RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2后对胶质瘤细胞生长的影响及其机制

目的 探讨RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因表达后对胶质瘤细胞生长的影响及其机制.方法 用携带U6启动子和LRIG2特异性短发夹RNA(shRNA)序列的质粒载体pGenesi12-LRIG2-shRNA(siRNA)及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒pGenesi12-scramble-shRNA(scr)转染胶质瘤细胞系GL15、G418(600mg/L)筛选出稳定株,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测LRIG2和表皮生长因子受体(EGFR)表达的改变.噻唑蓝(MTT)比色法检测稳定转染对照组和实验组细胞的增殖,流式细胞仪检测对照组和实验组细胞的细胞周期改变.结果 实验组细胞LRIG2 mRNA和蛋白水平与对照组比较分别下降了68.6%和62.3%,EGFR蛋白水平下降了32.6%.MTT结果显示实验组细胞增殖率低于对照组.细胞周期分析表明对照组G0/G1期为(26.72±2.10)%,实验组为(36.58±3.29)%(P<0.05),LRIG2表达下调后GL15细胞细胞周期部分阻滞在G0/G1期.结论 GL15细胞经RNA干扰基因表达后,LRIG2 mRNA和蛋白水平明显降低,同时EGFR蛋白水平下降,从而抑制细胞增殖和使细胞周期阻滞在G0/G1期.LRIG2可通过EGFR信号系统影响胶质瘤细胞的生长.     

RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3表达对胶质瘤细胞周期和凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3(LRIG3)基因表达后对胶质瘤细胞生长的影响及其机制.方法 设计两对含LRIG3特异性短发夹RNA(shRNA)序列的质粒及含非特异性shRNA的对照质粒,转染胶质瘤细胞系GL15、G418筛选出稳定株,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测LRIG3表达的改变,流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双标记分析细胞凋亡.结果 实验组细胞LRIG3 mRNA和蛋白水平与对照组比较分别下降了52.4%、63.8%和50.9%、67.4%.流式细胞仪分析显示,实验组的G2/M期细胞细胞百分率比对照组明显增加,细胞增殖指数显著增加(P<0.01);LRIG3基因表达下调后还具有显著的抗凋亡作用(P<0.05).结论 LRIG3特异性siRNA可明显抑制LRIG3基因的转录和表达,从而促进GL15细胞的增殖和使细胞周期阻滞在G2/M期并能抑制其凋亡.     

LRIG1基因表达下调对胶质瘤细胞周期及凋亡的调控作用

目的 探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)基因表达下调后对胶质瘤细胞的周期及凋亡的影响及其机制.方法 将携带针对LRIG1基因特异性RNA干扰序列及非特异性shRNA编码序列的质粒载体分别转染GL15细胞株,用G418(600 mg/L)筛选出稳定株后,Western blot法检测LRIG1蛋白表达的改变,PI(0.05 g/L)与Rnasine(0.5 g/L)标记后流式细胞仪检测对照组与实验组细胞的周期差异,Annexin V-FTTC/PI双标后用流式细胞仪观察两组细胞凋亡的改变.结果 成功获得干扰LRIG1基因的GL15细胞稳定株,实验组较对照组LRIG1基因表达下降54.7%.流式细胞仪分析显示,实验组的G2/M期细胞百分率较对照组明显增高(P＜0.01),实验组细胞的凋亡比例明显低于对照组(P＜0.01).讨论抑制LRIG1表达后,GL15细胞的抗凋亡能力明显增强并能使细胞阻滞在G2/M期.     

过度表达LRIG1基因逆转人胶质瘤侵袭性的机制

目的　探讨LRIG1基因抑制恶性胶质瘤细胞侵袭、浸润的分子机制。方法　应用脂质体介导的基因转染技术将p3XFLAG CMV9 LRIG1质粒转染入人神经胶质瘤H4细胞系 ,通过逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和Westernblot方法检测转染前、后LRIG1和表皮生长因子受体(EGFR)基因mRNA和蛋白表达水平 ,用Boyden小室体外侵袭试验观察H4细胞通过人工重组基底膜能力的变化。结果　转染p3XFLAG CMV 9 LRIG1质粒后 ,H4神经胶质瘤细胞的LRIG1mRNA和蛋白表达均较对照组明显增强 (P <0 .0 1) ;而EGFRmRNA和蛋白表达均较对照组明显减弱 (P <0 .0 1)。LRIG1质粒转染的H4细胞穿过人工重组基底膜的相对百分率为 (13 .3± 1.8) % ,明显低于未处理组和转染空载体组的穿膜细胞百分率 (2 4.7± 1.8) % ,(2 4.0± 1.5 ) % (P =0 .0 0 8和P =0 .0 10 )。结论　EGFR的过表达促进了胶质瘤的侵袭、浸润 ;LRIG1通过抑制EGFR逆转了恶性胶质瘤侵袭、浸润。     

