p62Dok PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的：制备p62DokPTB结构域的GST融合蛋白。方法：用PCR方法扩增编码p62Dok PTB结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL－21,构建成表达GST－PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后,经Glutathion-Sepharose 4B亲和层析柱纯化,用SDS－PAGE进行分析,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的25％。结果：获得重组GST－PTB融合蛋白,纯度在95％以上,产物得率约75％。结论：成功制备高纯度p62DokPTB结构域的GST融合蛋白,为进一步研究p62DokPTB结构域的结构和生物学功能奠定了基础。     

Dok4和Dok5 PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的 :制备Dok4和Dok5PTB结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法分别扩增编码Dok4、Dok5PTB结构域的cDNA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化 ,用SDS PAGE进行分析 ,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的 2 5 %。结果 :获得重组的GST 4PTB和GST 5PTB融合蛋白 ,纯度在 95 %以上 ,产物得率约 75 %。结论 :成功制备高纯度Dok4和Dok5PTB结构域的GST融合蛋白 ,为进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域 (PTB)的结构和生物学功能奠定基础     

表皮生长因子受体与Dok1 PTB结构域结合关键位点的确定

目的:确定表皮生长因子受体(EGFR)与Dok1 PTB结构域结合的关键氨基酸残基位点.方法:合成包含磷酸化的酪氨酸残基的EGFR胞内域的5个小肽片段,利用谷胱苷肽S转移酶共沉淀技术确定能够抑制Dok1 PTB结构域与激活的EGFR结合的小肽.结果:pY1086或pY1148小肽能抑制激活的EGFR与Dok1 PTB结构域的结合.结论:pY1086和pY1148是激活的EGFR与Dok1 PTB结构域结合的关键位点.     

Cortactin功能性结构域GST融合蛋白的表达和纯化

目的:制备cortactin功能性结构域(NTA和ABR)GST融合蛋白,用于后续研究NTA和ABR多肽分子对肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响。方法:通过从cortactin基因cDNA克隆中扩增获得cortactin功能性结构域(NTA和ABR片段),经双酶切和连接后将其分别插入载体pGEX-4T-2中获得重组质粒。将重组质粒转化入感受态菌,诱导表达,蛋白粗提后纯化。结果:PCR扩增后获得和预期一致的cortactin功能性结构域(NTA和ABR片段),通过测序证实该两片段正确插入表达载体。纯化的蛋白作SDS-PAGE电泳,证实蛋白的完整性和纯度良好。结论:成功地获得cortactin功能性结构域(NTA和ABR)GST融合蛋白。     

Doks PTB结构域与EGFR特异性结合

目的:探讨Doks家族的PTB结构域在识别上游分子时的特异性.方法:利用裂解大量内源性表达表皮生长因子受体(EGFR)的COS-7传代细胞株获取EGFR,利用大肠杆菌表达GST融合蛋白GST1PTB、GST4PTB和GST5PTB,采用GST共沉淀技术检测Dok1、4和5的PTB结构域能否与EGFR结合.结果:Dok1的PTB结构域,而非Dok4和Dok5的PTB结构域,能够特异性地与被激活的EGFR结合,不能与未激活的EGFR结合.结论:Doks家族的PTB结构域功能有差别,即PTB结构域在识别上游分子时具有特异性.     

喉癌组织中自噬相关蛋白p62的表达及意义

目的:探讨自噬相关蛋白p62在喉癌组织中的表达及临床意义.方法:选取2010年1月 ～2015年4月于福建省肿瘤医院行喉癌根治性切除术的115例患者为研究对象,采用免疫组化检测喉癌组织及癌旁正常组织石蜡标本p62蛋白表达水平,并分析与临床病理特征及预后的关系.采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Wes...     

