RT—PCR方法检测非神经元,类神经元,神经元细胞系中淀粉样前 …

目的与方法 根据人淀粉样前体蛋白（ａｍｙｏｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ,ＡＰＰ）基因ｃＤＮＡ序列设计的引物,提取总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测非神经,类神经及神经细胞系ＡＰＰ基因的表达。结果 利用专门设计的引物不能检测野生型ＣＯＳ－７细胞中,ＡＰＰ基因的表达,但可以检测转染人ＡＰＰ基因的非神经元类ＣＯＳ－７细胞类神经元的野生型ＰＣ１２及人神经母细胞瘤细胞,ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞中ＡＰＰ     

GDNF cDNA在神经及非神经细胞系中的表达

研究重组ＧＤＮＦｃＤＮＡ在神经及非神经细胞系中的表达。方法；重组克隆，基因转染及ＲＴ－ＰＣＲ。结果；ＣＶ１及ＳＨ－ＳＹ－５Ｙ细胞中无ＧＤＮＦ内源性表达，转基因后出现ＧＤＮＦ表达条带。ＮＧ１０８－１５细胞有ＧＤＮＦ的内源性表达，转基因后表达条带增强。结论：重组ＧＤＮＦＣＤＮＡ在神经及非神经细胞系中均有较强表达，提示以此制备的工程细胞在Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ‘ｓ病基因治疗中可能具有重要作用。     

急性髓系白血病H-ras、凋亡及多药耐药的研究

目的研究急性髓系白血病（ＡＭＬ）Ｈｒａｓ／Ｐ２１、抗凋亡基因（ｂｃｌ２）、细胞凋亡与多药耐药基因（ｍｄｒ１／Ｐｇｐ）对疗效的影响,并证实流式细胞术（ＦＣＭ）检测Ｐｇｐ和逆转录多聚酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测ｍｄｒ１ｍＲＮＡ间的相关。方法用ＦＣＭ检测８５例初治ＡＭＬ患者的Ｈｒａｓ／Ｐ２１、ｂｃｌ２、细胞凋亡和ｍｄｒ１产物Ｐｇｐ的表达;用ＲＴＰＣＲ检测其中４７例的ｍｄｒ１／ｍＲＮＡ。结果Ｐ２１＋／Ｐｇｐ＋者完全缓解（ＣＲ）率明显低于Ｐ２１－／Ｐｇｐ－者（分别为５８．１％和１００％,Ｐ＜０．０２５）,高ｂｃｌ２／Ｐｇｐ＋的ＣＲ率明显低于低ｂｃｌ２／Ｐｇｐ－者（分别为６０％和９６．３％,Ｐ＜０．００５）。Ｐｇｐ＋３１例中２９例ｍｄｒ１ｍＲＮＡ阳性,Ｐｇｐ－１６例中仅２例ｍｄｒ１ｍＲＮＡ阳性。结论Ｐｇｐ＋同时Ｐ２１＋、高ｂｃｌ２者ＣＲ低,ＦＣＭ检测Ｐｇｐ和ＲＴＰＣＲ检测ｍｄｒ１ｍＲＮＡ相关性良好     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究：Ⅰ.具有？…

目的：检测反转录病毒介导的脑肿瘤基因治疗中具有复制能力野生型反转录病毒（ＲＣＲ）。方法．；ＲＣＲ检测主要方法有：ＤＮＡ聚合酶链式反应（ＰＣＲ），反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交以及ｎｅｏ基因和ｌａｃＺ基因的补救分析。结果：建立了ＰＣＲ的检测系统，从ＤＮＡ水平、ＲＮＡ水平和病毒活体水平对产ＨＳＶ＿ＴＫ病毒我装细胞（ＴＫ／ＶＰＣ），Ｃ６转ＴＫ基因细胞和实验动物血液可能存在的ＲＣＲ野生型     