LRIG基因家族在垂体腺瘤HP75细胞系中的表达下调

目的 观察LRIG基因家族成员及EGFR基因在垂体腺瘤HP75细胞系及正常垂体组织中的表达.方法 采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定LRIG基因家族及EG-FR基因在垂体腺瘤HP75细胞系及正常垂体组织中的表达.RT-PCR参数为60℃5 min,95℃5min,然后45个循环95℃15s和60℃30s.结果 LRIG基因家族及EGFR基因在HP75细胞系及正常垂体组织中均有不同水平的表达.LRIG基因家族在HP75细胞系中的表达水平低于正常垂体组织,EGFR在HP75细胞系中的表达高于正常垂体组织.HP75细胞系细胞中EGFR/LRIG1比值是正常垂体组织的13倍,EGFR/LRIG2比值是正常垂体组织的14倍,EGFR/LRIG3比值是正常垂体组织的11倍.结论 LRIG基因家族在垂体腺瘤HP75细胞系中的表达下调.     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白2-胶质瘤细胞表皮生长因子受体信号网络新的调控靶点

目的 确定富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白2(LRIG2)是胶质瘤细胞系GL15中EGFR信号通路新的调控靶点.方法 培养胶质瘤细胞系GL15细胞,经表皮生长因子(EGF)100μg/L,AG1478 10 μmol/L,放线菌酮(CHX)10 mg/L体外干预后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot测定LRIG2 mRNA和蛋白表达的时间效应变化.结果 随着EGF作用时间的延长,LRIG2 mRNA先上升后恢复至正常水平.EGF作用后,表皮生长因子受体(EGFR),磷酸化EG-FR(pEGFR)均先上升后下降,LRIG2蛋白先下降,在30min时上升,120min下降至原水平的50%.CHX作用1.5 h后,再加入EGF刺激,可见LRIG2蛋白60 min降至原水平的50%.而AG1478作用1 h后,再用EGF刺激,EGFR未受明显影响,pEGFR被明显抑制,LRIG2蛋白水平变化不明显.结论 EGFR活化后可导致LRIG2 mRNA表达上升,LRIG2蛋白合成增加.     

LRIG1对人脑胶质瘤放疗敏感性的作用及其机制

目的 探讨多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1( LRIG1)对人脑胶质瘤细胞株U251放疗敏感性的影响及其机制.方法 应用脂质体介导的基因转染技术将PEGFP-N1、PEGFP-LRIG1 质粒分别转染人人脑胶质瘤U251细胞,G418( 1000 mg/L)筛选,建立稳定细胞株,采用克隆形成实验测定N1-U251及LRIG1-U251两组细胞的放射敏感性,Western blot法测定两组细胞中LRIG1及RAD51蛋白的表达差异,彗星分析法测定两组细胞双链DNA断裂的修复.结果 成功建立高表达LRIG1的U251稳定细胞株,LRIG1-U251组(0.352±0.011)较N1-U251组(0.071±0.003) LRIG1基因表达明显上调(P＜0.01).LRIG1基因表达上调后U251细胞的放射敏感性增加,放射增敏比为1.448.上调LRIG1基因明显抑制了RAD51基因的表达(P＜0.01)及照射后的高表达(P＜0.01).彗星分析表明LRIG1基因的过表达将照射8h后U251细胞的Olive彗尾力矩由21.14±3.42增加至32.81±5.61 (P ＜0.05).结论 LRIG1可以增加人脑胶质瘤U251细胞的放射敏感性.机制可能是通过降低RAD51蛋白表达,进而抑制双链DNA损伤的修复.     

