从辽宁省再次分离到基因1型乙型脑炎病毒

目的 了解2007年在辽宁省分离的乙型脑炎病毒基因型别及其病毒E基因分子特征.方法2006年8月在辽宁省东港市采集蚊虫标本,利用组织培养细胞进行病毒分离,对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定.结果从采集的30批,共1500只三带喙库蚊标本中分离到2株病毒,命名为LNDG07-02、LNDG07-16,经鉴定均为基因1型乙脑病毒.病毒E基因区段核苷酸和氨基酸序列与乙脑减毒活疫苗株(SA14-14-2株)的同源性分别为87.8%～88.0%和97.2%,新分离病毒E基因区段与疫苗株存在11处氨基酸位点差异,与2002年在辽宁省分离的乙脑病毒相比,未发现氨基酸位点变异.结论自2002年以来在东港市再次分离到基因1型乙脑病毒,与2002年在辽宁分离的基因1型乙脑病毒相比E基因区段氨基酸未发生变异.基因1型乙脑病毒在辽宁省东港市持续存在.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

我国首次分离到基因Ⅰ型乙型脑炎病毒

目的　对新分离乙型脑炎病毒鉴定 ,了解病毒E基因区段的氨基酸序列特征及基因分型。方法　 2 0 0 1年在上海市采集蚊虫标本 ,用组织培养的方法分离到 7株病毒。进行病毒一般生物学鉴定 ,对病毒PrM和E基因区段约 2 0 0 0nt进行了扩增、克隆、测序。应用ClustalX软件做碱基配对和比较分析 ,种系发生采用PHYLIP软件包分析。结果　 7株病毒可以引起BHK 2 1细胞规律病变 ,病变时间为 6 0h。乳鼠脑内接种病毒后 72h死亡。所有新分离病毒与标准乙型脑炎病毒抗体阳性反应。用病毒PrM区段 (4 5 6～ 6 95位核苷酸 )进行的基因分型分析 ,新分离的 7株病毒属于基因Ⅰ型乙型脑炎病毒。以减毒活疫苗株SA14 14 2为标准 ,对 7株病毒的E基因区段进行分析 ,7株病毒之间核苷酸同源性在 97.7%以上 ,氨基酸同源性在 99.2 %以上 ;7株病毒与疫苗株SA14 14 2核苷酸差异在 12 .2 %左右 ,氨基酸差异在 2 .8%～ 3.2 %之间 ,共有 14个共同的氨基酸位点差异。结论　 2 0 0 1年在上海采集的蚊虫中新分离的 7株病毒属于基因Ⅰ型乙型脑炎病毒 ,为我国的首次报道     

2010年福建省流行性乙型脑炎病毒监测

目的掌握福建省自然界蚊虫中乙型脑炎病毒感染率及基因型别特征。方法2010年在福建省三明市、建阳市和福州市采集蚊虫标本,研磨处理后采用乙脑病毒特异性检测引物进行分子筛查。PCR产物直接进行双向测序,应用ATGC、ClustalX（1．83）、MegAlign、GeneDoc3．2和Mega4等生物学软件完成全基因组序列拼接、比对和核苷酸与氨基酸同源性分析、系统进化分析。结果共采集6987只蚊虫标本,主要是三带喙库蚊和中华按蚊。3个监测点均检测到乙脑病毒核酸序列,三明市、建阳市和福州市蚊虫中乙脑病毒带毒率分别为1．25％、1．76％和0．65％。从建阳市采集的三带喙库蚊中扩增出1株乙脑病毒全基因序列,经鉴定所有检测到的乙脑病毒序列均属于基因I型。结论福建省自然界蚊虫中以基因I型乙脑病毒为主。     

流行性乙型脑炎病毒脑脊液分离株"47株"全基因组特征分析

目的 对1950年分离自我国黑龙江省患者脑脊液的乙脑病毒"47株"进行全基因组序列的测定和分析,全面了解其全基因组特征.方法 复苏毒种提取病毒RNA,使用自行设计的乙脑病毒全基因组扩增测序引物,完成对病毒全基因组序列的测定.采用DNAStar、Modeltest、Phylip等生物软件完成全基因组核苷酸、氨基酸序列差异分析和乙脑病毒全基因组的系统进化分析.结果 乙脑病毒"47株"全长10 977个核苷酸.96至10 391位为开放读码框ORF,共10 296个核苷酸,编码3432个氨基酸."47株"与5株疫苗株在全基因组水平的核苷酸差异在2.4%～4.4%之间,氨基酸差异在0.3%～1.1%之间.乙脑病毒全基因组最适进化模型为GTR+I+G.全基因组进化分析显示"47株"属于基因Ⅲ型乙脑病毒.结论 "47株"全基因组核苷酸和氨基酸高度保守,属于基因Ⅲ型乙脑病毒.     

