牙本质非胶原蛋白及其在矿化中的作用

牙本质为一种矿化的结缔组织，其重量的７０％为矿物质，２０％为有机质，１０％为水，有机质主要由胶原蛋白和非胶原蛋白组成，后者在牙本质形成过程中有重要作用，本文就近年来的研究状况作一概述。     

各种牙本质非胶原蛋白矿化作用的研究进展

牙本质胞外基质由９０％胶原和１０％非胶原蛋白构成,其中胶原为羟基磷灰石板状晶体的沉积提供支架,ＮＣＰＳ则被认为控制晶体沉积的启动和生长。研究ＮＣＰＳ中各组人在牙本质矿化中的作用,对阐明牙齿发育及修复的分子学机制有着重要意义 。     

各种牙本质非胶原蛋白矿化作用的研究进展

牙本质胞外基质由90％胶原(主要为Ⅰ型)和10％非胶原蛋白(non-collagenous proteins,NCPs)构成。其中胶原为羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)板状晶体(plate like crystalline)的沉积提供支架,NCPs则被认为控制晶体沉积的启动和生长。研究NCPs中各组分在牙本质矿化中的作用,对阐明牙齿发育及修复的分子学机制有着重要意义。     

EPO对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的体外探究促红细胞生成素(EPO)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)增殖及分化的影响。方法体外常规培养hDPSCs后,不同浓度EPO(0、0.1、1、10、20、50 U/ml)刺激hDPSCs,CCK-8法检测细胞增殖能力变化;采用碱性磷酸酶(ALP)染色及活性测定、茜素红染色、Real-time PCR来研究EPO对hDPSCs分化的影响。结果 10U/ml EPO可以促进hDPSCs的增殖(P<0.05);20U/ml EPO组碱性磷酸酶染色加深,活性提高,钙化结节形成增多;成血管成牙成骨向分化相关基因VEGF、bFGF、DSPP、Runx2、ALP的表达上调(P<0.05)。结论适宜浓度的EPO可以促进hDPSCs的增殖及分化。     

不同浓度葡萄糖对人牙髓细胞增殖凋亡及矿化的影响

目的:探讨人牙髓细胞(hDPCs)在不同浓度葡萄糖作用下,细胞增殖凋亡及矿化情况。方法:体外培养的第4代hDPCs分为正常组、高糖1组和高糖2组,分别用含葡萄糖浓度为0、 5.5、 40和50 mmol/L的培养基培养,21 d后CCK-8实验检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,qRT-PCR检测DMP1和DSPP mRNA相对表达量;茜素红染色观察矿化结节情况,试剂盒检测MDA含量及SOD和ALP活性,Wester blot检测Bcl-2、Bax及DSPP和DMP1蛋白相对表达量。结果:正常组矿化结节明显,其余2组矿化结节少。正常组细胞存活率、SOD和ALP活性、DMP1和DSPP mRNA相对表达量、Bcl-2以及DMP1和DSPP蛋白相对表达量均高于高糖1组(P<0.05)和高糖2组(P<0.05),而细胞凋亡率、MDA含量、Bax蛋白相对表达量均低于高糖1组(P<0.05)和高糖2组(P<0.05),以上指标差异在高糖2组比1组更明显(P<0.05)。结论:高糖抑制人牙髓细胞增殖和矿化,可能是高糖增强氧化应激反应引起。     

瘦素对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的 探讨瘦素(leptin)对体外培养的牙髓干细胞增殖、分化的影响.方法 体外培养牙髓干细胞,采用MTT法及流式细胞技术检测不同浓度瘦素对牙髓干细胞增殖作用的影响,通过碱性磷酸酶、Yon Kossa染色及矿化相关蛋白(DSP、OCN)的免疫组化染色来检测瘦素对牙髓干细胞分化的影响.结果 瘦素对牙髓干细胞增殖没有显著作用,但是对牙髓干细胞的ALP活性呈浓度依赖性促进.Von Kossa染色可见矿化结节形成,DSP及OCN表达阳性.结论 瘦素可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化.     

Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞增殖能力的影响

目的: 初步研究Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖能力的影响。方法: 采用体外贴壁式培养法培养人牙髓干细胞,应用Rho激酶抑制剂Y-27632,根据培养条件,分为普通培养液培养组(Con)及普通培养液+抑制剂Y-27632培养组(Con+Y),采用MTT法检测两种培养条件下人牙髓干细胞培养24、48、72、96 h细胞活性;采用DAPI染色法及流式细胞定量检测技术(FCM)比较两组在培养48 h的细胞数量及细胞周期分布情况。结果: MTT结果显示,实验组hDPSCs细胞增殖曲线较对照组明显上移,且增殖高峰期提前;培养48 h,DAPI染色结果显示,实验组细胞总数量明显多于对照组;FCM结果显示,对照组G₀/G₁期细胞比例为(66.8±6.84)%,S期细胞比例为(25.17±0.62)%,实验组G0/G1期细胞比例为(58.59±1.76)%,S期细胞比例为(31.34±1.16)%,实验组S期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)。 结论: Rho激酶抑制剂Y-27632促进人牙髓干细胞DNA合成、细胞分裂及增殖。     

模拟微重力对人牙髓干细胞-PLGA复合物矿化的影响

目的:研究模拟微重力(SMG)对人牙髓干细胞(hDPSCs)在聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上矿化的影响。方法:采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,并进行鉴定。hDPSCs常规接种于PLGA支架,24h后,模拟微重力环境和普通环境下分别矿化诱导。矿化诱导第3、5、7、10、14天时进行碱性磷酸酶活性检测,第21天时进行茜素红染色以观察人牙髓干细胞在PLGA支架上矿化结节形成情况。结果:模拟微重力环境下的碱性磷酸酶活性明显低于普通环境(P<0.01),茜素红染色显示模拟微重力环境下形成的矿化结节较普通环境下的小且数量少。结论:模拟微重力环境抑制hDPSCs在PLGA支架上的矿化。     

miR-103对牙髓干细胞增殖及其向成牙本质细胞分化的影响

目的:探讨miR-103对牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的影响.方法:从即刻拔除的成入第三磨牙中分离培养人牙髓干细胞,将培养的细胞分为对照组、miRNA阴性对照组、miR-103过表达组和miR-103降低表达组,利用CCK-8法检测人牙髓细胞的增殖能力变化,利用q-PCR和Western Bolt技术检测人牙髓细胞中R...     

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1 (Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hPDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用.方法:体外分离培养hPDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率.采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平.对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调.结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用.     

矿化液对人牙髓干细胞生物学特性的影响

目的 探讨矿化液对人牙髓干细胞(DPSCs)生长特性的影响.方法 用含一定浓度的β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松的矿化液诱导人牙髓干细胞,通过倒置相差显微镜、透射电镜、免疫细胞化学染色、von Kossa染色方法,观察和检测矿化液诱导后细胞形态、超微结构、表型和矿化基质分泌的变化,以未诱导组为对照.结果 矿化液连续培养7d,人DPSCs细胞形态明显改变,呈牙本质样极化细胞表现,另一侧为增大的胞体;超微结构显示,诱导后的细胞体积增大,核浆比例下降,胞浆细胞器丰富;诱导前细胞不表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨钙素(OC),诱导后均表达;连续培养21d,诱导组细胞形成多个矿化结节.结论 矿化液能诱导人DPSCs向成牙本质细胞样细胞分化并产生矿化基质.本研究从细胞水平上揭示了人DPSCs向成牙本质细胞分化机理,为人DPSCs应用于牙髓损伤的修复再生提供了依据.     