BCR/ABL-OD结构域重组蛋白的表达和纯化

目的：制备BCR／ABL-0D结构域-HIS的重组蛋白．方法：用RT-PCR方法扩增BCR／ABL-0D结构域的基因片段,测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中,并进行酶切鉴定,鉴定正确后转化大肠杆菌B121,构建表达His-OD融合蛋白的菌株．经IPTG诱导表达后,镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化,用SDS-PAGE对该融合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析．结果：获得了His-OD重组融合蛋白,纯度在95%以上,产物得率约75％．结论：成功制备高纯度His-OD融合蛋白,为进一步研究OD结构域的生物学功能奠定了基础。     

衔接蛋白p66Shc CH2结构域分泌表达载体的构建及其表达

目的:构建可以产生分泌p66ShcCH2结构域重组蛋白的质粒,期望进一步研究p66Shc的功能。方法:利用定点诱变的方法在pDisplay中去除HA和Myc表达序列,但保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域。在小鼠Igκ信号肽后是外源CH2结构域、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因。PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验。结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外感染细胞后产生重组蛋白。结论:成功构建体外可以产生p66ShcCH2结构域的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的CH2多肽和体外鉴定与p66ShcCH2结构域结合的蛋白分子实验奠定基础。     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的：表达GST－p11和6xHis-p11融合蛋白并制备GST－p11特异性抗体。方法：将人p11基因克隆人两种原核表达载体pGEX-4T-2和pQE30,分别在大肠杆菌BL21和M15中表达，用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST－p11蛋白制备多克隆抗体。结果：得到高表达量的融合蛋白，经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST－p11和6xHis-p11蛋白。以GST－p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体，Westernblotting证实该杭体能够识别6xHis-p11蛋白，具有较高特异性。结论：利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性，为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障。     

p53诱导死亡结构域蛋白在大鼠创伤性脑损伤中的表达变化

目的:探索创伤性脑损伤病理过程中p53诱导死亡结构域蛋白(PIDD)的表达变化。方法:建立大鼠脑损伤模型,采用免疫印迹法和免疫组织化学法检测损伤后的大鼠皮层组织中PIDD的表达和定位变化。结果:(1)在假手术脑组织中,PIDD表达很低,脑损伤后其表达逐渐增加,在3天左右达到最高峰,之后表达下降;(2)免疫组织化学法和免疫荧光实验表明,PIDD在损伤后的脑组织中表达明显上升,并且主要定位于神经元之中。     

ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１胞外区融合蛋白的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)胞外肽段与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并用该融合表达蛋白检测EB病毒相关鼻咽癌(NPC)患者血清中的特异性抗体.方法:用BamH I和EcoR I将含LMP1胞外区重组基因的质粒pMD18-LMPI双酶切后,克隆到pGEx4T-2中.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经谷胱甘肽S-转移酶柱亲和层析纯化,纯化的蛋白经Westemblot法检测鉴定.结果:重组表达质粒经酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子质量约为32.2 ku,此抗原能够与鼻咽癌患者血清中抗体特异性结合.结论:成功获得了LMP1胞外区重组基因表达的蛋白,并证明原核表达的LMP1胞外肽段保持了原有的抗原性,能够与EBV相关鼻咽癌患者血清中的抗体特异性结合.     

GST融合蛋白制备表皮生长因子受体抗体

目的：探讨制备大量表皮生长因子受体(EGFR)特异性抗体的方法。方法：将编码EGFR的N端肽段的cDNA克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后,经亲和层析柱纯化,用该GST融合蛋白免疫BALB／C小鼠,获得免疫血清,以ELISA和Western Blot检测抗体滴度。结果：获得GST—PTB融合蛋白纯度大于95％;经免疫小鼠抗血清滴度1：38827～1：190602,得到大量高滴度的EGFR特异性抗体。结论：用原核系统表达GST融合蛋白直接免疫小鼠可以快速、大量地制备EGFR特异性抗体。     