辽宁省乙脑病毒的分离与鉴定

目的 对2002年辽宁省采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 从辽宁省采集蚊虫标本4927只，用细胞培养的方法分离病毒，对新分离的病毒进行血清学（ELISA和IFA方法）、分子生物学鉴定。结果 本实验共研磨蚊虫标本50批，分离到2株病毒，命名为LN02-102、LN02，104。这2株病毒均可致BHK-21细胞病变（CPE）（2—3d），致Vero细胞病变（2—4d），也可致C6／36细胞病变（2—4d）。对3日龄乳鼠2—3d可致死。这2株病毒可与标准乙脑病毒抗体反应。利用病毒PrM区段（基因组456-695核苷酸）进行基因分型分析。新分离的2株病毒属于基因Ⅰ型乙脑病毒。对这2株病毒的E基因区段进行分析，它们之间核苷酸和氨基酸的同源性为100％，与疫苗株SA14-14-2相比，核苷酸差异为4．11％，氨基酸差异在0．60％。结论 在辽宁省采集的蚊虫标本中分离到2株病毒，经血清学和分子生物学鉴定为基因Ⅰ型乙脑病毒，是近年来在辽宁省首次分离到基因Ⅰ型的乙脑病毒。     

四川省流行性乙型脑炎病毒优势基因型的研究

目的了解四川省乙脑主要流行区乙脑病毒的分子生物学特性,为防治提供依据。方法对2007-2010年间分离到的13株乙脑病毒进行PreM和E基因区扩增,采用MEGA5生物学软件完成氨基酸序列和病毒进化树分析。结果基因分型显示13株均属于基因I型。13株病毒之间比较,PreM基因核苷酸和氨基酸同源性为97％-100％和98．7％-100％,E基因核苷酸和氨基酸同源性为97．8％～99．9％和99．6％～100％,其同源性极高。13株病毒与2004年四川分离株比较E基因核苷酸同源性在97．7％～99．6％之间,氨基酸同源性在98．6％-100％之间;PreM基因的核苷酸同源性在96．2％-99．1％之间,氨基酸同源性在97．5％-98．7％之间;与疫苗株P3和SA14—14—2比较E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为87．6％～88．3％和97％～97．8％;PreM基因核苷酸和氨基酸同源性分别为84．1％～85．8％和93．7％-96．2％。13株病毒E基因的8个氨基酸毒力位点均没有发生改变。结论四川省乙脑病毒已呈现基因I型为优势型别的态势,其PreM和E区核苷酸和氨基酸高度保守,关键的氨基酸毒力位点没有变化,提示目前使用的疫苗对流行株的感染具有保护作用。     

我国新分离乙脑病毒02-76株的全基因序列特征

目的对我国新分离乙脑病毒02-76株进行全基因序列测定和分析，了解乙脑病毒基因组结构及毒力特性。方法设计乙脑病毒全基因组扩增引物，RT-PCR扩增片段，PCR产物直接测序，拼接后获得全基因序列。通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒02．76株全基因组全长10977个核苷酸，从96位到10391位，共10296个核苷酸编码一个开放阅读框，编码3432个氨基酸。与我国1949年分离的Beijing-1株相比较共存在248个核苷酸差异，16个氨基酸差异。与GenBank中选择的29株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸总体差异率为0．6％-15．1％，氨基酸总体差异率为0．2％-4．6％。通过PrM／C区段、E区段、3’NTR区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因3型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒02-76株属于基因3型，与中国分离株SA-14进化关系最接近。     

福建省新分离3株乙型脑炎病毒的分子特征鉴定

目的　确定福建省新分离乙型脑炎病毒 (JEV)的基因分型及其E区段氨基酸序列特征。方法　用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增并克隆新分离JEV(0 2 4 1、0 2 4 3、0 2 10 2 )的PrM、E区段核苷酸序列 ,测序后应用ClustalX软件做碱基配对和比较分析 ,种系发生采用PHYLIP软件包分析。结果　新分离的 3株JEV属于基因Ⅲ型 ,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA 14 14 2株的同源性均在 96 %以上 ,在关键结构域有部分氨基酸差异。结论　福建省新分离的 3株病毒属于基因Ⅲ型JEV ,E蛋白与疫苗株相比有部分氨基酸差异     

2008年辽宁省乙脑病毒分离株全基因组特征分析

目的 对2008年分离自辽宁蚊虫的乙脑病毒株进行全基因组序列测定和分析,了解其全基因组特征.方法 使用针对乙脑病毒全基因组测序引物,RT-PCR扩增片段,完成对病毒全基因组序列的测定.应用Chstal X(1.83)、ATGC(V4)、DNAStar、GENEDOC(3.2)、Mega(4.0)等生物学软件完成全基因组核苷酸和氨基酸序列分析及病毒的系统进化分析.结果 乙脑病毒LN0828株基因组全长10 965个核苷酸,其中从97位到10 392位为开放读码框,编码3432个氨基酸.与GenBank中的32株乙脑病毒在全基因组水平的核苷酸总体差异率为1.6%～16.4%,氨基酸总体差异率为0.3%～5.1%.与减毒活疫苗株SA14-14-2相比,编码区共存在1186个核苷酸差异,86个氨基酸差异.全基因组序列系统进化分析显示LN0828株属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 与该地区2002年和2007年乙脑病毒分离株高度同源,关键位点氨基酸未见变异.     

