经典Wnt信号通路在牙周膜细胞成骨分化过程中的调控

目的: 探讨经典Wnt/β-catenin信号通路对牙周膜混合细胞群成骨分化过程中的调控作用。方法: 体外组织块结合酶消化法培养牙周膜混合细胞群,通过RT-PCR、real-time PCR证实经典Wnt信号通路在牙周膜细胞中的表达,并运用细胞免疫荧光分析检测了β-catenin的表达位置及表达量;通过不同浓度的Licl激活牙周膜细胞中经典Wnt信号通路,并进行相应的诱导培养。培养14 d后,茜素红染色观察矿化结节形成情况,碱性磷酸酶活性检测ALP活性;通过CCK-8检测Licl刺激24 h、48 h、72 h后经典Wnt信号通路对牙周膜细胞增殖的影响。以单因素重复测量方差分析比较差异。结果: 经典Wnt/β-catenin信号通路在牙周膜混合细胞群中明显表达,可以通过Licl激活该信号通路,使β-catenin在细胞中累积引起下游变化;与对照组相比较,经典Wnt/β-catenin信号通路的激活引起牙周膜细胞矿化过程中矿化结节的减少,显著降低了ALP活性(P<0.01);经典Wnt通路对牙周膜混合细胞群增殖表现为显著的抑制作用(P<0.01)。结论: 经典Wnt/β-catenin信号通路抑制了牙周膜混合细胞群的矿化成骨过程,并抑制该细胞群的增殖。     

Wnt／β-catenin信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞牵张中的表达

目的：了解经典Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞（BMSCs）加载牵张中的作用。方法：分离培养大鼠BMSCs,通过自行研制的细胞加载装置．对BMSCs施加机械张应力刺激。用实时荧光定量RT—PCR与Western印迹检测Wnt3A、B—catenin与Lef-1的表达,同时检测BMSCs细胞增殖及骨向分化转录因子Runx2与成骨因子碱性磷酸酶（ALP）的变化情况。所得数据应用SPSS19．0软件包进行配对￡检验。结果：在牵张力刺激下,经典Wnt信号通路的3个关键分子Wnt3A、β-atenin与IJef_因表达显著增强（P〈0．05）。BMSCs的增殖、Runx2表达以及ALP活性也在加力后增强（P〈0．05）。结论：张应力加载激活了经典Wnt信号通路．并刺激BMSCs增殖与骨向分化,提示Wnt／β-catenin参与了牵张成骨的分子调控过程。     

Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的药物性牙龈增生中的表达

目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的药物性增生的牙龈组织中的表达.方法:选择正常牙龈对照组、(未服药)高血压牙龈增生组、硝苯地平引起的药物性牙龈增生组各10例,用Western-Blot和RT-PCR检测牙龈组织中Wnt1、β-catenin的表达.结果:药物性牙龈增生组的牙龈组织中Wnt1、β-catenin蛋白及mRNA表达水平显著高于正常牙龈对照组(P＜0.05)和高血压牙龈增生组(P＜0.05).结论:硝苯地平引起的药物性牙龈增生的牙龈组织中Wnt1、β-catenin表达水平增高,可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙龈成纤维细胞的增殖导致牙龈纤维化.     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化过程中的Wnt经典信号通路研究

目的 探讨Wnt经典通路相关因子Dickkopf蛋白1（DKK-1）、β-链蛋白（β-catenin）在糖基化终末产物（AGEs）介导的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）骨分化过程中的变化。方法 通过体外组织块法和有限稀释法克隆化培养获取hPDLSCs,实验分两组：正常hPDLSCs组（N-hPDLSCs组）和AGEs刺激的正常hPDLSCs组（A-hPDLSCs组）。对2组细胞成骨矿化诱导后行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色;实时聚合酶链反应（real time PCR）检测成骨基因,以及Wnt经典通路中相关因子DKK-1、β-catenin;Western blot检测相关成骨蛋白、细胞核蛋白β-catenin。结果 成骨诱导后,A-hPDLSCs组ALP染色明显浅于N-hPDLSCs组;茜素红染色A-hPDLSCs组钙化结节少于N-hPDLSCs组;real time PCR与Western blot的结果显示A-hPDLSCs组BSP、ALP、Runx-2的表达都较低,差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt经典信号通路中相关因子：A-hPDLSCs组β-catenin表达高于N-hPDLSCs组,A-hPDLSCs组DKK-1表达明显低于N-hPDLSCs组,并且Weston blot显示A-hPDLSCs组核蛋白β-catenin的表达高于N-hPDLSCs组。结论AGEs可以使hPDLSCs骨向分化过程中Wnt经典通路的抑制因子DKK-1下调,细胞核中的β-catenin表达升高,激活了Wnt经典通路,并且抑制了骨分化。     