新鲜血小板与新鲜冰冻血小板膜活化糖蛋白的研究

目的通过对机采新鲜血小板与新鲜冰冻血小板在制备和贮存过程中血小板活化的状况来了解评估血小板输注的有效性。方法采用流式细胞技术观察有效期内新鲜血小板（22℃震荡保存7天内）与新鲜冰冻血小板（-80℃以下保存1年内）不同时段的膜糖化蛋白GPⅡb/Ⅲa和CD62P进行流式细胞分析。结果在-80℃保存12个月,其GPⅡb/Ⅲa和CD62P的表达差异无显著性,新鲜冰冻血小板CD62p的表达受到良好抑制,可与22℃振荡保存24 h的新鲜血小板质量相近;新鲜血小板在22℃条件下随保存时间的延长GPⅡb/Ⅲa和CD62P的表达迅速升高,与新鲜血小板相比48 h差异有显著性（P〈0.05）,72 h差异有极显著性（P〈0.01）。结论新鲜血小板冰冻期间发生的代谢损伤较常温条件下低。选择≤24 h的新鲜血小板用于一80℃冻存至少可以保存1年。     

PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用.方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2 分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用.结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力.结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础.     

TAT/CT-1及TAT/EGFP融合蛋白的表达与纯化及其在小鼠体内分布的观察

目的分别构建含蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)TAT与小鼠心肌营养素-1(CT-1)及TAT与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合基因片断的原核表达质粒TAT/CT-1及TAT/EGFP,利用大肠杆菌进行表达并纯化;观察融合蛋白在小鼠体内的分布.方法采用PCR及克隆技术将CT-1编码区基因以及EGFP基因分别与TAT连接到原核表达载体pGEX-4T3上.用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖4B纯化融合蛋白.小鼠尾静脉注射融合蛋白,脑、脊髓、肝、心肌等器官冰冻切片,免疫荧光观察融合蛋白的存在.结果目的片断CT-1及EGFP被有效的扩增,构建后质粒测序表明无PCR引起的突变,TAT/CT-1及TAT/EGFP在转化的大肠杆菌中获得高效表达,并成功纯化.脑、脊髓、肝、心肌等组织切片免疫荧光检测呈阳性.结论成功获得了有活性的TAT/CT-1及TAT/EGFP的基因表达产物;TAT可介导CT-1及EGFP由细胞外跨膜转导进入细胞内;为CT-1功能的进一步研究打下了基础.     

SLE活动期患者CD 62p、PMA的表达

目的探讨活动期系统性红斑狼疮（SLE）患者血小板活化状态及其微血管血栓形成的病理过程。方法应用流式细胞术（FCM）直接荧光标记法检测本院活动期SLE患者26例及30例对照者CD 62p、血小板-单核细胞聚合体（PMA）的表达情况,并对结果进行比较。结果活动期SLE患者CD 62p的表达为9．60±1．14%、血小板-单核细胞聚合体PMA的表达为15．32±1．24%。正常对照组CD 62p的表达为2．11±0．56%,PMA的表达为5．90±1．5%。SLE活动期患者与正常对照组血小板CD 62p、PMA的表达有显著差异（P＜0．05）。结论血小板CD 62p、PMA在SLE活动期患者中的表达增高并可作为监控SLE活动期患者高凝状态及抗血栓的治疗的实验依据。     

活性SET7/9融合蛋白的表达与纯化

目的:表达与纯化活性GST-SET7/9融合蛋白(SET7/9融合蛋白).方法:以含人SET7/9基因结构域全长cDNA的pCMV-SET7/9质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增获得目的基因片段,将测序正确的目的基因片段经EcoR Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切,插入载体pGEX-6P-3中,构得质粒经转染和异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,纯化后采用组蛋白甲基化转移酶(HMT)测定法鉴定蛋白活性.结果:构成pGEX-SET7/9重组质粒,表达分子质量约为77 kD的融合蛋白,纯化后测得CPM值明显高于对照组.结论:pGEX-SET7/9可表达高活性的SET7/9融合蛋白.     

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白。方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌B121并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16．抗体特异性识别。结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTipl6融合蛋白并可用于以后的实验研究。