐药株（rtA181V／T和rtN236T）的目的质粒，测序验证并利用变异株特异检测引物进行PCR检测；转染人肝癌细胞系HepG2，ELISA检测上清中分泌的HBsAg和HBeAg水平，荧光定量PCR检测上清中病毒DNA水平，Southern blotting检测胞浆HBV复制中间体水平，比较野生株和变异株体外复制能力和对阿德福韦敏感性的差异。结果构建的rtA181T、rtA181V和rtN236T表达质粒可用于变异株特异检测引物检测相应变异的阳性对照品；转染HepG2细胞后均可获得高水平的病毒抗原表达，胞浆和细胞培养上清中可以检测到HBV复制中间体和病毒颗粒的存在；三种变异均可单独导致对阿德福韦耐药，IC50为野生株的2．8至4．7倍；体外复制能力较野生株降低，分别为野生株的94．2％、89．0％和77．7％。结论成功构建乙型肝炎病毒阿德福韦变异株表达质粒并应用于变异株特异引物扩增检测技术，体外实验证实rtA181V／T和rtN236T单独变异均可导致HBV对阿德福韦耐药，且变异株的病毒复制能力较野生株有所下降。     

弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS影响FliC的表达和分泌

目的 研究弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛功能。方法 构建弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛的精确缺失突变株(CF74T6SS)。对弗氏枸橼酸杆菌CF74和其突变株CF74T6SS的全菌蛋白和上清蛋白进行提取,并进行2-DE分析。结果 在CF74T6SS全菌蛋白中,有4个蛋白表达上调,42个蛋白表达下调,并且FliC的表达下调十分明显;在CF74T6SS的培养上清中,有27个蛋白表达上调,36个蛋白表达下调,并且FliC、FlgK和FliD的表达下调十分明显。结论 弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS可以影响FliC蛋白的表达和分泌。     

河弧菌可移动遗传元件的预测与分析

  目的  研究河弧菌中可移动遗传元件的种类和分布，探究其对河弧菌适应性进化的意义。  方法  从公共数据库中获取170株河弧菌的基因组数据，使用MGEfinder软件识别河弧菌中的可移动遗传元件，并对其种类、插入活性、分布及毒力因子进行研究。  结果  170株河弧菌基因组中共识别到1 227个可移动遗传元件。 这些元件可归类为完整噬菌体、不完整噬菌体、插入序列、含有第二类内含子的元件、含有丝氨酸/酪氨酸重组酶的元件、含有末端重复序列和编码基因的元件、只含有编码基因的元件以及不含任何开放读码框的元件共8类。 317个代表性元件序列簇中有307个转座活性都较低，但高转座活性的可移动遗传元件在河弧菌中分布更广泛。 可移动遗传元件携带的编码基因的功能主要涉及基因复制、重组、修复，以及基因转录等。 可移动遗传元件在环境分离株和临床分离株的分布没有差异。 在插入序列、含有丝氨酸/酪氨酸重组酶的元件、含有末端重复序列和编码基因的元件以及只含有编码基因的元件这4种可移动遗传元件中识别到多种毒力因子，且不同的可移动遗传元件携带的毒力因子不同。  结论  河弧菌含有多种类型、多种功能的可移动遗传元件，表现出以高转座活性可移动遗传元件为主导的适应性进化特征。     

