VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪与VITEK MS质谱仪在摩根摩根菌鉴定中的应用及评价

目的分析研究VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪与VITEK MS质谱仪在摩根摩根菌鉴定中的应用及对其鉴定结果的准确性做出评价,为临床精准治疗提供科学依据。方法收集2017年1月至2020年5月云南省第三人民医院送检的不同类型标本中分离出的50株摩根摩根菌;常规方法进行菌株培养;采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪,手工生化补充试验和VITEK MS质谱仪对菌株进行菌种鉴定,鉴定结果不一致的菌株采用16S rDNA测序验证。结果共分离出5株β溶血表型和45株非β溶血表型摩根摩根菌;VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪对非β溶血摩根摩根菌鉴定结果均符合,对β溶血摩根摩根菌鉴定结果均不符合,且均鉴定为奇异变形杆菌,鉴定符合率为90%;手工生化补充试验结果也符合奇异变形杆菌;VITEK MS质谱仪对非β溶血和β溶血摩根摩根菌的鉴定结果均符合,鉴定符合率为100%;16S rDNA测序对鉴定结果不一致的5株β溶血菌的测序结果均为摩根摩根菌。结论 VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪对非β溶血摩根摩根菌的鉴定结果准确可信;对β溶血摩根摩根菌鉴定结果均不准确,且鉴定为奇异变形杆菌的概率很高;VITEK MS质谱仪对摩根摩根菌的鉴定结果均准确快速且不受细菌β溶血与否影响。     

1株LpsB突变致多黏菌素B耐药鲍曼不动杆菌的全基因测序分析

目的 研究1株多黏菌素B高水平耐药的多重耐药鲍曼不动杆菌的全基因组测序的分子特点。方法 将1株分离自脑脓肿患者脑脊液标本的多黏菌素高水平耐药鲍曼不动杆菌Z198株作为目标研究菌，通过Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq PE150测序平台对其进行全基因组测序，再通过各数据库进行比对分析检测菌株的多位点序列分型(MLST)、抗菌药物耐药基因、毒力基因，同时采用Circos软件对样品基因组组装和注释结果进行可视化分析。Z198基因组上交NCBI数据库。结果 全基因组测序发现该菌株含有1个染色体、1个固有质粒，11个基因岛、4个前噬菌体。通过数据库比对，本菌为ST2型，共携带高达34种抗菌药物耐药基因，主要为LpsB、bla_OXA-23、bla_OXA-66、bla_ADC-73等，同时含有OmpA、磷脂酶C、包膜、溶血素、生物膜调控系统等19种主要毒力因子。结论 本研究检出1例LpsB四点突变导致多黏菌素B耐药的鲍曼不动杆菌。该菌株同时携带多重耐药基因及毒力因子。多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌外膜脂...     

临床分离的美罗培南和环丙沙星共同耐药的铜绿假单胞菌耐药机制的研究

目的探讨临床分离的对美罗培南和环丙沙星均耐药的铜绿假单胞菌的耐药机制。方法收集经VITEK-2 Compact微生物分析系统检测为美罗培南和环丙沙星耐药的铜绿假单胞菌30株,琼脂稀释法复查最小抑菌浓度(MIC)值。改良三维试验检测碳青霉烯酶,聚合酶链反应(PCR)扩增耐药基因,逆转录PCR分析细菌外排系统表达情况。结果琼脂稀释法与VITEK-2 Compact微生物分析系统检测结果相同。所有菌株均未产碳青霉烯酶,PCR扩增测序未发现基因改变,逆转录PCR检测外排系统发现以mexX和mexC基因表达增加为主,其调控基因扩增测序发现4株mexC过度表达的调控基因nfxB Gly→Val(GGC→GTC),6株mexX过度表达的调控基因mexZ Val→Gly(CTG→CAG)。结论外排系统调控基因突变而引起的外排系统MexXY-OprM和MexCD-OprJ过度表达是引起美罗培南和环丙沙星耐药的主要原因。     