DZIP1通过影响Wnt/β-catenin信号通路促进口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭

目的 探究DZIP1通过Wnt/β-catenin信号通路对口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响.方法 实时荧光定量PCR和Western blot检测DZIP1和Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA表达和蛋白表达,CCK-8检测细胞活力,克隆形成实验检测口腔鳞状细胞癌(oral squamous cel...     

腮腺多形性腺瘤及其恶变中β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1的表达

目的：检测正常腮腺组织、腮腺多形性腺瘤（Pleomorphicadenoma,PA）和癌在多形性腺瘤中（Carcinomainpleomorphicadenoma,CPA）β-连环蛋白（B—catenin）和细胞周期蛋白D1（CyclinDD的表达情况,探讨β-catenin、CyclinDl在腮腺多形性腺瘤发生、复发及恶变中的可能作用。方法：用免疫组化s—P法结合计算机图像分析技术检测10例正常腮腺组织、10例腮腺多形性腺瘤、10例腮腺多形性腺瘤瘤旁组织、15例腮腺多形性腺瘤复发、11例癌在多形性腺瘤中β-catenin及CyclinDl的表达情况。结果：β-catenin在10例正常腮腺组织中均呈正常表达,而CyclinDl表达均呈阴性;,β-catenin、CyclinD1在腮腺PA瘤旁组织、PA、PA复发、CPA组织中的表达率及表达水平逐渐升高,且CPA组与其它各组相比均有显著性差异。结论：腮腺PA、CPA中均存在β-catenin异常表达和CyclinDl的过表达,提示β-catenin的异常表达激活CyclinD1引起细胞增殖和分化失控,在腮腺PA及CPA发生中可能具有一定作用。     

张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞Runx2表达调控的体外研究

目的 研究张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞Runx2表达的调控。方法 以成牙骨质细胞样细胞OCCM30为研究对象,应用FX4000T应力加载装置对其加载张应力,时间为0、3、6、12 h,然后分别使用不同质量浓度的Dikkopf-1（DKK1）处理48 h,采用Western blot法检测β-catenin蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-PCR）检测Runx2 mRNA的表达水平。选取最佳作用时间点（12 h）和最佳阻断剂质量浓度（150 ng•mL-1）,将样本分为A、B、C、D共4组,A组不加力不加阻断剂,B组加力加阻断剂,C组加力不加阻断剂,D组不加力加阻断剂,测量β-catenin蛋白和Runx2 mRNA的表达水平。结果 1）张应力加载3、6、12 h后,Runx2 mRNA表达水平和β-catenin蛋白水平与对照组相比均明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2）不同质量浓度DKK1处理后,细胞内Runx2 mRNA的表达量呈下降趋势。3）未加载张应力的情况下,DKK1明显抑制了β-catenin蛋白的表达,Wnt/β-catenin通路被抑制;加载张应力情况下,DKK1处理组β-catenin蛋白表达低于未加DKK1处理组;不加阻断剂的情况下,张应力刺激增强了β-catenin蛋白的表达;阻断剂作用后,应力刺激组β-catenin蛋白表达相对较高。结论 机械应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路可正向调控成牙骨质细胞Runx2基因的表达。     

糖基化终末产物对牙周膜干细胞增殖及其Wnt经典信号通路相关基因表达的影响

目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)增殖及其Wnt经典信号通路相关基因DKK-1、β-catenin表达的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养HPDLSC,并与100μg/mL AGEs共同培养,通过细胞克隆形成率、细胞生长曲线观察AGEs对HPDLSC增殖能力的影响;RT-PCR和Western Blot检测实验组和对照组DKK-1、β-catenin mRNA以及核蛋白β-catenin的表达量。结果:经100μg/mL AGEs刺激的HPDLSC,其克隆形成率、增殖速度以及β-catenin mRNA和核蛋白β-catenin的表达量均明显低于对照组(P<0.05);而DKK-1 mRNA则明显高于对照组(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的增殖及其Wnt经典信号通路。     

