抗坏血酸诱导新生鼠神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中,除寻求合适的细胞系外,如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键.目的:观察不同浓度抗坏血酸对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/12在广西医科大学科学实验中心完成.材料:清洁级新生24 h内SD大鼠30只,由广西医科大学实验动物中心提供.抗坏血酸为Sigma产品.方法:取新生鼠脑组织,组织块胰蛋白酶消化法体外分离培养神经干细胞,传至第2代以5×108L-1密度接种.设立4组:空白对照组不给予抗坏血酸,仅加入含体积分数为10%的胎牛血清、2%B27的DMEM/F12培养基;剩余3组在此基础上分别加入50,100,200 μmol/L抗坏血酸进行诱导,10 d后终止诱导.主要观察指标:RT-PCR检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶基因mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞向多巴胺能神经元分化率.结果:各浓度抗坏血酸诱导组均得到795 bp的扩增片断,即均表达酪氨酸羟化酶mRNA.神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原.与空白对照组比较,50,100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组酪氨酸羟化酶阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组升高幅度明显高于50 μ mol/L(P<0.05),100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组间比较无明显差异(P>0.05).结论:从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力.50～200 μ mol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化,抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化.     

细胞因子联合纹状体条件培养液定向诱导间充质干细胞体外分化为多巴胺能神经元

背景:在众多体外诱导间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化研究中,诱导阳性率仍不理想。目的:实验应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元,拟探讨提高诱导阳性率的方法。设计、时间及地点:以细胞为对象的对照观察细胞学实验,于2006-07/2007-12在山东大学齐鲁儿童医院和山东大学第二医院血液实验室完成。材料:健康成年Wistar大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离,新生Wistar大鼠用于纹状体条件培养液的制备。方法:采用贴壁法分离纯化健康成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养。取出生24h内新生Wistar大鼠,完整剥离其大脑组织制备纹状体条件培养液。取体外培养的第5代间充质干细胞,用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的预诱导液进行预诱导,24h后去除预诱导液,换用纹状体条件培养液进行诱导。主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,并应用细胞免疫化学技术检测细胞内神经元特异烯醇化酶和酪氨酸羟化酶表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液诱导后细胞胞体逐渐回缩成团,形成梭形,部分细胞可见突起伸出,类似神经元。细胞免疫化学检测,诱导后细胞神经元特异烯醇化酶阳性表达率为(72.70±14.81)%,酪氨酸羟化酶阳性表达率为(34.50±15.93)%。结论:应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子联合纹状体条件培养液诱导分化体系,获得了高比例的神经元,其中包括较多的多巴胺能神经元。     

诱导时间对体外培养大鼠神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

背景:近年来通过筛选不同细胞因子的诱导分化作用发现,某些特定的细胞因子配伍可明显诱导中脑神经干细胞体外定向分化成多巴胺能神经元,研究还发现神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元可以有效应用于移植治疗帕金森病,为提高其体内移植的疗效,目前迫切需要深入研究神经干细胞诱导分化的生物学特性.目的:探讨大鼠神经干细胞在分化液中诱导不同时间后,其体外分化成多巴胺能神经元的效应.设计:单一样本观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-05/10在中山大学附属第一医院完成,选择清洁级孕14 d的健康SD大鼠6只,体质量350-400 g,由中山大学动物实验中心提供(许可证号码SCXK(粤)2007-0034).实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:①在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.②经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.③诱导分化2,4,6,8,10 d后,流式细胞仪检测分化细胞中酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.主要观察指标:①大鼠神经干细胞诱导分化后细胞形态的变化.②诱导不同时间的大鼠神经干细胞分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.结果:在诱导分化液中大鼠中脑神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,分化6 d后,多数细胞已生长出一两个长突起及多个短突起.免疫细胞化学显示分化的细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2,4,6,8,10 d的分化细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比例分别为(3.2±0,9)%,(6.8±1.6)%,(16.7±2.6)%.(14.8±1.8)%,(12.2±2.5)%,各组间差异有显著性意义(F=26.449.P＜0.05).结论:诱导时间对大鼠中脑神经干细胞体外分化成多巴胺能神经元的能力存在影响,诱导6 d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比例最高.     

