利用基因芯片技术分析空肠弯曲菌的遗传特征

目的 为分析我国弯曲菌遗传特征,本研究根据已发表多株弯曲菌的全基因组测序特征及比对结果自行设计基因芯片,利用芯片对我国不同宿主来源菌株进行遗传特异性分析。方法 根据前期基因组水平比对分析的结果,利用Combimatrix tilingCustomArrayTM 90K芯片,设计DNA芯片。芯片包含已测序菌株 ICDCCJ07001、269.97、NCTC11168、81-176、81-116和RM1221共3384个CDS的探针序列,以及空肠弯曲菌耐药及致病性相关2个质粒共80个CDS的探针序列,与脂寡糖的合成相关基因簇16种共219个CDS的探针序列、荚膜多糖合成相关基因簇7种共160个CDS的所有序列。对我国不同宿主来源27株分离菌株提取DNA,利用芯片进行杂交,获得杂交信息并分析不同菌株CDS分布特征分析及聚类特点。结果 中国菌株的主要变异区域主要存在于与脂寡糖、荚膜多糖合成相关的基因簇、鞭毛修饰相关的基因簇、DNA限制/修饰相关的基因簇以及空肠弯曲菌Mu样噬菌体基因簇。基因组水平不同来源菌株CDS分布的聚类结果没有发现显著的宿主归因特点,但GBS相关菌株脂寡糖合成相关基因组成具有共性特征。结论 通过验证以及与过去研究的比较,本次研究中的基因芯片技术结果准确可信,本研究所用基因芯片在分析空肠弯曲菌基因多态性方面具有很好的优势,可用于弯曲菌遗传特征和重要毒力因子的分析和检测。     

猪链球菌血清未分型菌株的荚膜多糖基因簇分析

目的 从基因水平上探究猪链球菌菌株血清不可分型的原因及cps基因簇序列变异规律。方法 根据GenBank登记号下载并提取41株猪链球菌血清未分型菌株的cps基因簇序列,根据wzy序列确定菌株的cps型别,并与相应血清型标准菌株的cps基因簇进行序列比对研究。结果 41株血清未分型猪链球菌中,共有37株菌的cps型别属于已知血清型。其中18株与其对应的血清型标准菌株的cps基因簇相比出现部分cps基因的插入、缺失、倒转、替换和移码突变等变异;另有19株与其对应的血清型标准菌株的cps基因簇序列相同或相似,除携带血清24型cps基因簇的菌株LSS23、LSS31、LSS37与血清24型标准菌株88-5299A的cps基因簇同源性为96%外,其余16株与其各自的标准菌株的cps基因簇同源性均超过99%。此外,有4株血清未分型菌株属于已知的新cps型别。结论 由于猪链球菌cps基因簇序列变异频繁,导致荚膜多糖抗原型别呈多样化趋势,传统的血清凝集方法无法有效应对,亟需引入更灵敏的分子血清分型技术开展监测。     

我国607株不同宿主来源弯曲菌耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3分布分析

目的 了解不同宿主来源弯曲菌对氨基糖苷类抗生素的耐药现状,确定耐药菌株中氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3的分布,并初步了解耐药菌株的菌型特征。方法 利用琼脂稀释法分析不同宿主来源菌株针对链霉素最小抑菌浓度(MIC),对耐药的221株菌通过聚合酶链反应筛查氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3的分布情况。选取不同来源共100株耐药菌株进行多位点序列分型分析并进行聚类分析,获得耐药菌株的菌型特征及遗传相关性。结果 607株弯曲菌中共筛查到221株(36.41%)链霉素耐药株(MIC4 g/ml),其中腹泻患者来源菌株耐药率33.33%(78/234)、鸡来源菌株耐药率35.14%(123/350)、猪来源菌株耐药率86.96%(20/23)。空肠弯曲菌耐药率14.37%(51/355),结肠弯曲菌耐药率67.46%(170/252)。24株(10.86%)链霉素耐药弯曲菌中筛查到aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇,分别来自腹泻患者14株、鸡4株、猪6株。100株耐药菌株共分为58种ST序列型。结论 结肠弯曲菌链霉素耐药率明显高于空肠弯曲菌,猪源弯曲菌耐药率显著高于人源和鸡源,空肠弯曲菌与结肠弯曲菌中均筛查到aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇。     