静态张应力作用下人牙周膜成纤维细胞β-catenin和Wnt3a蛋白的表达

目的:研究人牙周膜成纤维细胞在不同大小机械张应力作用下Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Wnt3a蛋白的表达变化。方法:运用酶解组织块法体外培养人牙周膜成纤维细胞,将细胞按加力时间的不同(2 h、4 h、6 h)分为3组,每组再按形变率不同将其分为8%、12%和16%3个亚组,并取加力时间0h、形变率0%作为对照组。用western blot技术检测细胞在不同时间点和不同形变率作用下Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Wnt3a蛋白的表达变化。结果:Western blot结果显示,人牙周膜成纤维细胞在机械力加载后β-catenin 和Wnt3a蛋白表达显著减少(P<0.05)。在加力时间相同的组内(2 h、4 h、6 h),β-catenin 和Wnt3a蛋白表达随着形变率的增大而逐渐减少(P<0.05)。结论:β-catenin和 Wnt3a参与了静态张应力作用下牙周膜成纤维细胞的代谢,机械力对牙周膜成纤维细胞中Wnt/β-catenin信号通路有抑制作用。     

TNF-α刺激下牙周膜干细胞与CD3+T细胞共培养对Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:探讨炎症条件下牙周膜干细胞与CD3⁺T细胞共培养对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:拔除健康前磨牙及第三磨牙,获取健康牙周膜干细胞(H-PDLSCs);人外源性TNF-α炎症因子10ng/mL刺激PDLSCs(I-PDLSCs)。免疫荧光染色检测H/I-PDLSCs Wnt通路蛋白β-catenin和LEF-1的表达。采用免疫磁珠法获取人的CD3⁺T细胞。H/I-PDLSCs与CD3⁺T细胞分别以1∶10,1∶20,1∶50,1∶100共培养,共培养48h,提取各组PDLSCs的RNA,反转录为c DNA后,qPCR检测β-catenin、LEF1、TCF4的基因表达;以上述比例共培养后收集各组细胞进行流式细胞仪细胞周期检测。结果:免疫荧光检测I-PDLSCs组β-catenin、LEF-1的表达强于H-PDLSCs组。共培养比例为1∶20和1∶50时,H-PDLSCs组β-catenin、LEF1的mRNA表达水平均降低;1∶20时TCF4 mRNA的表达水平增加,1∶50时降低。1∶20时,I-PDLSCs组β-catenin、LEF1的mRNA表达水平均增加,而在1∶50时基因的表达水平均降低。1∶20及1∶50时TCF4的表达水平均降低。H-PDLSCs与CD3⁺T细胞共培养比例为1∶10时与H-PDLSCs对照组相比其增殖指数显著提高;1∶20、1∶50及1∶100时其PI指数显著降低。I-PDLSCs与CD3⁺T细胞共培养比例为1∶10、1∶50及1∶100时与I-PDLSCs对照组相比其增殖指数显著降低(P<0.05)。结论:炎症条件可激活牙周膜干细胞的Wnt/β-catenin信号通路,H/I-PDLSCs与CD3⁺T细胞以1∶20、1∶50可稳定的下调Wnt/β-catenin经典信号通路,证实Wnt通路参与炎症条件下PDLSCs的免疫调节。     

富血小板纤维蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化的研究

目的 :研究富血小板纤维蛋白(PRF)通过Wnt/β-catenin信号通路对骨髓基质干细胞(BMSCs)分化的影响。方法:分离、培养原代兔BMSCs,取第三代细胞进行干细胞鉴定,收集同一只兔耳缘静脉血离心制备PRF,将PRF与BMSCs置于Transwell小室中共培养并进行成骨分化。实验分组:A组为单纯BMSCs对照组;B组为PRF与BMSCs共培养组;C组为加入DKK1的PRF与BMSCs共培养组;D组为加入Wnt3a的PRF与BMSCs共培养组。茜素红染色观察各组钙结节形成情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测各组ALP活性,定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测成骨成脂相关基因Runx2、OCN、PPARγ2及LPL的m RNA表达,同时检测Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达。结果:流式细术检测结果显示,原代培养的BMSCs符合间充质干细胞鉴定标准。茜素红染色结果显示,B组和D组的钙结节数量明显多于A组和C组,A组和C组之间无明显差异。碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果显示,B组与D组的ALP活性较A组和C组明显增加(P<0.05),且两组之间差异无明显统计学意义。q RTPCR结果显示B组与D组中的成骨分化标志基因Runx2、OCN的m RNA表达,较A组和C组显著增加(P<0.05),而成脂分化标志基因PPARγ2、LPL的m RNA表达显著降低(P<0.05)。此外,B组和D组中Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达较A组和C组显著增加(P<0.05)。结论:PRF通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化而抑制其成脂分化。     