体外诱导脂肪基质干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:鉴于脂肪干细胞具有来源丰富、取材简便、易分离纯化和扩增、可进行自体移植并有多项分化潜能等特点,有学者认为其可作为治疗帕金森病的种子细胞来源。目的:观察大鼠脂肪基质干细胞体外向多巴胺能神经元诱导分化及分泌功能。方法:利用胶原酶消化法获得SD大鼠脂肪干细胞,体外培养至第3代时用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和抗坏血酸联合诱导作为实验组,以单纯加入体积分数5%血清为对照组。结果与结论:实验组诱导3d后,免疫荧光法和免疫组织化学法均可检测到诱导后的细胞表达酪氨酸羟化酶。实验组分化出多巴胺能神经元比例显著高于对照组(P<0.01)。ELISA法检测实验组连续诱导3d上清中有多巴胺分泌,诱导的第一二天中多巴胺浓度呈上升趋势,第3天有所下降。说明脂肪干细胞具有向多巴胺能神经元分化的能力。     

嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液对受损海马神经元保护作用的对比研究

目的:观察嗅鞘细胞条件培养液(OECCM)和星形胶质细胞条件培养液(ACM)对受损海马神经元的保护作用。方法:分别采用2种胶质细胞条件培养液预处理受损海马神经元(谷氨酸诱导损伤),对比其对受损海马神经元活力、凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度的影响。结果:与谷氨酸组相比,OECCM组神经元活力明显增高(P0.01),ACM组神经元活力增高(P0.05);与OECCM组相比,ACM组神经元活力降低(P0.05)。与谷氨酸组相比,ACM组神经元凋亡率和胞内游离钙浓度降低(P0.05),OECCM组明显降低(P0.01);OECCM组神经元凋亡率和胞内游离钙浓度低于ACM组(P0.05)。结论:OECCM和ACM均可明显提高受损海马神经元活力、降低凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度,OECCM的保护作用优于ACM。     

应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液诱导胚胎干细胞的分化

目的:为克服类胚体和视黄酸诱导体系的不足,实验使用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液定向诱导分化胚胎干细胞,观察是否可以获得大量具有高度增殖和进一步分化能力的神经干/祖细胞。方法:实验于2005-06/2006-09在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。①取孕12.5d的C57BL/6J小鼠胚胎脑组织,放入含有神经干细胞培养液(含B27、肝素5mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20μg/L、表皮生长因子20μg/L、100U/mL青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM/F12)的离心管内,接种后37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养。3～5d后可见团状细胞球出现,即为原代的神经干细胞。取P5～10代神经干细胞消化成单细胞悬液,以5×104/cm2密度接种于神经干细胞培养液中,4～5d离心后收集上清液,即为胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液。②P30代SC1002鼠胚胎干细胞消化成单个细胞后,移入上述制备的条件培养液中,5d后消化细胞,再重新接种于条件培养液中培养5d。常规消化后接种于神经干细胞培养液中,培养4～5d,即得到胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞。对照组用神经干细胞培养液代替条件培养液。③所得细胞进行特异性抗原免疫细胞化学染色,并计数免疫染色阳性细胞率。RT-PCR检测标志性基因的表达。结果:①胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞的比例:当消化成单个细胞的胚胎干细胞接种到神经干细胞条件培养液后,24h内聚集成细胞球并悬浮生长。免疫细胞化学检测少部分细胞表达nestin,在随后的培养过程中nestin阳性细胞逐渐增多。第4天细胞球周围的细胞几乎全部呈nestin阳性。当消化后重新接种于神经干细胞条件培养液中,可见部分细胞贴壁生长,10d后再常规消化接种于神经干细胞培养液中,呈典型的双极外形,nestin及RC2检测均呈阳性。RT-PCR检测显示Oct-4不再表达,而sox2,sox3,nestin,fabp7及bHLH转录因子均有显著表达。另一方面,当单个胚胎干细胞直接培养在神经干细胞培养液中,大量细胞死亡,仅10%存活,存活细胞表达Oct-4和nestin。②胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞向神经元和胶质细胞的分化:经过10～12d的诱导分化,微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白细胞阳性率分别为(27.6±9.2)%和(29.7±11.6)%。结论:不需要共培养或添加诱导因子,应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液成功地将胚胎干细胞定向诱导分化为大量高纯度的神经前体细胞,并进一步得到神经元和神经胶质细胞。     

常氧及低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:神经干细胞的定向诱导分化和扩增受细胞自身基因和外来信号的调控。目的:观察中脑源性神经干细胞在常氧、低氧和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元的分化情况。方法:无菌条件下分离E12小鼠胚胎腹侧中脑组织,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在无血清培养基中培养扩增;Nestin免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞。在有血清培养基中对纯化神经干细胞自然分化;神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色方法分别鉴定神经元和星形胶质细胞。建立常氧和低氧环境,设置常氧组、常氧+胶质源性神经营养因子组、低氧组、低氧+胶质源性神经营养因子组,按实验分组在有血清条件下诱导分化。结果与结论:在低氧条件下,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组;尤其是低氧环境和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