干扰多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1促进人胶质母细胞瘤U251细胞株侵袭性的机制

目的 探讨干扰多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)基因表达促进人胶质母细胞瘤U251细胞株侵袭性的机制.方法 用携带U6启动子的LRIG1特异性短发夹RNA (shRNA)序列的质粒载体pGenesil2-LRIG1-shRNA (siRNA)及含非特异shRNA编码序列的对照质粒pGenesil2-negative shRNA(neg)转染U251细胞株,通过G418筛选,鉴定得到稳定转染细胞株.采用侵袭实验验证干扰LRIG1对U251侵袭性的影响,通过明胶酶谱实验检测基质金属蛋白激酶(MMP)-2、MMP-9的活性,Western blot法检测表皮生长因子(EGFR)及其下游丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B( P13K/AKT)信号通路蛋白的表达差异.结果 含U6启动子LRIG1 shRNA序列的质粒转染干扰组LRIG1 mRNA降低至对照组(35.3％～39.2％,P＜0.05).干扰LRIG1表达组U251细胞侵袭数[(159±15)～ (188±9)/视野],较空白对照组细胞侵袭数[(28±9)/视野]明显增多(P＜0.05);干扰LRIG1激活EGFR通路传导;干扰LRIG1后干扰组MMP-2较对照组活性增加(1.66±0.11～1.96±0.12,P＜0.01),MMP-9干扰组较对照组活性增加(4.82±0.27～4.47±0.29).结论 LRIG1表达下调后MMP-2、MMP-9活性增强,从而促进U251细胞的侵袭性,可能通过激活EGFR信号通路引起.     

RNAi沉默pyk2基因对鼠脑胶质瘤细胞增殖、侵袭能力的影响

目的 探讨pyk2小干扰RNA表达载体对小鼠脑胶质瘤G422细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 用以pGenesil-1质粒为载体,以pyk2为靶基因,构建短发夹状小干扰RNA表达载体.用pyk2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的人脑胶质瘤G422细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测pyk2基因和蛋白表达的改变,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染后细胞的增殖情况,Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力.结果 构建了pGenesil-1-pyk2重组质粒,并成功转染G422细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示pyk2 siRNA转染G422细胞后显著降低pyk2mRNA的表达,以48 h为著,下降近70%;Western blot证实转染后pyk2蛋白的表达下降近65%;G422细胞的活力降低为(67.1±5.2)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降.结论 pGenesil-1-pyk2 siRNA重组质粒明显下调pyk2在胶质瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖,抑制其侵袭能力.     

LRIG3基因过表达对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原和Ki-67表达的影响

目的 探讨过表达LRIG3基因对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki-67表达的影响及其机制。方法 用携带LRIG3过表达特异性序列和只含空白载体的质粒用慢病毒法感染胶质瘤细胞株U251与U87,筛选稳定株,分别分成实验组和对照组,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测各组细胞LRIG3表达的变化,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测病毒感染后对胶质瘤细胞株U251与U87增殖的影响,用免疫组织化学链霉亲和素生物素复合物(SABC)法分别检测各组细胞中PCNA和Ki-67的表达差异。结果 LRIG3过表达组细胞中LRIG3 mRNA水平与对照组比较分别升高67.6％( U251)和79.9％ (U87),LRIG3蛋白表达水平分别升高62.3％(U87)和91.0％( U251)。MTT法结果显示两实验组细胞增殖率均低于相应对照组。U251细胞对照组PCNA阳性率为(47.81 ±4.67)％,实验组为(27.49±3.17)％,U87细胞对照组PCNA阳性率为(55.50±4.01)％,实验组为(33.60±4.82)％,差异均有统计学意义(P＜0.05)。U251细胞对照组中Ki-67的阳性率为(48.50±6.11)％,实验组为(24.30±3.76)％,U87细胞对照组Ki-67阳性率为(55.20±4.19)％,实验组为(23.50±4.60)％,差异均有统计学意义(P＜0.0l)。结论 LRIG3基因过表达可减少胶质瘤细胞的增殖。     

抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响

质粒转染人膀胱癌BIU87细胞，用G418（800mg／L）筛选出抗性克隆。Western blot检测转染前后LRIG1和EGFR蛋白水平的变化；MTT法绘制转染前后细胞的生长曲线；Boyden小室和同质黏附实验观察转染前后细胞侵袭和黏附能力的变化。结果转染pLRIG1-GFP组LRIG1蛋白表达水平较对照组和转染空载体组明显升高，而EGFR蛋白表达水平较对照组和转染空载体组显著降低；转染pLRIG1-GFP组细胞的生长速度较对照组和转染空载体组明显减慢；转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭目的研究抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术，将pLRIG1-GFP和黏附能力显著降低（P〈0．05）。结论LRIG1是一种抑癌基因，通过参与形成EGFR的负反馈环路，对膀胱癌细胞BIU87的生长、侵袭和转移有显著的抑制作用。     

LRIG1, a candidate tumour-suppressor gene in human bladder cancer cell line BIU87