一株同时携带SGI1和SXT/R391耐药基因岛的奇异变形杆菌

目的分析1株人源奇异变形杆菌CA151922的2个耐药相关基因岛SGI1和SXT/R391的基因结构和耐药基因。方法聚合酶链式反应（PCR）检测SGI1和SXT/R391基因岛特异性整合酶基因,采用二代测序方法测定CA151922基因组。 分别以SGI1和SXT/R391基因岛的参考序列,从基因组序列中提取基因岛片段并组装。 在线预测并注释开放读码框（ORFs）。 基因岛的同源序列通过在线工具BLASTn获得,采用cd-hit获得非冗余的同源基因,利用R语言构建同源基因的聚类进化关系树。 利用微量肉汤稀释法进行耐药表型检测。结果奇异变形杆菌CA151922同时含有SGI1（SGI1-B）和SXT/R391（ICEPmiJpn1）2个耐药相关基因岛。 SGI1-B和ICEPmiJpn1与已知序列相似性分别为97% ~ 99%和96% ~ 99%。 SGI1-B和ICEPmiJpn1携带的耐药基因种类有所差异,但两者携带不同的编码β-内酰胺酶的基因。CA151922为多耐药菌株,耐药达18种,与基因岛耐药基因有关的耐药表型为氨苄西林和磺胺类药物,提示菌株耐药表型不完全由该耐药岛内的耐药基因决定。结论首次在奇异变形杆菌中发现,同时携带SGI1和SXT/R391耐药相关基因岛, 增加了菌株耐药的复杂性和严重性,提示应加强对多耐药菌株耐药相关基因岛的监测。     

1株携带blaNDM-1的临床多重耐药豚鼠气单胞菌的基因组及表型鉴定

目的 分析从粪便筛查分离出的产NDM-1型碳青霉烯酶的豚鼠气单胞菌(XX182)的抗菌药物耐药表型和基因组特征，阐明该菌株的抗菌药物耐药机制及其耐药性转移的能力。方法 肉汤微量稀释法检测该菌株的抗菌药物敏感性，PCR检测碳青霉烯酶耐药基因亚型(bla_NDM、bla_VIM、bla_IMP、bla_KPC),接合试验检测耐药基因的可转移性，通过全基因组测序(WGS)和生物信息学分析明确该菌株的基因组特征。结果 该菌株对头孢菌素、碳青霉烯类、环丙沙星和多黏菌素耐药，对替加环素、阿米卡星和氨曲南敏感。该菌株携带多种抗菌药物耐药基因，主要包括bla_NDM-1、bla_MOX-6、bla_RSA-1、bla_TEM-1、aac(3)-Ⅱd、cmlA5、arr-2等。毒力因子分析发现其携带有极鞭毛、侧鞭毛、Ⅵ型分泌系统(T6SS)和溶血素A等毒力因子。结论 该豚鼠气单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药主要由产NDM-1型碳青霉烯酶导致，且bl...     

1株LpsB突变致多黏菌素B耐药鲍曼不动杆菌的全基因测序分析*

摘要:目的研究1 株多黏菌素B高水平耐药的多重耐药鲍曼不动杆菌的全基因组测序的分子特点。方法将1株分离自脑脓肿患者脑脊液标本的多黏茵素高水平耐药鲍曼不动杆菌Z198株作为目标研究菌，通过Nanopore PromethION和llumina No- vaSeq PE150测序平台对其进行全基因组测序,再通过各数据库进行比对分析检测菌株的多位点序列分型(MLST)、抗菌药物耐药基因、毒力基因,同时采用Circos软件对样品基因组组装和注释结果进行可视化分析。Z198基因组上交NCBI数据库。结果全基因组测序发现该菌株含有1 个染色体、1个固有质粒,11个基因岛、4个前噬菌体。通过数据库比对,本菌为ST2型,共携带高达34种抗菌药物耐药基因,主要为IpsB、blaoxA.23、blaox.6、blaxDc-.-3等,同时含有OmpA、磷脂酶C、包膜、溶血素、 生物膜调控系统等19 种主要毒力因子。结论本研究检出 1例LpsB四点突变导致多黏菌素B耐药的鲍曼不动杆菌。该菌株同时携带多重耐药基因及毒力因子。多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌外膜脂质修饰的耐药机制及分子流行病学需高度持续关注。     