常氧及低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：神经干细胞的定向诱导分化和扩增受细胞自身基因和外来信号的调控。目的：观察中脑源性神经干细胞在常氧、低氧和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元的分化情况。方法：无菌条件下分离E12小鼠胚胎腹侧中脑组织,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在无血清培养基中培养扩增;Nestin免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞。在有血清培养基中对纯化神经干细胞自然分化;神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色方法分别鉴定神经元和星形胶质细胞。建立常氧和低氧环境,设置常氧组、常氧＋胶质源性神经营养因子组、低氧组、低氧＋胶质源性神经营养因子组,按实验分组在有血清条件下诱导分化。结果与结论：在低氧条件下,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组;尤其是低氧环境和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

目的:研究表明,星形胶质细胞产生一系列可溶性因子和膜相关因子,对中枢神经系统的发育和功能的成熟起了重要的作用。将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,探讨星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响。方法:实验于2005-03/2006-02在广西医科大学实验中心完成。①实验材料:生后0～2d新生SD大鼠由广西医科大学实验动物中心提供。②实验方法:分离培养新生大鼠海马神经干细胞。采用化学法、差速贴壁法和振荡法分离纯化新生大鼠脑组织星形胶质细胞,以胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞,应用免疫细胞化学染色法进行细胞纯度鉴定。将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养:共培养组是将培养瓶中的星形胶质细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液,加入完全培养液,待细胞均匀长满后,换神经干细胞基础培养液,孵育24h后,将涂有多聚赖氨酸的盖玻片放入6孔板中,将传代1个月的神经干细胞球种到盖玻片上,同时更换神经干细胞基础培养液继续培养。对照组是单纯接种神经干细胞球于置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的6孔培养板内。③实验评估:采用免疫细胞化学染色法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和酪氨酸羟化酶表达。结果:纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性,细胞纯度达95%。星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞及酪氨酸羟化酶阳性细胞明显多于对照组(P<0.05)。结论:星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元细胞,包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生,可能是星形胶质细胞及其分泌的因子维持并延长了神经元存活,降低了凋亡比率所致。     

神经干细胞向多巴胺能神经元分化机制的研究进展

帕金森病是中脑黑质的多巴胺能神经元缺失引起的慢性中枢神经系统功能失调。目前,应用神经干细胞在体内外分化成多巴胺能神经元是帕金森病细胞替代治疗的重要途径。本文综合近十年来的研究进展,对神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程中重要的分子机制、信号通路以及外界影响因素进行综述。     

全反式维甲酸诱导神经干细胞向神经元的分化

背景:目前研究证实全反式维甲酸在调控多种组织和细胞的增殖、生长发育、代谢以及维持内环境稳定等方面具有广泛生物学作用.目的:探讨全反式维甲酸诱导神经干细胞分化为神经元过程中的作用及其分子机制.设计、时间及地点:对照观察,体外细胞学实验,于2006-07/2007-06在上海同济大学附属医院实验室完成.材料:普通级孕13～14 d雌性SD大鼠6只,取胎鼠用于制备神经干细胞.诱导剂全反式维甲酸为Sigma公司产品.方法:取第3代神经干细胞,以2×108 L-1密度接种,分为全反式维甲酸诱导1 d,3 d,7d,10d组和空白对照组,各诱导组均加入1 μ mol/L全反式维甲酸,空白对照组仅加入等量生理盐水.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定结果,计数分化为神经元的比例,应用半定量RT-PCR法检测维甲酸受体α mRNA的表达.结果:全反式维甲酸诱导后神经元特异性烯醇化酶染色呈阳性,细胞有多个细长突起,胞体呈绿色荧光,胞核呈蓝色荧光.与空白对照组比较,诱导3 d,7 d,10 d组神经元特异性烯醇化酶染色阳性细胞率均明显升高(P<0.05),且诱导7 d组达峰值.与空白对照组比较,各诱导组维甲酸受体α mRNA的表达量均明显升高(P<0.01).结论:全反式维甲酸能显著提高大鼠胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,同时发现细胞维甲酸受体α mRNA的表达增加.     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化：无血清培养条件下观察

