前列腺特异性膜抗原(PSMA)纳米抗体基因的原核表达及天然噬菌体纳米抗体库筛选

目的 筛选出抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的纳米抗体。方法 利用天然噬菌体纳米抗体库,以PSMA为靶抗原进行三轮的淘选,采用ELISA鉴定阳性克隆,并进行测序分析,将筛选到的阳性克隆基因序列插入pET28a原核表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,利用Ni柱进行亲和纯化,通过SDS-PAGE验证纯化产物。结果 筛选获得4条PSMA纳米抗体序列重链可变区1(VHH1)、 VHH2、 VHH3、 VHH4, VHH1序列未能获得明确的原核表达蛋白,VHH2、 VHH3、 VHH4蛋白均表达。纯化后获得了纯度高、相对分子质量(M_r)约为17 000的抗PSMA纳米抗体。结论 通过天然噬菌体纳米抗体库淘筛,成功获得抗PSMA的纳米抗体序列并进行了原核表达和纯化。     

抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定

目的:获得具有中和活性、高特异性和稳定性的抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的羊驼重链单域(VHH)抗体。方法:利用pET-22b表达载体诱导表达抗H5N1禽流感病毒HA VHH抗体蛋白,以包涵体形式表达的VHH抗体蛋白采用最优复性方法进行复性后,获得高纯度的VHH抗体,分别采用ELISA法鉴定VHH抗体的亲和力和热稳定性,采用血凝抑制实验鉴定抗体的特异性和体外中和活性。结果:经复性的抗H5N1禽流感HA VHH抗体对H5N1禽流感病毒HA具有良好的特异性。通过对三种不同复性方法比较,利用柱上复性的VHH23抗体具有较好的热稳定性,亲和力为9.1×10-7mol/L,同时对H5N1禽流感病毒HA具有良好的体外中和活性。结论:实验结果表明通过原核表达获得具有较好中和活性、特异性及稳定性的抗H5N1禽流感病毒VHH抗体,为进一步开展抗体的体内病毒中和试验奠定良好基础。     

人高迁移率族B1蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用

目的:原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体.方法:构建原核表达质粒pRsetA2-HMGB1, 转化大肠杆菌BL21(DE3), HMGB1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过Ni2 -NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清.以间接ELISA法检测抗体效价, Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性.结果:成功构建原核表达质粒, 表达并纯化HMGB1蛋白.ELISA检测抗体效价为1∶ 16 000以上, Western blot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性.结论:HMGB1蛋白和抗体的成功制备, 为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础.     

抗羊口疮病毒囊膜蛋白B2L小鼠多克隆抗体的制备和应用

目的获取羊口疮病毒(ORFV)囊膜蛋白B2L并制备鼠抗B2L蛋白多克隆抗体。方法采用PCR扩增获得B2L基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a和真核表达载体p3×FLAG-CMV-14。两个重组表达载体均经过鉴定,重组原核表达载体使用BL21大肠杆菌表达,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白。通过Tris-尿素溶液洗去非目的蛋白,Western blot法鉴定。将定量的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗ORFV B2L多克隆抗体。将真核表达重组质粒p3×FLAG-B2L转染Vero细胞、BHK-21细胞,使用间接免疫荧光法(IFA)对抗B2L蛋白的多克隆抗体鉴定,并应用于免疫组织化学染色检测患病羊唇部组织ORFV的表达。结果 Western blot法确定了制备的B2L蛋白的特异性; IFA结果表明制备的小鼠抗B2L多克隆抗体有特异性和反应原性,免疫组织化学染色法结果表明该抗体可以检测出患病羊唇部组织的ORFV。结论成功制备了特异性的小鼠抗B2L多克隆抗体。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

登革病毒2型非结构蛋白NS2B的原核表达、纯化及其抗体的制备

目的 原核表达登革病毒(Dengue Virus,DV)NS2B蛋白并纯化,制备NS2B的小鼠多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增DV2全长的NS2B基因序列,构建表达带有6×His标签的NS2B的原核表达载体,进行表达与纯化,免疫Balb/c小鼠,制备NS2B多克隆抗体.采用ELISA检测抗体效价,Westem-blot及免疫荧光染色检测其特异性.结果 成功构建原核表达载体pQE-31/NS2B,进一步获得相对分子质量为16 000的纯化蛋白及多克隆抗体,EHSA显示抗体效价达1:25 600.Western-blot和免疫荧光染色显示多克隆抗体与NS2B蛋白特异性结合.结论 本研究获得了纯化的DV2 NS2B蛋白,成功地制备了NS2B多克隆抗体,为进一步研究NS2B的作用机制奠定了基础.     