OBJECTIVES: To determine the effects of LRIG1 on the growth, migration and invasion of bladder cancer cells and the mechanisms underlying such effects. MATERIALS AND METHODS: The plasmid pLRIG1-green fluorescence protein (GFP) was transfected into BIU87 bladder cancer cells by Lipofectamine2000 (Invitrogen, Groningen, the Netherlands), and the cells that expressed LRIG1 stably were screened out by G418. The changes in LRIG1 and epidermal growth factor receptor (EGFR) protein levels were measured by Western blot; growth curves were estimated by the tetrazolium (MTT) assay; then cell-cell adhesion, cell-matrix adhesion and cell invasion assays were used to measure proliferation, adhesion and invasion in LGIR1-transfected and control cells. RESULTS: The LRIG1 protein level in pLRIG1-GFP transfected cells was significantly higher than that in control cells, while the EGFR protein level was significantly lower. pLRIG1-GFP transfected cells had less proliferation than control cells. Contrasting with non-LRIG1-transfected cells, the invasion and cell-matrix adhesion ability of pLRIG1-GFP transfected cells decreased markedly, and conversely the homotypic cell-cell adhesion ability was significantly higher. CONCLUSIONS: LRIG1 might act as a tumour-suppressor gene, participating in negative feedback control of EGFR expression, which inhibits bladder cancer cells from growth, migration and invasion.     

稳定表达LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1的建立和鉴定

目的 建立稳定表达外源性LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1.方法 利用脂质体介导的基因转染技术将质粒转染人人膀胱癌细胞株BIU87,实验分为3组:BIU87-LRIG1组(转染pLRIG1-GFP)、BIU87组(未转染质粒)和BIU87-neo组(转染pEGFP-N1).经用G418筛选3周后出现抗性克隆,对其扩大培养后,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分析各组中LIRG1 mRNA及其蛋白表达.结果 RT-PCR结果 表明,BIU87-LRIGl组中LRIG1 mRNA的表达水平(2.352 ±0.133)较BIU87-neo组(0.642±0.091)和BIU87组(0.516±0.045)明显升高;Western blot结果 显示,BIU87-LRIG1组LRIG1蛋白表达水平(2.120±0.113)较BIU87组(0.946±0.075)和BIU87-neo组(1.132±0.076)明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 成功建立了稳定表达外源性LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1.     

siRNA沉默肾癌细胞EGFR基因对放疗敏感性影响的研究

目的：探讨siRNA沉默AcHN肾癌细胞的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）对放疗敏感性的影响。方法：免疫组化及细胞免疫荧光技术证明组织水平及细胞水平EGFR的表达,化学合成针对EGFR的小干扰RNA,通过脂质体转染法转染进ACHN肾癌细胞中,利用Westernblot技术检测细胞中EGFR蛋白的表达,然后分别用0、2、4、6、8Gy剂量的x线对5组肾癌细胞（每组包含空白对照组、非异性RNA干扰组、特异性RNA干扰组）进行照射,光学显微镜下观察细胞凋亡情况,采用台盼蓝据染法检测细胞凋亡率。结果：靶向EGFR序列的特异性干扰RNA可明显抑制EGFR蛋白的表达,光学显微镜下观察到RNAi联合放疗组细胞死亡情况明显,台盼蓝拒染法检测特异性干扰EGFR基因组可显著提高AcHN肾癌细胞对放疗的敏感性（P〈O．05）。结论：体外研究表明,siRNA沉默ACHN肾癌细胞的EGFR可明显提高肾癌细胞对放疗的敏感性,为肾癌放射治疗提供了新思路。     

siRNA诱导EZH2基因增强子的表观沉默及其对人前列腺癌细胞的增殖抑制

目的 通过小分子RNA(siRNA)介导靶基因沉默技术,干扰前列腺癌细胞中果蝇zeste基因增强子的人类同源物的表达,以探讨靶向EZH2基因的RNAi对前列腺癌细胞增殖抑制的效应.方法 设计靶向EZH2基因的RNA干扰(RNAi)载体,构建重组表达质粒并且转染人前列腺癌细胞22RV1.利用MTT比色法检测靶向沉默EZH2表达对于22RVl的增殖抑制的影响:利用qRealtime-PCR鉴定转染组与空白组细胞中EZH2基因mRNA的表达量;提取各组细胞的总蛋白,利用Western Blotting检测EZH2蛋白的表达情况.结果 在转染了靶向EZH2基因siRNA的细胞株中,可以检测到EZH2表达呈明显的下调趋势:而在空白对照组中其表达很稳定.另外,诱导EZH2基因沉默可以抑制该前列腺肿瘤细胞的增殖和生长.上述结果 在各组细胞间旱现明显的统计学差异(P<0.05).结论 siRNA诱导的RNAi可以有效的抑制其靶基因EZH2的表达,同时可以抑制前列腺癌细胞的增殖和生长,是一种潜在的基因治疗新方法 .     

靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法：体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果：HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列（P〈0.05）。结论：成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。