福氏志贺菌gtrI基因突变导致的血清型回复转换

目的 研究携带O抗修饰基因gtrI的福氏志贺菌Y血清型菌株特征。方法 采用血清型多重聚合酶链反应(PCR)分型方法检测携带gtrI基因但I型抗原表位阴性的福氏志贺菌Y血清型菌株,并对其gtrI基因簇进行序列分析,对其基因组进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。结果 5株福氏志贺菌基因组携带gtrI基因簇,但是I型抗血清凝集阴性,表现为Y血清型特征;测序发现这5株菌株中的gtrI基因均发生了功能失活性突变;PFGE分析显示这5株菌株与福氏志贺菌血清型1a菌株具有相同或相近的PFGE带谱。结论 携带O抗修饰基因gtrI的福氏志贺菌Y血清型菌株来源于血清型1a。     

深圳地区不同来源空肠弯曲菌毒力基因分布及分子分型研究

目的 了解深圳地区市售禽类食品和腹泻病人中分离的空肠弯曲菌毒力基因分布及其分子分型情况。方法 根据特异性引物,运用聚合酶链式反应(PCR)检测空肠弯曲菌4种毒力基因(cdtB,cadF,flaA,virB11),应用脉冲场凝胶电泳分型技术(PFGE)对空肠弯曲菌分离株进行分子分型。结果 3种毒力基因在禽类食品分离株(5株)和腹泻病人分离株(5株)的分布情况一致,均携带cdtB和cadF,但均未检出virB11,两种来源菌株flaA的检出情况分别为3/5和2/5; PFGE聚类分析图谱显示,10株空肠弯曲菌经Sam I 酶切后可分别产生5～9条DNA条带的PFGE带型,其中食品株与病人株之间部分存在高度同源,同源性达到85%以上,但高度同源的菌株之间携带flaA毒力基因的分布不同。结论 深圳地区空肠弯曲菌存在cadF,cdtB,flaA等3种毒力基因,不同来源菌株之间同时具备多样性和同源性,提示空肠弯曲菌腹泻病人的感染来源可能与受污染的禽类食品密切相关,为该地区食源性空肠弯曲菌腹泻病提供基础性资料和依据。     

PFGE、RAPD、Diversilab及MLST四种分型技术在不动杆菌同源性分析中的应用比较

目的比较几种分型技术在不动杆菌属同源性分析中的应用效果。方法用亚胺培南和美罗培南体外筛选不动杆菌属碳青霉烯类耐药突变菌株,用核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)进行分子水平鉴定,用PFGE、RAPD、Diversilab及MLST四种分型技术分析亲代敏感菌株和耐药突变菌株的同源性。结果碳青霉烯类亲代敏感株和耐药突变菌株ARDRA结果一致,包含了基因组3型不动杆菌、2型鲍曼不动杆菌及13TU型不动杆菌。采用PFGE、RAPD、Diversilab、MLST 4种方法对菌株进行分型后,发现每个株菌的体外选择耐药突变株和亲代敏感菌株的同源性密切相关;RAPD和Diversilab的分辨力比PFGE差,亲缘关系相近的菌株不能被区分,pu53亲代敏感菌株及其耐药突变菌株与pu61亲代敏感菌株及其耐药突变菌株,PFGE显示2株菌间相差7个条带以上,无亲缘关系;RAPD和Diversilab DNA密切相关;MLST显示,与其他分型方法相比,表现为遗传背景一致的菌株具有相同的ST型,尽管基因组3型不动杆菌gpi PCR和gdhB测序或扩增失败。rpoD非简并引物对基因组13TU型不动杆菌和基因组3型不动杆菌扩增效果不好。结论RAPD和Diversilab适用于实验室快速同源性分析,两者区分不好的再选用PFGE和MLST。     