2005年流行性乙型脑炎疫情分析

目的了解2005年我国贵州、四川和湖北省三个监测点的乙脑流行情况。方法收集三个监测点的乙脑流行状况、媒介蚊虫、宿主带毒水平。结果2005年我国贵州、四川和湖北3个省的乙脑报告病例数占全国总数的40．7％，其中贵州和四川省的病例数居全国前2位，发病率均超过1／10万，高于全国平均水平；报道病例中0～10岁儿童占报告病例90％以上；病例以散居儿童为主；乙脑病例主要集中于6-9月，而7～8月发病数最多；蚊虫密度调查显示库蚊和三带喙库蚊为主要蚊种。结论三省监测点与全国乙脑流行规律相同。贵州和四川省乙脑病例居全国前2位。     

乙型脑炎病毒单克隆抗体制备及其特性鉴定

目的制备乙脑病毒单克隆抗体并对其各项生物学性质进行鉴定。方法通过免疫、融合、克隆和筛选等方法制备乙脑单抗,使用ELISA、IFA、中和试验和Westernblot等方法鉴定单抗的敏感性、特异性、种内反应广谱性以及中和活性。结果最终获得3株稳定分泌的乙脑单克隆抗体细胞株,其滴度均超过106。3株单抗只与乙脑病毒反应,与其他9种虫媒病毒皆不反应。ELISA相加试验证明3株单抗的作用位点非常相近,选择其中的F12.37与10个代表性乙脑病毒株反应,F12.37能够敏感地检测到所有10个在细胞内复制的病毒株。F12.37还能够中和乙脑P3株(基因Ⅲ型)和SH03-103株(基因Ⅰ型),保护50%细胞不产生病变的稀释度分别为1∶3.2×105和1∶105,Westernblot结果显示F12.37与乙脑病毒E蛋白相互作用。结论本研究获得了3个高滴度、高特异性的乙脑单克隆细胞株,其中F12.37具有较高的敏感性和较好的种内反应广谱性,能够中和两个基因型乙脑病毒,其作用位点位于乙脑病毒E蛋白。     

河南省部分地区健康人群流行性乙型脑炎病毒中和抗体监测

目的 分析健康人群流行性乙型脑炎（乙脑）病毒中和抗体水平特征和影响因素.方法 采用随机抽样方法在信阳市和洛阳市选择＜1岁、1～2岁、3～4岁、5～6岁、7～14岁、15～19岁、20 ～59岁、≥60岁8个年龄组健康人群,分别于2010年5月和11月两次采集血液标本并进行流行病学调查,用微量细胞中和试验检测乙脑病毒中和抗体.结果 两市共调查519人,两次共采集和检测有效血液标本1008份,其中男性乙脑病毒中和抗体阳性率为59.52％,女性为67.39％,男女中和抗体阳性率差异无统计学意义（x2=3.41,P＞0.05）.5月,两市中和抗体阳性率为58.66％,11月为61.20％,乙脑流行前后中和抗体阳性率差异无统计学意义（x2 =0.68,P＞0.05）.信阳市0～14岁中和抗体阳性率为55.19％,洛阳市为45.03％,两市0～14岁中和抗体阳性率差异无统计学意义（x2=3.53,P＞0.05）;信阳市≥15岁中和抗体阳性率为97.78％,洛阳市为48.94％,两市≥15岁中和抗体阳性率差异有统计学意义（x2=55.42,P＜0.05）.两市有乙脑免疫史者中和抗体阳性率为56.85％,无乙脑免疫史者为38.35％,有无免疫史者中和抗体阳性率差异有统计学意义（x2=10.88,P ＜0.05）.结论 信阳市和洛阳市≥15岁人群间、有无乙脑免疫史人群间乙脑病毒中和抗体均有显著性差异,建议信阳市和洛阳市加强0～14岁人群免疫接种,同时关注和探讨洛阳市≥15岁人群免疫策略.     

浙江省基因Ⅰ型乙脑病毒全基因序列的测定及分析

目的 为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料,研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度,为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据.方法 设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因,PER产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定.通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析.结果 新分离乙脑病毒XJ69和NJP613株全基因组全长均为10 964个核苷酸,含有一个开放阅读框架,编码3432个氨基酸.与GenBank中选择的32株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸同源为83.5%～99.2%,氨基酸总体同源性为97.5%～99.7%.通过PrM/C区段、E区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 新分离的乙脑病毒XJ69和XJP613株属于基因Ⅰ型,与上海三带喙库蚊分离株SH17M-07关系最为接近.