2021年武汉市一起肠炎沙门菌引起的跨区食源性疾病暴发的病原学分析

  目的  对2021年武汉市一起跨区食源性疾病暴发事件进行病原菌的鉴定和溯源分析，查明事件暴发原因。  方法  采集此次食源性疾病暴发事件中相关人员的肛拭子样本、粪便样本和食品样本进行分离培养，用VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统鉴定分离到的菌株，并进行血清学分型，耐药性敏感试验；采用脉冲场凝胶电泳法（PFGE）对本次事件的检出菌及近两年本地区临床散发病例的同型别菌株进行分子分型和聚类分析；提取本次事件病原菌和本地区同型别菌株的核酸进行全基因组测序，通过基因注释和序列比对分析病原菌的毒力因子与耐药基因，结合多位点序列分型，变异位点检测和不同地区同型别菌株的全基因组序列构建基于单核苷酸多态性的系统发育树对病原菌进行溯源。   结果  共分离出5株肠炎沙门菌，其中2株来自食物样本，3株来自患者粪便和肛拭子样本。 5株检出菌的PFGE带型完全相同，均对抗生素阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、头孢唑啉、头孢西丁、头孢呋辛、甲氧苄啶–磺胺甲恶唑耐药，携带相同的耐药基因和毒力因子，均为ST11型。 本次事件检出菌株的序列间仅存在1个突变位点。 检出菌的全基因组序列与本地肠炎沙门菌序列高度相似。   结论  肠炎沙门菌为本次事件的致病菌。经同源性分析，此株病原菌为本地区肠炎沙门菌流行株。 全基因组测序技术可作为PFGE分子分型的补充应用于病原菌的监测和暴发事件调查。     

2016年山东省聊城市临床病例中2种罕见施万菌的鉴定

目的对2016年山东省聊城市临床患者分离株进行鉴定以及分析其生化特性和药物敏感性。方法对患者来源标本及6株菌株进行选择性培养基分离培养，并进行生化试验、溶血试验、耐盐耐热实验和药敏试验，使用API生化鉴定系统、VITEK 2 Compact、全自动快速微生物质谱检测系统进行鉴定，并进行16S rRNA和gyrB序列分析。结果8株菌在菌落形态和生化特性上差异无统计学意义，只有溶血状态有所不同，临床鉴定系统有局限性，只能分辨到海藻施万菌和腐败施万菌，进一步使用16S rRNA和gyrB序列检测方法，确认患者分离株属于2种罕见的施万菌，即鲍施万菌和优佩内施万菌。结论首次在中国大陆的临床病例中，鉴定了2株由罕见施万菌导致的感染病例。 由施万菌属引起的临床感染还需要进一步重视，并加强监测。     

gyrA、gyrB和外排系统共同介导铜绿假单胞菌对喹诺酮类耐药机制研究

目的探讨临床分离的对环丙沙星和左氧氟沙星均耐药的铜绿假单胞菌耐药机制。方法收集临床分离经VITEK-2（C0mpact细菌鉴定仪检测环丙沙星和左氧氟沙星均耐药的铜绿假单胞菌,琼脂稀释法测定环丙沙星和左氧氟沙星的MIC值,PCR扩增DNA促旋酶基因gyrA和gyrB以及DNA拓扑异构酶Ⅳ的parC和parE基因,实时-RT-PCR分析细菌外排系统表达情况。结果琼脂稀释法检测结果与VITEK-2 Compact细菌鉴定仪检测结果相符。PCR扩增测序发现以DNA促旋酶基因gyrA（在位点941处插入碱基C）和gyrB（3株在位点1588处缺失碱基A,其他菌株在位点1543处插入碱基T）基因缺失或者插入导致移码突变为主,parE基因有3株在位点1895处插入碱基C。实时定量PCR检测发现以mexA和mexC表达增加为主。结论检出的耐环丙沙星和左氧氟沙星铜绿假单胞菌是由于DNA促旋酶基因gyrA和gyrB基因的突变和mexAB-OprM和mexCD-OprJ表达增加共同作用的结果。     

β溶血表型摩根摩根菌的鉴定及系统发育树构建

目的对β溶血表型摩根摩根菌进行准确的鉴定和系统发育分析。方法常规方法分离培养菌株;先后采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪、机制辅助激光解析离子-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)、16S rDNA测序3种方法对菌株进行鉴定并验证其结果的正确性;基于16S rDNA的同源性分析和系统发育树构建;并对溶血基因的检测。结果采用16S rDNA序列同源性分析结合构建系统发育树分析,鉴定菌株(标本编号:U1901)与摩根摩根菌摩根亚种NBRC 3848形成一个分支,同源性和可信度均达99.99%,同时验证了MALDI-TOF-MS的鉴定结果比VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪准确及时。检测出新表型摩根摩根菌(β溶血表型)。结论16S rDNA序列同源性分析与系统发育树构建相结合,准确鉴定出新型表型的摩根摩根菌(β溶血表型)。MALDI-TOF-MS在病原微生物检测和鉴定中具有快速、准确等优点,可为临床治疗提供快速的诊断依据。     