抗卵泡刺激素受体纳米抗体的制备及鉴定

目的 获得抗卵泡刺激素受体(FSHR)的纳米抗体.方法 使用原核表达的重组蛋白His-FSHR234对新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库进行亲和筛选,将筛选获得的重链抗体的可变区(vhh)基因亚克隆至pET30a表达载体,转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达VHH重组蛋白,镍离子亲和层析柱纯化获得纳米抗体.ELISA检测纳米抗体的抗原结合活性.结果 His-FSHR234筛选富集后,随机挑选40个克隆进行鉴定,其中28个为阳性克隆,挑选4个vhh基因进行克隆,PCR和酶切鉴定目的基因大小与预计相符.SDS-PAGE显示,VHHFSHR-06、VHHFSHR-25、VHHFSHR-30、VHHFSHR-50分别在相对分子质量(Mr)31000、26000、25000、26000有目的条带.EHSA检测显示,4个纳米抗体对His-FSHR234重组蛋白均具有结合活性,其中VHHFSHR-06的抗原结合活性最高.结论 从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中筛选获得了1个具有较高抗原结合活性的抗FSHR的纳米抗体.     

羊驼抗H5N1血凝素重链可变区-人IgGFc段嵌合抗体的制备和鉴定

本研究旨在制备羊驼抗H5N1禽流感病毒的重链抗体可变区-人Fc段嵌合体抗体制备,对所得嵌合抗体进行制备和功能鉴定,为临床应用奠定基础。用pET-22b表达载体构建抗H5N1禽流感病毒羊驼重链可变区(VHH)-人IgG1Fc嵌合基因,以包涵体形式表达VHH23-hFc嵌合抗体蛋白,采用优化的方法复性后,获得高纯度VHH23-hFc嵌合抗体,用ELISA法鉴定嵌合抗体亲和力、热稳定性和小鼠体内的半衰期。结果显示,透析复性后原核表达的抗H5N1禽流感病毒VHH23-hFc嵌合抗体亲和力为2.24×106 mol/L,具有较好免疫学活性,热稳定性也较好,小鼠体内半衰期达到35h,为下一步开展该抗体的体内外病毒中和试验奠定良好基础。     

果蝇jumeaux蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的原核表达及纯化重组果蝇jumeaux(jumu)蛋白,制备大鼠抗果蝇jumu多克隆抗体。方法用RT-PCR方法扩增jumu基因,并将其克隆到原核表达载体pRSETA中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导His-jumu融合蛋白的表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot方法鉴定基因片段的正确性及蛋白表达的特异性后,用Ni-NTA亲和层析柱纯化带有6×His标签的融合蛋白,用纯化后的蛋白免疫SD大鼠制备多克隆抗体。以Western blot、免疫荧光染色法鉴定抗体的特异性,并用制备的抗体检测jumu在果蝇不同器官中的表达情况。结果成功构建了pRSETA-jumu原核表达质粒,jumu融合蛋白在大肠杆菌内高表达并纯化,免疫SD大鼠得到抗jumu多克隆抗体。用Western blot和免疫荧光染色检测发现制备的抗体有较强的特异性,并能检测内源性蛋白。通过免疫荧光染色发现jumu的表达存在组织特异性,且在唾液腺中的表达量最高。结论成功获得了抗jumu蛋白的特异性抗体,为进一步研究jumu蛋白的功能和作用机制奠定了基础。     

基于纳米抗体的猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法的建立和性能评估

目的：通过噬菌体展示技术制备抗人IgE纳米抗体,将其用于磁微粒化学发光平台建立一种猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法。方法：在WHO/IUIS过敏原数据库中检索猫致敏蛋白信息,合成序列后在原核表达系统中表达和纯化猫皮屑致敏蛋白Fel d 1。使用人源IgE免疫新疆单峰驼提取淋巴细胞中的RNA建立噬菌体展示纳米抗体库,分析库容、多样性和插入率,通过筛选和鉴定获得抗人IgE纳米抗体。使用重组过敏原偶联磁微粒和吖啶酯标记纳米抗体,建立磁微粒化学法猫皮屑特异性IgE抗体检测方法。结果：噬菌体展示库的库容为1.88×108 cfu/ml,插入率为93.6%,纳米抗体纯度>95%。检测方法的线性范围为0.1～100 U/ml,与ImmunoCAP检测系统临床对比有较好的一致性。结论：成功建立了基于纳米抗体的猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法,为猫过敏性疾病辅助诊断提供了技术基础。     