背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一。目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况。设计:单一样本实验。单位:中山大学附属第三医院神经外科。材料:取出生后3dSD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供。巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司。方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察。主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应。经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞。     

室管膜前下区神经干细胞向神经元分化中骨形成蛋白2及DLX5的作用

背景:目前神经干细胞应用的最大障碍还在于分化的调控,而对干细胞分化调控机制尚知之甚少.室管膜前下区是目前公认的神经干细胞富集区之一.在此区的神经干细胞可以长距离迁移到嗅球而保持神经干细胞不分化,最后在嗅球分化为中间神经元.骨形成蛋白2及DLX5在室管膜前下区神经干细胞向嗅球迁移分化过程中起着重要作用.目的:研究室管膜前下区神经干细胞的构筑及迁移特点,以及目前国内外有关骨形成蛋白2及DLX5在此区神经干细胞迁移分化中的作用,希望对神经干细胞的分化调控机制有一定的认识.方法:由第一作者利用中文检索词神经干细胞,室管膜前下区,骨形成蛋白2,DLX5及英文检索词neural stem cells,SVZa,BMP-2,DLX5,在PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)、中国期刊全文数据库(www.cnki.net/index.htm)、万方数据库(http://www.wanfangdata.com.cn)中检索1997-01/2009-01关于骨形成蛋白2、DLX5在室管膜前下区神经干细胞向神经元分化中作用的文献.排除内容陈旧或重复文献.结果与结论:初检得到121篇文献,中文86篇,英文35篇.最后对符合标准的28篇文献作进一步的分析.结果提示,室管膜前下区神经干细胞具有其独特细胞构筑和长距离迁移的特点,骨形成蛋白2及DLX5在其迁移分化过程中起着重要作用,但其具体作用机制仍不清楚.     

核受体相关因子1基因转染骨髓源性神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元的分化

背景:核受体相关因子1基因修饰是否促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化少见报道。目的:观察核受体相关因子1基因修饰骨髓源性神经干细胞在体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法:体外培养和纯化大鼠骨髓源性神经干细胞,将骨髓源性神经干细胞分为4组,将未转染的骨髓源性神经干细胞随机分为对照组,脑源性神经营养因子组;将筛选出的重组质粒转染阳性的神经干细胞分为核受体相关因子1组和核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组。结果与结论:RT-PCR显示转染的骨髓源性神经干细胞4d后核受体相关因子1高表达,分化结果显示:核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组细胞内酪氨酸羟化酶在mRNA水平上的表达量最高,神经干细胞贴壁分化后各组酪氨酸羟化酶阳性细胞比例均明显高于对照组,其中以核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组分化比例最高,为(52.44±15.9)%。提示核受体相关因子1基因修饰可促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化,并通过脑源性神经营养因子的诱导作用,在体外可获得大量的多巴胺能神经元。     

共培养法神经细胞诱导骨髓间充质干细胞向神经元的分化

背景:目前神经细胞是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元的作用还未见报道.目的:拟在体外建立人骨髓间充质干细胞和神经细胞的共培养体系,观察共培养条件下神经细胞对骨髓间充质干细胞分化为神经元的影响.设计、时间及地点:分组对照,体外细胞学实验,于2006-12/2007-12在山东省青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于青岛大学医学院附属医院行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者骨髓血,神经细胞取材于分娩过程中窒息死亡的新生儿脑组织,传至第3代用于实验.用于细胞共培养的Transwell双层培养皿为Coming Costar公司产品,培养体系孔径小于3.0 μm,细胞不会迁徙通过,但上、下层培养液可互通融合.方法:共培养组将神经细胞按1×106密度接种于Transwell双层培养皿的底层,上层接种骨髓间充质干细胞,加入LG-DMEM培养基,培养4～5 d.对照组上、下层均接种骨髓间充质干细胞.主要观察指标:观察骨髓间充质干细胞的形态变化,免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞中神经元特异性标志物的表达.结果:共培养组骨髓间充质干细胞生长伸展,呈放射状突起,并可相互连接,神经元特异性烯醇化酶阳性率为(32.7±11.5)%,表现神经元细胞的特性.对照组骨髓间充质干细胞形状扁而宽,未形成神经样形态结构,神经元特异性烯醇化酶呈阴性.结论:神绛细胞生长过程中提供的微环境对骨髓间充质干细胞分化为神经元具有诱导促进作用.     

脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导

背景:神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞,培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元,从而促进中枢神经系统损伤的修复。但以往相关文献显示神经干细胞分化为神经元的比例不到30%。目的:以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂,观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。材料:清洁级孕14~17d的SD大鼠10只,诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品,胎牛血清为杭州四季青产品。方法:孕鼠处死后取出胚胎,剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞,锥虫蓝染色计数,调整细胞密度为2×106,添加B27及碱性成纤维细胞生长因子,置于37℃、体积分数为0.05的CO2恒温箱中原代培养,待细胞克隆球明显增大、中央变暗时传代扩增。将培养所得的干细胞克隆球分为2组,诱导组添加体积分数为0.01的胎牛血清 20μg/L脑源性神经营养因子共培养,血清对照组仅添加体积分数为0.01的胎牛血清。主要观察指标:在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况。诱导分化5d后,行神经元免疫组化鉴定,流式细胞仪检测神经元阳性细胞率。取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3d的两组细胞,RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达。结果:原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克隆球,形态规则,立体感强;悬浮生长的克隆球经诱导分化后,逐渐失去其球状的立体外观,邻近克隆球发出的突起可相互连接,3d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现。培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达,诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达。与血清对照组比较,诱导组神经元阳性细胞率显著升高(χ2=16.0,P<0.05)。与未分化的神经干细胞比较,诱导组、血清对照组细胞MASH-1的表达均明显升高,且前者升高幅度明显强于后者(F=21.7,P<0.05)。结论:脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化,可能与内源性bHLH基因MASH-1的表达升高有关。     

黄芩甙体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞的分化

背景:已有实验表明,骨髓基质细胞具有分化为骨骼、神经干细胞及造血干细胞的巨大潜能,而黄芩甙具有诱导细胞分化的作用.目的:探讨黄芩甙体外诱导骨髓基质细胞分化为神经干细胞的可能性.方法:分离培养Wistar纯系大鼠骨髓基质细胞,并将分离的骨髓基质细胞分为实验组和对照组,对照组不干预,实验组用黄芩甙(350-400 μmol/L)诱导,2组的培养环境相同.持续诱导6 d后选取生长良好的细胞进行蛋白质印迹和反转录PCR(RT-PCR)法检测.结果与结论:黄芩甙诱导7 d后,骨髓基质细胞形成较典型的神经细胞形态.诱导前骨髓基质细胞不表达神经细胞标记蛋白mRNA和蛋白;诱导6 d表达神经细胞标记蛋白和mRNA;对照组不表达神经细胞标记蛋白和mRNA.证实黄芩甙在体外可诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化为神经样细胞.     

大鼠海马83 ku蛋白诱导神经干细胞向乙酰胆碱酯酶阳性神经元的定向分化

背景:神经干细胞的临床应用还尚待时日,现阶段需要解决如何诱导神经干细胞分化为特定表型的神经元以替代丢失、变性的神经元细胞.目的:探讨大鼠海马组织83 ku蛋白对神经干细胞向乙酰胆碱酯酶阳性神经元分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2003-10/2008-04在南通大学医学院完材料:清洁级SD大鼠12只,17 d龄SD胎鼠多只,均由南通大学实验动物中心提供.方法:取6只正常大鼠及6只切割海马伞后14 d大鼠的海马组织制成匀浆,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据染色结果切取含有83 ku差异蛋白条带进行电洗脱,定量后调整蛋白浓度为300 mg/L.取胎鼠前脑组织,体外分离培养神经干细胞,设立3组:空白对照组加入单纯DMEM/F12无血清培养基;83 ku蚩白正常组、83 ku蛋白切割组分别加入含10 mg/L来自正常/割海马伞大鼠海码组织83 ku蛋白的DMEM/F12无血清培养基,诱导12 d.主要观察指标:用乙酰胆碱酯酶组织化学染色榆测神经干细胞分化为乙酰胆碱酯酶阳性神经元的情况.结果:诱导12d后,83 ku蛋白切割组乙酰胆碱酯酶阳性神经元较多,胞体大且分化较好,突起粗且长;83 ku蛋白正常组乙酰胆碱酯酶阳性神经元较少,胞体小,突起短;空白对照组仅见少量乙酰胆碱酯酶阳性神经元.组间乙酰胆碱酯酶阳件神经元数比较差异有显著性意义(P＜0.05),83 ku蛋白切割组＞83 ku蛋白正常组＞空白射照组.结论:大鼠海马组织中83 ku蛋白可成功诱导神经干细胞定向分化为乙酰胆碱酯酶阳性神经元.