深圳市南山区腹泻患者弯曲菌感染及病原学特征分析

目的获得本地区秋季腹泻患者弯曲菌的感染现状及病原学特征。方法收集深圳市南山区2018年9 — 11月腹泻患者的粪便标本,采用双孔滤膜法分离培养弯曲菌并应用荧光聚合酶链式反应（PCR）方法进行菌种鉴定。 应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）对分离菌株进行分子分型,应用琼脂稀释法获得菌株对11种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。 根据菌株的序列分型（ST）结果,结合既往菌株分型数据进行本地区菌株的遗传聚类分析。结果共采集腹泻患者粪便标本150份,其中男性患者74例,女性患者76例,年龄在1～86岁之间。 150份粪便标本中共分离到弯曲菌18株,检出率为12.00%（18/150）。 菌种鉴定发现,空肠弯曲菌占77.78%（14/18）,结肠弯曲菌占22.22%（4/18）。 14株空肠弯曲菌可分为11种PFGE带型,8个ST型别,以ST9763最多（35.71%,5/14）,是本研究新发现ST型别。 14株空肠弯曲菌对四环素全部耐药,对红霉素、阿奇霉素、泰利霉素、庆大霉素、链霉素及克林霉素100.00%敏感。 ST型别最小生成树聚类分析结果表明,不同宿主来源菌株没有显著聚集性,腹泻患者分离菌株分布在不同来源的组群中。结论采用双孔滤膜法提高了腹泻患者中弯曲菌的检出率。本地区弯曲菌的感染仍以空肠弯曲菌为主, 分离菌株对四环素类、喹诺酮类抗生素呈现较高的耐药特征,分离的空肠弯曲菌ST呈弥散分布特点。     

空肠弯曲菌 TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量 PCR快速检测

目的　开发一种特异、灵敏的TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 方法,用于空肠弯曲菌的快速定量检 测。方法　针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白A 和马尿酸酶基因设计特异性引物和探针,建立一种新型TaqMan-MGB 双重探针 实时荧光定量PCR 检测空肠弯曲菌方法,对该方法的定量检测线性范围、特异度、灵敏度、重复性、稳定性进行评价, 应用该方法对临床标本中的空肠弯曲菌进行检测,同时用细菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。结果　建立的 空肠弯曲菌TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 检测方法专属性强,能准确检出空肠弯曲菌,而与其他细菌无交 叉反应,特异度为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测空肠弯曲菌DNA 线性范围达10 个数量级,最低检测限为 4 个菌落形成单位。重复性和稳定性良好,组内和组间相对标准偏差均小于1%。应用该方法成功从78 例临床标本中定 量检出28 例空肠弯曲菌阳性标本,用普通PCR 和基因克隆测序分析确认,细菌培养方法仅获得6 株存活的空肠弯曲菌。 结论　TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 具有快速简便、可靠稳定、特异灵敏的优点,可用于临床标本中空肠 弯曲菌定量检测,值得推广应用。     

2016－2018年北京市顺义区成年人腹泻患者弯曲菌感染监测及病原学特征分析

目的综合分析北京市顺义区3年期间基于过滤法从成年人腹泻患者分离的弯曲菌菌株的分型特征、耐药特点及分布特征,为我国弯曲菌感染的防控及风险评估提供基础数据。方法连续3年（2016 — 2018年）收集腹泻监测项目中的腹泻患者粪便标本,应用增强过滤法分离弯曲菌并进行菌种鉴定。 应用多位点序列分型（MLST）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）2种方法进行细菌分子分型。 采用琼脂稀释法进行分离菌株的抗生素敏感性分析。结果2016 — 2018年,腹泻病例中弯曲菌的检出率分别为5.65%（17/301）、10.51%（39/371）和7.75%（29/374）。 共分离弯曲菌87株,空肠弯曲菌占87.36%（76/87）,结肠弯曲菌占12.64%（11/87）。 76株空肠弯曲菌被分为55种序列分型（ST）,11株结肠弯曲菌被分为9种ST型别。 病例发病时间聚集且分离的弯曲菌为相同ST型别的情况出现了6次,通过PFGE分析,5次聚集病例分离的菌株均呈现单一PFGE带型。 76株空肠弯曲菌的多重耐药率为55.26%（42/76）,11株结肠弯曲菌的多重耐药率为90.91%（10/11）。结论弯曲菌是北京市顺义区成年人腹泻患者的重要病原菌,过滤法可作为弯曲菌分离培养的有效技术方法。 从顺义区腹泻患者分离的结肠弯曲菌多重耐药严重,应引起公共卫生、临床等多部门的关注。     