翻译控制肿瘤蛋白TPT1的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

目的:原核表达并纯化翻译控制蛋白TPT1,免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRSE-TA2-TPT1,转化大肠杆菌BL21(DE3),TPT1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果:在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的TPT1融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫大白兔,获得了高特异性的抗TPT1抗血清。结论:成功构建原核表达质粒pRSETA2-TPT1,表达并纯化TPT1蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体.为进一步研究TPT1在肿瘤等疾病发生、发展过程及治疗中的作用奠定基础。     

抗人PD-L1 单克隆抗体的制备及其应用

目的:获得能应用于临床诊断以及阻断PD-L1 与PD-1 结合的抗人PD-L1 单克隆抗体。方法:采用重组表达的人PD-L1 蛋白免疫BALB/ c 小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术获得稳定分泌抗人PD-L1 单抗的阳性细胞株,ELISA 方法鉴定抗体的特异性、亲和力、亚型等方面特性;免疫印迹、间接免疫荧光方法对肿瘤细胞进行检测;肿瘤杀伤实验验证抗体阻断活性。结果:共获得2 株抗人PD-L1 单抗,抗体效价分别为1 2.56 106 和1 3 105 ,亲和力分别为1.5 109 L/ mol 和2.5 108 L/ mol,均与PD-L2 蛋白无交叉反应。免疫印迹、间接免疫荧光证实抗体有诊断作用。杀伤实验显示抗体有阻断作用。结论:共获得两株稳定分泌高效价、高特异性的抗人PD-L1 单抗的杂交瘤细胞株,能作为诊断抗体应用于肿瘤表型检测和预后有效性的评估。抗体的阻断功能可应用于联合CIK 细胞免疫治疗。     

骆驼重组SpaA-N单域抗体的制备与性质研究

目的:获得特异识别SpaA-N的单域抗体。方法:用His-SpaA-N重组抗原从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中,筛选SpaA-N的结合子。经测序后亚克隆至pET30a并在E.coli BL21高表达,用镍离子亲和层析柱纯化。ELISA分析重组单域抗体的热稳定性,Western blot检测结合特异性。结果:经His-SpaA-N筛选富集后,筛选得到2个目的克隆。构建至pET30a,PCR和酶切鉴定目的基因大小与预计相符。SDS-PAGE显示,Mr 29 000和23 000有特异性目的条带。ELISA检测显示,抗SpaA-N的VHH对SpaA-N重组蛋白具有很好的结合活性;VHH热变性后,经室温复性均可以恢复其抗原结合活性。Western blot显示,重组VHH在Mr 66 000处可以识别丹毒丝菌中存在的表面蛋白。结论:获得了具有热稳定性和特异结合SpaA-N的单域抗体,为进一步研究spaA抗原在丹毒丝菌感染免疫中的作用提供了基础。     

志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。     

人ERβ AF1融合蛋白的表达及其多克隆抗体制备

目的: 制备雌激素受体β多克隆抗体.方法: 从人乳腺cDNA文库中PCR扩增ERβ AF1结构域(1～144位氨基酸), DNA 重组插入原核表达质粒pGEX-KG, 转化大肠杆菌DH5α, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-ERβ AF1融合蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠, 制备鼠多抗血清.通过Western blot和免疫组织化学实验鉴定血清特异性和效价.结果: 成功构建了pGEX-KG/ERβ AF1原核表达载体, 转化DH5α后可高效表达融合蛋白GST-ERβ AF1, 免疫产生的ERβ多抗可特异检测ERβ真核表达载体转染人293T细胞及乳腺癌细胞中ERβ的表达.结论: 制备的ER 抗体对ERβ有反应原性, 效价高, 特异性好, 为进一步研究ERβ的生物学功能奠定基础.     

着丝粒相关蛋白E的抗体制备

目的 制备着丝粒相关蛋白E(CENP-E)的兔源特异性多克隆抗体.方法 应用分子克隆技术构建原核细胞表达质粒pHis-CENPEC410,并将其转化至表达菌株BL-21 (DE3)感受态细胞中;然后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-CENPEC410融合蛋白,再用Ni-NTA镍离子金属螯合树脂柱亲和层析法进行纯化;最后将纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备特异性CENP-E多克隆抗体,分别用免疫印迹法和免疫共沉淀法对免疫抗体血清进行检测,用免疫荧光染色法检测纯化的抗体.结果 制备的抗体血清可较好地应用于免疫印迹和免疫共沉淀实验,纯化的抗体可用于免疫荧光染色.结论 获得了具有较高特异性和灵敏度的CENP-E多克隆抗体,为后续CENP-E蛋白的研究奠定了基础.     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定