人血小板生成素cDNA转染及表达产物对实验性血小板减少症的…

目的 探讨将人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞中及表达产物对实验性小鼠血小板减少症（卡铂诱导）的治疗作用。方法 以哺乳动物表达载体ＰＣＩｎｅｏ为运载体，构建受控于ＳＶ４０早期启动子ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ的表达载体，利用脂质体介导转染技术，将重组ＰＣＩｎｅｏ－ｈＴＰＯ表达载体转染ＣＯＳ－７细胞中，经Ｇ４１８作用后，对挑选阳性克隆ＣＯＳ－７细胞中ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和ｍＲＮＡ分别进行ＰＣＲ     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在CHO细胞中的表达

克隆造血干细胞因子并在ＣＨＯ细胞中表达。方法：采用ＰＣＲ方法从ｐＲＣ／ＣＭＶ（含ＳＣＦｃＤＮＡ）中钓取ＳＣＦｃＤＮＡ膜外段活性区，克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，转染入ＣＨＯ细胞；用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｍＲＮＡ水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

慢性粒细胞白血病反义核酸基因治疗的实验研究

目的单独应用ｂｃｒ－ａｂｌ反义硫代磷酸寡聚脱氧核糖核酸（ＡＳＰＯ）或ｃ－ｍｙｂＡＳＰＯ作用于慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）细胞的研究已有报道，但抑制的不彻底性是个主要问题。由于ＣＭＬ的发生是多癌基因协同作用及相互影响的结果，为进一步提高ＡＳ－ＰＯ对ＣＭＬ细胞的作用效果，用互补于两种类型（ｂ２ａ２及ｂ３ａ２）的ｂｃｒ－ａｂｌ基因融合位点两侧各１３个核苷酸的ＡＳＰＯ（ｂ２ＡＳＰＯ和ｂ３ＡＳＰＯ）及ｃ－ｍｙｂ基因起始密码子２－７互补的ＡＳＰＯ（ｍＡＳＰＯ）联合作用于Ｋ５６２细胞株和原代ＣＭＬ细胞。方法硫代磷酸寡核基酸（ＰＳ－ＯＤＮ）的合成由３９２－０５型ＤＮＡ－ＲＮＡ合成仪自动合成，经ＯＰＣ柱纯化；细胞与ＰＳ－ＯＤＮ共培养后２４，４８，９６，１２０ｈ倒置显微镜下活体观察，０．４％台盼蓝拒染法进行死活细胞计数；ＣＦＵ－Ｋ５６２、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ采用０．８％甲基纤维素半固体培养法；采用两对引物ＲＴ－ＰＣＲ半定量法检测细胞ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ表达；通过流式细胞仪检测及电镜观察细胞凋亡情况。结果（１）ＡＳＰＯ能够特异性抑制ｂｃｒ－ａｂｌ基因表达；经ＲＴ－ＰＣＲ的检测发现１０μｍｏｌＡＳＰＯ作用４８ｈ，两种反义     

结肠癌中p73基因改变的意义

研究Ｐ７３基因在结肠癌中的改变及其意义,方法采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法检测４０例结肠癌及其癌帝非癌组织中Ｐ７３基因突变,采用定量ＲＴ－ＣＲ方法检测Ｐ７３基因的表达。结果①ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测出７例存在Ｐ７３等位基因缺失,未见突变;②定量ＲＴ－ＰＣＲ检测出３３例结肠癌呈高表达,７例呈中等表达,非癌列呈低水平表达。     

噬菌体抗体库技术构建HPV16 E7人源化单克隆抗体

目的：构建抗ＨＰＶ１６Ｅ７的噬菌体抗体库。方法：由感染者抗凝血中分离外周淋巴细胞，提取细胞总ＲＮＡ，以逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ），用人ＩｇＧ　Ｆａｂ基因特异引物，从合成的ｃＤＮＡ中分别扩增出抗体轻链和重链可变区基因，回收纯化ＰＣＲ产物。用ＳｐｅＩ＋ＸｈｏＩ酶切重链可变区基因，ＸｂａＩ＋ＳａｃＩ酶切轻链可变区基因，先后克隆入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３。结果：ＰＣＲ产物经电泳证实分子量大小正确，酶切电泳证实质粒构建正确。结论：成功构建抗体轻链和重链基因克隆，建立抗ＨＰＶ１６Ｅ７噬菌体抗体库。     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。     