新型肠球菌万古霉素耐药基因簇——vanM基因簇

目的从屎肠球菌临床分离株中克隆一种介导屎肠球菌对万古霉素耐药的新基因簇。方法采用16SrRNA测序对临床株Efm-HS0661进行菌种确认,并行多位点序列分型（MLST）;通过药敏试验及接合试验,了解菌株耐药性及其可转移性;通过PCR扩增、步移法测序、限制性内切酶片段克隆获取万古霉素耐药基因及其周边序列,并将获得序列与已知万古霉素耐药基因簇进行比对。结果临床株经16SrRNA测序确认为屎肠球菌,MLST分型属ST78型;该菌株对万古霉素及替考拉宁耐药,且可通过接合试验发生转移;测序获得一6592bp核苷酸序列,为含6个万古霉素耐药相关基因的基因簇,其基因结构与已知耐药基因簇不同,命名为vanM型基因簇。其中vanM全长1032bp,其编码蛋白VanM与VanA、VanB、VanD、VanF基因氨基酸序列同源性分别为79．7％、69．7％、66．0％和78．5％。结论从万古霉素耐药屎肠球菌临床株中发现了一种新型万古霉素耐药基因簇——vanM型基因簇。     

The crucial role of Campylobacter jejuni genes in anti-ganglioside antibody induction in Guillain-Barre syndrome

Molecular mimicry of Campylobacter jejuni lipo-oligosaccharides (LOS) with gangliosides in nervous tissue is considered to induce cross-reactive antibodies that lead to Guillain-Barre syndrome (GBS), an acute polyneuropathy. To determine whether specific bacterial genes are crucial for the biosynthesis of ganglioside-like structures and the induction of anti-ganglioside antibodies, we characterized the C. jejuni LOS biosynthesis gene locus in GBS-associated and control strains. We demonstrated that specific types of the LOS biosynthesis gene locus are associated with GBS and with the expression of ganglioside-mimicking structures. Campylobacter knockout mutants of 2 potential GBS marker genes, both involved in LOS sialylation, expressed truncated LOS structures without sialic acid, showed reduced reactivity with GBS patient serum, and failed to induce an anti-ganglioside antibody response in mice. We demonstrate, for the first time, to our knowledge, that specific bacterial genes are crucial for the induction of anti-ganglioside antibodies.     

内蒙古自治区牙克石市全沟硬蜱携带立克次体的研究

目的 了解内蒙古自治区(内蒙古)大兴安岭地区蜱携带的斑点热群立克次体和无形体属细菌的流行情况与种类.方法 在阿龙山林区采集蜱并根据形态学特征进行鉴定,运用PCR方法扩增17 kDa与16S rRNA基因分别对2010年捕获蜱中的两类病原体进行检测,同时扩增阳性样本中立克次体的全长16S rRNA和gltA基因,将扩增产...     

Development of a PCR ELISA assay for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli.

A polymerase chain reaction (PCR) assay was developed based on a solution-hybridization colorimetric end-point detection format (PCR ELISA) for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. PCR primers were designed to target a gene sequence with species-specific motifs. Five biotin-labelled probes targeted to the species-specific motifs were investigated for the detection of digoxygenin-labelled PCR products from C. jejuni and C. coli using the PCR ELISA format. Two probes were identified, one which reacts with both the C. jejuni and C. coli target sequences (probe CC2) and one probe which reacts with the C. jejuni target sequence only (probe CJ2). The specificity of the assay with the CJ2 and CC2 probes was investigated with a range of Campylobacter spp., Arcobacter spp., Helicobacter spp. and a range of unrelated organisms. The PCR ELISA assay and probes were demonstrated to be specific for C. jejuni and C. coli. The sensitivity of the PCR ELISA assay was demonstrated to be 10-100-fold more sensitive than a gel-based PCR method using the same primers. This PCR ELISA assay is sensitive, specific and significantly reduces the time needed for the identification of C. jejuni and C. coli and has the potential to facilitate early detection of these important gastro-intestinal pathogens.     