DNA sequence analysis of the genetic environment of various blaCTX-M genes

OBJECTIVES: Over a 3 year period (2000-2003) 21 Escherichia coli, 5 Klebsiella pneumoniae, 1 Serratia marcescens and 1 Proteus mirabilis producing CTX-M-type beta-lactamase were collected from five different hospitals in Paris, France. This study was conducted to analyse the genetic environment of these 28 bla(CTX-M) genes. METHODS: Antimicrobial susceptibility testing was performed by the disc diffusion method and MICs of various beta-lactams were determined by an agar dilution method. PCR was used to detect and sequence alleles encoding CTX-M, TEM, SHV and CMY enzymes. The genetic environment was analysed by amplification and direct sequencing using various set of PCR primers or cloning in pBK-CMV. RESULTS: Sequence analysis revealed that these isolates contained seven different bla(CTX-M) genes: bla(CTX-M-1) (4 strains), bla(CTX-M-2) (2 strains), bla(CTX-M-3) (4 strains), bla(CTX-M-9) (1 strain), bla(CTX-M-14) (5 strains), bla(CTX-M-15) (11 strains), bla(CTX-M-24) (1 strain). TEM-1 was associated with CTX-M-type enzymes in 15 isolates. Two strains produced both CTX-M-15 and SHV-2 or CTX-M-14 and CMY-2. In 25 strains the insertion sequence ISEcp1 was located upstream of the 5' end of the bla(CTX-M) gene. Among these strains, in five isolates, ISEcp1 was disrupted by insertion sequences such as IS26 (in three of them) or IS1 or IS10. Insertion sequence IS903 was found downstream of bla(CTX-M-14) or bla(CTX-M-24). Examination of the other three bla(CTX-M) genes (two bla(CTX-M-2) and one bla(CTX-M-9)) by cloning, sequencing and PCR analysis revealed the presence of complex Class 1 integrons, In35, an integron similar to In60 and a novel integron. CONCLUSIONS: This work further confirmed the predominant role of ISEcp1 in the mobilization of bla(CTX-M) genes of the CTX-M-1 cluster and the presence of In35, of an integron similar to In60 and a novel complex Class 1 integron.     

A novel CTX-M beta-lactamase (CTX-M-8) in cefotaxime-resistant Enterobacteriaceae isolated in Brazil

To estimate the diversity of extended-spectrum beta-lactamases in Brazil, 18 strains from different species of the family Enterobacteriaceae exhibiting a positive double-disk synergy test were collected by a clinical laboratory from several hospitals in Rio de Janeiro, Brazil, in 1996 and 1997. Four strains (Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, and Citrobacter amalonaticus) hybridized with a 550-bp CTX-M probe. The P. mirabilis strain produced a CTX-M-2 enzyme. The E. cloacae, E. aerogenes, and C. amalonaticus isolates harbored a bla gene which was identified by cloning and sequencing as a bla(CTX-M) gene. E. coli HB101 transconjugants and the E. coli DH5alpha transformant harboring a recombinant plasmid produced a CTX-M beta-lactamase with an isoelectric point of 7.6 conferring a resistance phenotype characterized by a higher level of resistance to cefotaxime than to ceftazidime, as observed with the other CTX-M enzymes. The deduced protein sequence showed a novel Ambler class A CTX-M enzyme, named CTX-M-8, which had 83 to 88% identity with the previously described CTX-M enzymes. The phylogenic study of the CTX-M family including CTX-M-8 revealed four CTX-M types, CTX-M-8 being the first member of a new phylum of CTX-M enzymes. The evolutionary distances between the four types of CTX-M were large, suggesting that the four clusters branched off early from a distant unknown enzyme and that intermediate enzymes probably existed.     