人COX6B1在哺乳动物细胞株中转染表达与定位的初步研究

目的构建带FLAG标签的人野生型细胞色素氧化酶亚基COX6B1表达载体,转染至HEK 293T、COS7细胞观察COX6B1蛋白在细胞内表达与定位。方法以含人COX6B1全长cDNA序列的质粒为模板,通过上游带有FLAG标签的引物,PCR方法扩增出COX6B1全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3.1中构建pCDNA3.1-FLAG-COX6B1表达载体。将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了pCD-NA3.1-FLAG-COX6B1表达载体,其在HEK 293T细胞中能有效地表达;在COS7细胞中呈斑点状分布,且主要在胞质内分布,细胞核中未见其明显表达。结论 COX6B1在HEK293T、COS7细胞中均有表达,且主要分布在胞质内,这为进一步了解COX6B1的功能提供了一定的基础。     

抗肾细胞癌异种化G250抗原基因疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人肾细胞癌特异性抗原G250主要T细胞表位区域、猴和鼠G250部分片段区域融合基因tG250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中表达。方法：通过基因合成和PCR技术构建人、猴和鼠G250区域融合基因tG250,将其插入含有人IgK链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI-FC-GPI中;将重组质粒pCI-Fe-tG250-GPI转染COS7细胞,流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果：tG250融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pCl-Fc-tG250-GPI中;流式细胞仪和免疫荧光检测显示,重组质粒pCI-Fe-tG250-GPI在COS7细胞中得到很好的表达。结论：成功构建了重组质粒pCI-Fe-tG250-GPI,且在COS7细胞中可以有效表达,为以G250抗原为靶点基因疫苗的后续功能研究打下良好基础。     

孕酮诱导的蜕膜蛋白Depp在哺乳细胞株的转染表达与定位

目的 将孕酮诱导的蜕膜蛋白Depp基因构建到pCDGFP表达载体中,分析其在哺乳细胞株中的表达和定位情况.方法 用PCR方法扩增Depp全长序列,插入真核表达载体pCDGFP中,将构建好的质粒转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位;转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,利用GFP抗体进行Western bl...     

不同转移潜能人肺癌细胞系KAI1基因的表达

目的:探讨KAI1基因与人肺癌细胞系转移潜能的关系.方法:利用逆转录-PCR和Northern blot杂交法分析不同转移潜能人肺癌细胞系中KAI1 mRNA的表达,并用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测与突变的关系.结果:在高转移潜能细胞系PG中KAI1 mRNA表达降低,在无转移潜能的PAa细胞中KAI1的表达量比PG细胞高10倍以上(积分光密度比值分别为0.7313和0.0549).PCR-SSCP结果显示在PG细胞KAI1基因第7外显子出现异常改变.结论:肺癌细胞的转移潜能可能与KAI1基因表达量有关,KAI1基因的低表达可能由基因突变所致.     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

小鼠4-1BBLcDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆小鼠4-1 BBL基因，构建其真核表达载体，并观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：取C57BL/6小鼠脾细胞，经PHA诱导后，以RT-PCR克隆4-1 BBLcDNA，测序，构建pCDNA3．1( )-m4-1BBL真核表达质粒，转染COS-7细胞，RT-PCR检测m4-1BBLmRNA表达，间接免疫荧光法和流式细胞仪检测4-1 BBL蛋白的表达，结果：从小鼠脾细胞中克隆到m4-1 BBL cDNA，经测序完全正确，所构建的m4-1BBL质粒在COS-7细胞中获得高效表达。结论：小鼠4-1BBLcDNA基因克隆、真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的：构建人骨骼肌TnI-fast基因分泌型真核表达载体，为利用TnI-fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法：采用PCR和RT－PCR制备TnI-fast cDNA，构建TnI-fast基因克隆质粒，测序证实后将TnI-fast cDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI-fast基因重组表达质粒转染COS－1细胞，检测TnI-fast基因体外表达。结果：DNA测序证实，我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI-fas cDNA序列与NCBIGenebank TnI-fast cDNA序列完全一致。ELISA检测证实，TnI-fast/pSec Tag2 B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论：本研究成功地构建了TnI-fast基因重组表达质粒，可进一步用于抗肿瘤血管生成基因治疗动物实验。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