HBsAg ELISA-/NAT+的HBV血清学模式和病毒变异分析

目的结合乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的检测结果,分析血清标本血清学模拟及DNA序列,了解HBV DNA以及HBsAg血型模式之间的关系。方法选自该院54例血液标本作为本研究对象;对标本行HBV DNA提取、PCR扩增处理、PCR产物纯化、DNA测序、HBV基因分型和序列分析,并运用生物信息学软件对测序结果进行分析处理,对比分析基因突变情况。结果 PCR扩增结果,54例标本中40例表现为非常显著的PCR扩增不佳,14例标本PCR产物电泳均能够观察到1 400bp特异性条带;22例为HBsAg ELISA阳性,14例为隐匿性HBV阳性,PCR扩增阳性行基因型检测,B型基因在HBsAg ELISA中占81.82%,C型基因在隐匿性HBV阳性中比例为78.57%,差异具有统计学意义(P0.05);14株隐匿性HBV基因中,6例在S区区域内发生基因序列点突变,其中2例在1个碱基点出现突变,另3例在2个位点的碱基点出现突变;3例HBV基因C型感染者出现基因点突变,2例B基因型感染者出现基因点突变;5例标本在9个位点部位的"a"决定族内碱基点出现突变,A-C的突变较多。结论血液筛查中,检测显示为HBsAg的阴性合格血液,仍可能有隐匿性乙肝感染和窗口期漏检,其病毒株主要为C型,且有变异株,B型病毒株相对较少,但突变株相对较高,可能逃避现有筛查试剂。     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法。方法根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqM an探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究。结果该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10 cfu/mL。反应体系具有很高的稳定性。结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值。     

空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究

目的建立同时检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌)和大肠杆菌O157的多重聚合酶链反应(PCR)检测技术。方法根椐空肠弯曲菌mapA基因序列、单增李斯特菌的编码溶血素(hly)基因序列和大肠杆菌的O157抗原(rfbE)基因序列,分别设计了3对特异引物,PCR扩增的目的基因片段为589 bp、360 bp和194bp;并对反应条件进行了优化。结果对3种致病菌检测,多重PCR检测DNA的敏感度分别为空肠弯曲菌2.264 ng、单增李斯特菌37.92 ng、大肠杆菌2.100 ng,样品检测时间6~8 h。结论该方法操作简便,检测周期短,特异性和敏感度高,为同时检测污染样品中空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157奠定了基础。     

Spontaneous mutation frequency and emergence of ciprofloxacin resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli

OBJECTIVES: We analysed the contribution of spontaneous mutation frequency to the evolution of ciprofloxacin resistance and the diversity of mutations in the quinolone resistance-determining region (QRDR) of gyrA and in the intergenic region, cmeR-cmeA, of the CmeABC efflux pump in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. METHODS: The mutation frequency was measured in 11 quinolone-susceptible C. jejuni and 5 C. coli strains, with and without ox bile. MICs and target-specific and efflux-associated mutations were studied for a number of colonies of each strain selected from plates containing 1 mg/L ciprofloxacin. RESULTS: The spontaneous mutation frequency level among susceptible C. jejuni and C. coli strains ranged from hypomutable (approximately 4 x 10(-9)) to strongly mutable (approximately 7 x 10(-3)). Ox bile had no effect on mutation frequency. Pre-existing ampicillin and tetracycline resistance increased the MICs of ciprofloxacin for two strains from 0.032-0.125 to 0.5 mg/L. MICs of ciprofloxacin for the colonies selected from plates containing 1 mg/L ciprofloxacin varied from 1 to 16 mg/L, with the Thr-86-->Ile or Asp-90-->Asn mutation detected in the QRDR of gyrA. In 21.5% (14/65) of the selected colonies, no specific mutations existed. Two types of mutations in CmeR promoter-binding inverted sequences were identified both in the parent strains and in the colonies selected from ciprofloxacin plates. CONCLUSIONS: The variation in mutation frequencies between most C. jejuni and C. coli strains was up to 700-fold. Mutation in the QRDR of gyrA or in the intergenic region was not associated with differences in spontaneous mutation frequencies. Previously acquired resistance to tetracycline and ampicillin predisposed strains to high-level ciprofloxacin resistance and to multiple antibiotic resistance.     

2017年北京地区水痘病原学监测结果分析

目的了解北京地区水痘–带状疱疹病毒（VZV）毒株类型及优势流行亚型，为水痘暴发疫情的防治提供依据。方法收集2017年北京地区水痘暴发疫情病例的疱疹液标本。 采用实时荧光PCR方法，进行VZV及野毒株和疫苗株鉴定，根据VZV第22个开放阅读框基因片段序列，确定北京地区VZV进化关系。结果2017年共收集到水痘病例标本316份，VZV病毒核酸阳性271份，阳性率为85.76%，均为野毒株。 共获得240份VZV基因片段，其中234株毒株是clade2型，占97.50%，3株clade1型和3株clade4型，分别占1.25%。 其中clade2型分布在北京地区16个区（县），clade1型和clade4型分别分布在西城区和大兴区。结论2017年北京地区水痘病例主要由clade2型VZV引起，同时对新出现的clade1型和clade4型要加强监测。