临床分离志贺菌中产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因型及耐药性分析

目的 了解北京地区临床分离志贺菌携带CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因型及耐药特征。 方法 收集2008-2011年本地区分离出的志贺菌83株,聚合酶链反应(PCR)检测CTX-M型ESBLs耐药基因,明确基因型,阳性产物序列在GenBank上进行比对确定基因亚型,并通过DNAman软件对核酸序列进行分析;对携带CTX-M型ESBLs耐药基因菌株按照Kirby-Bauer法进行药物敏感性试验,测定志贺菌对8种头孢类抗生素耐药情况。 结果 83株志贺菌中,13株携带CTX-M型ESBLs基因,阳性率为15.66%。对DNA序列进行比对、分析均为CTX-M-9型中的CTX-M-14亚型,未发现单核苷酸多态性(SNPs)位点。药敏结果显示,13株携带CTX-M型ESBLs基因菌株对头孢噻吩、头孢唑林、头孢噻肟等头孢类抗生素耐药,对头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟和头孢哌酮等头孢类抗生素均敏感,部分菌株对氨曲南耐药。 结论 本地区志贺菌中CTX-M型ESBLs以CTX-M-14亚型为主,基因结构稳定,携带CTX-M-14型ESBLs菌株呈多重耐药。     

临床分离碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌株的血清荚膜分型及耐药机制

目的分析碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的荚膜血清型和携带毒力基因的情况,以探究其耐药机制。方法采用Vitek-2Compact全自动微生物鉴定仪对分离菌株进行体外药物敏感试验;利用黏液丝试验筛选高黏液阳性菌株;使用改良Hodge试验及碳青霉烯酶抑制试验(CIM)对碳青霉烯酶表型进行检测;利用PCR法检测常见荚膜基因型、碳青霉烯酶耐药基因、β-内酰胺酶基因、膜孔蛋白基因、毒力基因。结果本研究共分离出CRKP 126株[39.87%(126/316)],CRKP菌株中对头孢菌素类、酶抑制剂类、碳青霉烯类、单环类药物耐药率最高,且耐药率显著高于non-CRKP菌株(P<0.05),替加环素类耐药率最低,与non-CRKP菌株差异无统计学意义(P>0.05);改良Hodge试验阳性106株,CIM试验阳性117株;检测出A类碳青霉烯酶KPC基因最多,共117株;β-内酰胺酶基因TEM基因53株,SHV基因100株,CTX-M基因112株,膜孔蛋白Ompk35基因缺失50株,Ompk36基因缺失94株;126株CRKP中携带4种不同耐药基因的菌株数目最多。结论本研究分离获得的CRKP大部分荚膜血清分型尚不清楚,其主要耐药机制为产生碳青霉烯酶,部分菌株合并有膜孔蛋白基因缺失。     

临床患者血培养分离出卡明斯假谷氨酸杆菌的全基因组测序及基因功能分析

目的 应用全基因组测序及生物信息学分析方法对一株分离自腹膜间皮瘤患者血液标本中的卡明斯假谷氨酸杆菌菌株进行基因测序和功能分析。方法 于2018 年8 月2 日~8 月15 日,两次从临床患者血液中分离出的微生物经基质辅助激光解析电离- 飞行时间质谱( matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDITOF)鉴定为卡明斯假谷氨酸杆菌。应用基因组测序软件构建、自组装的基因功能表注释器及anti SMASH 等软件预测其次级代谢反应和产物蛋白生物合成调控相关的基因及基因簇。通过查询COG,KEGG,GO,NR,CAzy 和Swiss-Prot 数据库对预测的基因进行功能注释。结果 卡明斯假谷氨酸杆菌基因组经过重组装、分析筛选及基因序列整合筛选和优化,得到了约300 个Scaffolds,总长度约2 456 693bp,GC 含量平均约为58.39%。分析发现其中约有2 097 个编码基因,1 431 个功能注释蛋白。其中427 个蛋白功能未知,KEGG 预测到的编码蛋白主要集中在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、维生素代谢、脂类代谢和遗传信息传递和表达等通路。CAZy 注释发现27 个碳水化合物代谢相关酶,通过基因序列比对识别出21 个与β- 内酯合成有关的次级代谢基因,序列分析发现89 个抗药性基因。结论 首次成功全面深入分析了卡明斯假谷氨酸杆菌的基因组序列,为今后研究该菌株的代谢特点、致病性及抗药性奠定了基础。