人牙髓干细胞在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的实验研究

目的：探讨矿化液诱导条件下人牙髓干细胞( human dental pulp stem cells,HDPSCs)在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的潜力。方法将HDPSCs接种于钛金属板表面,于第3、7d时观察其增殖状态。将HDPSCs接种于钛金属板表面进行矿化液诱导,于诱导的第0、3、5、7、14、21、28d时,采用RT-PCR检测其牙本质涎磷蛋白( DSPP)、碱性磷酸酶( ALP)、骨涎蛋白( BSP)和骨钙素( OCN)的基因表达。 Western印迹分析、免疫荧光检测BSP及OCN蛋白表达。对照组为矿化液诱导培养皿中的HDPSCs,检测指标、方法基本相同,免疫细胞化学染色检测OCN蛋白表达。结果钛金属板上 HDPSCs增殖迅速,表现出良好的生物相容性。两组细胞均自诱导第3天ALPmRNA呈高表达、DSPP始终不表达。培养皿组BSP、OCNmRNA于第5天开始表达,并随时间延长而表达增高;钛金属组BSP、OCNmRNA表达于第14天出现第一峰值,随后有所下降,28天再次升高。两组BSP蛋白表达趋势与其RT-PCR结果一致,第5天 OCN染色阳性。结论钛金属表面 HDPSCs 经矿化液诱导向成骨细胞样细胞分化。     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙髓细胞增殖和迁移的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）对体外培养人牙髓细胞增殖、迁移活性的影响。方法以常规组织块培养法体外获得人牙髓细胞,实验组分别加入终浓度为1.0、5.0、10.0和50.0ng/ml的bFGF,对照组仅加入等量的空白培养基,采用CCK-8法分别测定450nm下各组光吸收度A值,研究bFGF对牙髓细胞增殖活性的影响;应用Transwell小室培养法,研究bFGF对牙髓细胞迁移活性的影响。结果与对照组相比,bFGF在1.0～50.0ng/ml浓度下可促进牙髓细胞的增殖（P〈0.05）,bFGF最低显效浓度为1.0ng/ml,最佳显效浓度为10.0ng/ml。bFGF在1.0～50.0ng/ml浓度下诱导细胞迁移（P〈0.05）。结论 bFGF可诱导体外培养人牙髓细胞的增殖和迁移,在牙髓牙本质复合体修复中可能发挥重要作用。     

dNCPs、TGF-β1及联合应用对人牙髓成纤维细胞增殖、ALP及矿化的影响

目的 :观察牙本质非胶原蛋白 (dentinnon collageproteins ;dNCPs)、转化生长因子 (transforminggrowthfactor ;TGF β1)及联合应用对人牙髓成纤维细胞生物学特性的影响。 方法 :利用混合酶消化法成功培养了人牙髓成纤维细胞 ,角蛋白及波形丝蛋白鉴定其来源。在细胞中分别加入牙本质粉、dNCPs、TGF β1及其复合物 ,通过MTT、ALPase和Von Kossa染色检测其作用。 结果 :dNCPs和TGF β1可显著增加细胞的增殖及ALPase分泌 ,细胞可聚集成团形成矿化结节。 结论 :dNCPs和TGF β1可改变人牙髓成纤维细胞的生物学活性 ,但两者间无相互促进作用。     

Functional and molecular characterization of transmembrane intracellular pH regulators in human dental pulp stem cells

ObjectiveHomeostasis of intracellular pH (pH_i) plays vital roles in many cell functions, such as proliferation, apoptosis, differentiation and metastasis. Thus far, Na⁺-H⁺ exchanger (NHE), Na⁺-HCO₃⁻ co-transporter (NBC), Cl⁻/HCO₃⁻ exchanger (AE) and Cl⁻/OH⁻ exchanger (CHE) have been identified to co-regulate pH_i homeostasis. However, functional and biological pH_i-regulators in human dental pulp stem cells (hDPSCs) have yet to be identified.DesignMicrospectrofluorimetry technique with pH-sensitive fluorescent dye, BCECF, was used to detect pH_i changes. NH₄Cl and Na⁺-acetate pre-pulse were used to induce intracellular acidosis and alkalosis, respectively. Isoforms of pH_i-regulators were detected by Western blot technique.ResultsThe resting pH_i was no significant difference between that in HEPES-buffered (nominal HCO₃⁻-free) solution or CO₂/HCO₃-buffered system (7.42 and 7.46, respectively). The pH_i recovery following the induced-intracellular acidosis was blocked completely by removing [Na⁺]_o, while only slowed (−63%) by adding HOE694 (a NHE1 specific inhibitor) in HEPES-buffered solution. The pH_i recovery was inhibited entirely by removing [Na⁺]_o, while adding HOE 694 pulse DIDS (an anion-transporter inhibitor) only slowed (−55%) the acid extrusion. Both in HEPES-buffered and CO₂/HCO₃-buffered system solution, the pH_i recovery after induced-intracellular alkalosis was entirely blocked by removing [Cl⁻]_o. Western blot analysis showed the isoforms of pH_i regulators, including NHE1/2, NBCe1/n1, AE1/2/3/4 and CHE in the hDPSCs.ConclusionsWe demonstrate for the first time that resting pH_i is significantly higher than 7.2 and meditates functionally by two Na⁺-dependent acid extruders (NHE and NBC), two Cl⁻-dependent acid loaders (CHE and AE) and one Na⁺-independent acid extruder(s) in hDPSCs. These findings provide novel insight for basic and clinical treatment of dentistry.