Lnc RNA KCNQ1OT1靶向miR-506-3p调控舌鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的探讨长链非编码RNA(Lnc RNA)KCNQ1OT1通过靶向调控miR-506-3p对舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinomas,TSCC)细胞增殖、侵袭和迁移作用机制。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测正常牙龈上皮细胞(human gingival epithelial cells,HGE)及TSCC细胞(CAL27、SCC9和SCC15细胞系)中KCNQ1OT1和miR-506-3p表达水平。以CAL27细胞为研究对象,构建KCNQ1OT1低表达或miR-506-3p高表达的CAL27细胞,四甲基噻唑蓝染色法(MTT)检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭,蛋白印迹(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9和β-连环蛋白(β-catenin)表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证KCNQ1OT1与miR-506-3p调控关系。结果与HGE细胞比较,TSCC细胞系CAL27、SCC9和SCC15中KCNQ1OT1表达升高(P<0.05),miR-506-3p表达降低(P<0.05)。KCNQ1OT1低表达或miR-506-3p高表达后,CAL27细胞存活率、迁移和侵袭细胞数及CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达降低(P<0.05)。KCNQ1OT1低表达还降低了CAL27细胞中β-catenin蛋白表达(P<0.05)。miR-506-3p低表达降低了KCNQ1OT1低表达对CAL27细胞存活率、迁移和侵袭细胞数及CyclinD1、MMP2、MMP9和β-catenin蛋白表达的影响(P<0.05)。结论KCNQ1OT1低表达可抑制TSCC细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制与上调miR-506-3p表达和抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

流体剪切力作用下喷砂酸碱处理钛表面对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白mRNA表达的影响

目的探讨流体剪切力及喷砂酸碱处理钛表面在不同时相对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响。方法制备抛光处理纯钛钛片(P组)、喷砂酸碱处理纯钛钛片(S组),取新生第一天SD大鼠颅骨进行原代成骨细胞培养并分别接种于玻片(G组)、P组钛片、S组钛片表面,培养72h后,置于流体加载系统中,在0dynes/cm2(静止组)和12dynes/cm2(受力组)大小的流体剪切力下分别作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h,通过实时荧光定量聚合酶链反应检测低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low-density lipoprotein receptor-relat-ed protein5,LRP5)和β-连环蛋白(β-catenin)的mRNA表达变化。结果 3种表面受力组LRP5和β-catenin的mRNA表达水平均比静止组高(P<0.05)。LRP5的mRNA表达水平在S组最高(P<0.05);细胞受力时G组在1h、P组和S组在0.5h时LRP5的mRNA表达量达到最高峰。β-catenin的mRNA表达水平在S组最高(P<0.05);细胞受力时表达量最高峰在3种表面均出现在0.5h。结论适宜大小的流体剪切力以及喷砂酸碱处理钛表面均能促进成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活,并且喷砂-酸碱处理钛表面提高了成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路对流体剪切力刺激的敏感性。     

10％纳米羟基磷灰石聚醚醚酮浸提液培养成骨细胞（MG63）Wnt3a／β－catenin信号通路的表达

目的：研究10％纳米羟基磷灰石聚醚醚酮（10％ HA／SPEEK／PEEK）复合材料浸提液培养MG63细胞后Wnt3a／β－catenin信号通路中特征性蛋白的变化,评价复合材料的生物相容性。方法：Wnt3a持续作用于10％HA／SPEEK／PEEK浸提液培养的MG63细胞。应用免疫荧光染色技术,定性检测Wnt信号通路中β－catenin蛋白的存在。应用Western－Blotting技术相对定量检测β－catenin蛋白的多少。应用实时定量PCR技术相对定量检测信号通路下游基因c－myc、cyclinD1的表达情况。结果：免疫荧光染色和Western－Blotting实验结果显示,Wnt3a作用于10％HA／SPEEK／PEEK浸提液中培养的MG63细胞,β－catenin蛋白绿色深染,位于细胞核中,表达量显著增加。实时定量RT－PCR实验结果显示Wnt3 a作用于10％HA／SPEEK／PEEK浸提液中培养的MG63细胞,信号通路的下游靶向基因c－myc、cyclinD1表达显著增加,Wnt通路开放。结论：10％HA／SPEEK／PEEK对MG63细胞有良好的成骨作用,可以指导临床实验研究。