目的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚单位的重组、表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定。方法将ASGPRH1亚单位糖识别区基因(CRDH1)定向克隆至原核表达载体pET-32c经IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术(WB)检测;用纯化的CRDH1对人源噬菌体抗体库进行4轮固相筛选,阳性克隆用表达标记(Trx-His-stag)进行差异筛选。取阳性噬菌体C3感染宿主菌HB2151,37℃振荡培养过夜,终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE与Westernblot鉴定以及免疫组化鉴定纯化的单链抗体C3与肝细胞结合的特性。结果CRDH1/pET-32c在原核系统经诱导表达出相对分子质量(Mr)约35×103大小的融合蛋白,以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白;经4轮筛选和差异筛选后,有2株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的单链抗体,DNA序列分析表明单链抗体重链基因和轻链基因分别属于人免疫球蛋白VH3家族和VKI家族。噬菌体C3经诱导表达出Mr约28×103大小的融合蛋白,可溶性分泌表达于培养基中;通过Ni2+亲和柱纯化获得单链抗体,ELISA、Westernblot表明单链抗体C3能较好结合rCRDH1,免疫组化显示该单链抗体可与肝癌细胞、肝细胞特异结合。结论成功表达ASGPR并筛选出其人源单链抗体。该单链抗体可与表达的rCRDH1以及肝细胞和肝癌细胞特异性结合,提示对肝脏疾病的靶向治疗有潜在的应用价值。     

日本血吸虫TGF-β受体Ⅰ基因胞外段的克隆与表达

目的获得日本血吸虫TGF-β受体I胞外段（SjTβRIout）的序列,行原核克隆和表达,并分析其蛋白的免疫学功能。方法应用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法获得SjTβRI基因cDNA部分序列,用RT-PCR方法扩增SjTβRI胞外段（SjTβRIout）基因,构建pET28a（＋）重组原核表达载体,并测序鉴定。将质粒转入大肠埃希菌,IPTG诱导表达,并使用Ni离子亲和层析并透析处理获得纯化重组蛋白。使用纯化蛋白与弗氏佐剂共同免疫SD大鼠获得抗血清,使用ELISA方法检测血清中SjTβRIout特异抗体IgG含量。结果成功构建SjTβRIout原核表达载体。测序鉴定显示SjTβRIout包含399bp,编码133个氨基酸,并且与曼氏血吸虫TGF-β受体I的同源性较高。重组蛋白经SDS-PAGE分析,显示其相对分子质量约为20000,与目的基因编码蛋白的预测分子量相符。经重组蛋白免疫的SD大鼠产生高效价（〉1：100000000）的抗原特异性IgG抗体。结论首次获得pET28a（＋）-SjTβRIout的重组蛋白,并且证明其具有良好的免疫原性。     

抗人载脂蛋白6 单链抗体的筛选、制备及活性鉴定

目的:筛选特异性抗人载脂蛋白6单链抗体(anti-hLCN6 scFv),并进行表达纯化和活性鉴定。方法:采用RT-PCR技术,用抗体可变区简并引物,从hLCN6免疫小鼠的淋巴细胞中扩增全套V_H和V_L基因,装配成scFv基因后将其克隆到噬菌体载体pFAB5C中,构建scFv噬菌体抗体库。对抗体库进行4轮富集,筛选抗hLCN6阳性scFv。经原核表达纯化后,用Western blot和间接ELISA对其活性进行鉴定。结果:筛选到2株亲和力较高的阳性克隆,测序表明其序列一致。获得了高纯度的scFv抗体,其对抗原具有良好的亲和力和特异性。结论:成功筛选到特异性抗hLCN6 scFv,为利用该抗体进行混合斑中的精子分离奠定了基础。     

Mucin 16蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备与鉴定

目的:在原核生物中表达带有His标签的mucin 16N端重组蛋白(简称为His-mucin 16N),制备抗mucin 16的单克隆抗体(mAb)。方法:将mucin 16基因片段插入原核表达载体pET-32,在大肠杆菌中表达重组蛋白,用亲和纯化方法纯化后免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合。筛选可稳定分泌抗mucin 16抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞株,用Westernblot、ELISA、免疫荧光和免疫组化等方法分析和鉴定抗mucin16的mAb。结果:表达并纯化了His-mucin 16N蛋白;筛选出几株可稳定分泌特异性抗人mucin 16 mAb的细胞株;挑选出效价高、特异性好的1株进行纯化。获得的抗mucin 16 mAb,可用于Western blot、ELISA、免疫组化、免疫荧光等检测,并鉴定该抗体亚型为IgG1。通过上述免疫学实验,分析了在不同肿瘤细胞中mucin 16的表达情况。结论:在原核生物中成功表达和纯化带His标签的mucin 16N重组蛋白,制备出具有高特异性的抗mucin16的mAb。