百日咳杆菌百日咳毒素基因遗传变异分析

  目的  了解百日咳毒素（pt）基因启动子区及不同亚基编码区遗传变异特点及进化规律,为分子流行病学监控和疫苗研究提供参考依据。  方法  从GenBank数据库中下载已公开发表的百日咳菌株pt基因启动子区序列及S1～S5亚基编码序列,利用PhyML 3.0 软件构建系统发育树,确定进化簇;利用MEGA 7.0软件计算遗传距离;通过VESPA分析工具,分析不同进化簇的特征性核苷酸/氨基酸位点;利用SNAP v2.1.1软件计算不同区域选择压力。  结果  获得启动子区序列797条,含有4个进化簇,平均遗传距离为1.89×10 ?3;获得S1区序列786条,含有4个进化簇,平均遗传距离为2.43×10?4,dn/ds>1;获得S2区序列772条,含有2个进化簇,平均遗传距离为4.31×10?5,dn/ds>1;获得S3区序列772条,含有1个进化簇,平均遗传距离为3.96×10?6;获得S4区序列775条,含有1个进化簇,平均遗传距离为2.36×10?5;获得S5区序列776条,含有1个进化簇,所有序列无差异,平均遗传距离为0。  结论  pt基因不同区域遗传变异度及进化特点存在明显差别。针对pt基因的分子流行病学研究和疫苗研发应重点关注启动子区,S1亚基及S2亚基。     

单增李斯特菌感染一例患者的病因溯源

目的对一例单增李斯特菌感染患者的致病因素进行调查和溯源分析。方法在现场流行病学调查的基础上,对患者、患者家庭食品、厨房用具等进行样本采集并进行单增李斯特菌的菌株分离鉴定。对分离菌株的6个毒力基因（prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA）进行检测,使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）技术进行分子分型分析,对分离菌株进行同源性分析。结果19份样本中共分离出6株单增李斯特菌,1株来自患者,2株来自厨房环境用具样本（冰箱冷藏室内壁涂抹1份和小号菜板涂抹1份）,3株来自患者家庭中食物（分别是猪肝1份、甜玉米粒罐头1份和红焖牛肉罐头1份）。除冰箱冷藏室内壁涂抹和甜玉米粒罐头2个样本检出的菌株plcB毒力基因阴性外,另外5个毒力及其他菌株的所有毒力基因全部为阳性。分离菌株均为ST121型,PFGE带型100%一致。结论患者家庭厨房食用食物和环境皆被单增李斯特菌污染,引起交叉感染,致使患者感染发病。     

一株mcr-1阳性韦太夫雷登沙门菌的鉴定和药物敏感性特征分析

目的 鉴定1株mcr-1阳性韦太夫雷登沙门菌并对其耐药特征及机制进行分析.方法 基于肠道病原监测平台收集的分离于2015年的沙门菌株使用生化检测试验和血清凝集试验进行病原体鉴定和血清型分型,并用聚合酶链式反应方法检测mcr-1基因;使用微量肉汤稀释法进行药敏试验;使用质粒图谱和Southern-blot试验对菌株耐药基...     

Mechanism of efficient elimination of protein D2 in outer membrane of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa.

Most imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates produce an immunologically undetectable level of protein D2 (OprD2). To study the efficient elimination of the protein, we selected 23 independent imipenem-resistant mutants from a strain harboring the plasmid carrying cloned oprD and having a mutation in chromosomal oprD. All these oprD/oprD (plasmid/chromosomal) mutants expressed undetectable levels of OprD2, as shown from an assay by the immunoblotting method. Restriction maps of the DNAs from all 23 mutant plasmids could be divided into two groups. Restriction mapping and sequencing analysis of DNA from one representative plasmid from each group showed that both mutant oprD genes had a deletion. One had an 11-bp deletion in the coding region generating a frameshift mutation and a premature termination codon. Another had a large deletion encompassing the upstream site of its putative promoter region through the coding region. Northern blotting analysis showed that the gene with the 11-bp deletion was transcribed to about 1.5 kb of mRNA, but the gene with the large deletion produced undetectable RNA complementary to the oprD DNA probe. Since we analyzed only plasmid-borne oprD, we cannot exclude the possibility that the imipenem resistance caused by the chromosomal mutation is by a different mechanism(s). It is suggested, yet, that clear elimination of OprD2 from most imipenem-resistant P. aeruginosa isolates is due to efficient selection of the oprD deletion mutants.