胚胎大鼠脊髓运动神经元与C2C12肌管体外共培养体系的建立

目的 获得胚胎大鼠脊髓运动神经元与C2C12肌管共培养的条件,在体外建立稳定的神经-肌肉共培养体系,并形成功能性的神经肌肉接头。方法 C2C12 成肌细胞株体外扩增培养至60%～70%融合时,用分化培养液诱导分化; 取孕15～16 d 的SD 大鼠,提取胚胎大鼠脊髓前角运动神经元细胞,种植到分化5 d的C2C12肌管细胞中,在神经元基础无血清培养液Neurobasal+2% B27中共培养。倒置显微镜下观察各个阶段神经元形态及突起长度的变化、肌管形态变化及收缩特性、神经肌肉接头的形成,应用免疫荧光染色技术检测突触后膜乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)特异性结合物α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX),并采用屏幕录像技术记录共培养体系中肌肉收缩现象。结果 在共培养体系中,原代脊髓运动神经元与C2C12肌管细胞均能存活并进一步分化成熟。3 d时,可见运动神经元伸出的轴突延伸至肌管膜表面或包绕肌管; 1周时,肌管按同一方向排列,出现广泛的节律性收缩,同时免疫荧光染色结果显示α-BTX特异性结合突触后膜AChR; 共培养10 d 后,运动神经元开始凋亡,肌管细胞逐渐出现萎缩现象。结论 在体外培养条件下,无需特殊培养基和各种营养因子,运动神经元和骨骼肌细胞即可共同生存、生长并进一步发育,建立突触连接,触发一系列神经肌肉接头信号转导,引发肌管节律性收缩。     

组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET7/9对myogenin基因表达的影响

目的利用本组构建的小鼠组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET7/9真核表达质粒及RNA干扰(siRNA)质粒,在体外成肌细胞分化模型C2C12细胞中检测SET7/9对肌肉分化关键基因myogenin基因表达的影响。方法转染SET7/9真核表达质粒pCMV-3tag-6-SET7/9至C2C12细胞,Western blot技术验证其表达;利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测SET7/9对myogenin基因mRNA水平的影响;利用双荧光素酶报告系统检测SET7/9对myogenin基因启动子活性的影响;转染SET7/9的siRNA质粒,利用Real-time PCR技术检测其抑制效果以及对myogenin mRNA水平的影响。结果 SET7/9真核表达质粒pCMV-3tag-6-SET7/9可在C2C12细胞中有效表达;SET7/9可使myogenin mRNA水平升高并能够促进myogenin启动子活性升高;干扰SET7/9表达可使myogenin mRNA水平降低。结论组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET7/9可激活肌肉分化关键基因myogenin的转录。     

肝脏部分切除对骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化的影响

目的:探讨肝脏损伤对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肝细胞诱导分化的影响。方法:昆明系小鼠分两组,分别行肝脏2/3切除和开关腹手术,分别于术后12 h,24 h,36 h,48 h,72 h后提取MSCs,取第3代的MSCs,流式细胞仪鉴定MSCs后,应用HGF联合EGF诱导,20 d后免疫荧光染色鉴定肝细胞标志物ALB,CK8,计数ALB阳性细胞数量和同视野细胞总数,计算阳性率。结果:诱导分化20 d,两组均有ALB、CK8表达,24 h时间点,实验组阳性率(10.41±0.11)%,对照组阳性率为(9.83±0.32)%,实验组与对照组阳性率比较差异有显著性意义;其余时间点实验组和对照组阳性率比较差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:肝脏损伤后24 h,提取MSCs定向肝细胞的阳性率高。     

C26结肠癌细胞与RAW264.7巨噬细胞共培养体系诱导C2C12细胞肌管萎缩及甘草多糖的保护作用

目的:基于C26结肠癌细胞与RAW264.7巨噬细胞共培养体系,构建C2C12细胞肌管萎缩模型,利用该模型研究甘草多糖对肌管的保护作用及机制。方法:构建C26细胞和RAW264.7细胞共培养体系,分别制备单一细胞和共培养细胞的条件培养液。加入诱导分化液使C2C12成肌细胞形成肌管。(1)将已分化的C2C12细胞分为对照组、C26模型组、RAW264.7模型组、共培养模型组。各组分别给予相应的条件培养液,孵育48 h, HE染色观察肌管形态,并测定肌管直径。(2)将已分化的C2C12细胞分为对照组及甘草多糖不同浓度(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 mg/ml)组,分别给予相应浓度的甘草多糖,孵育48 h后,测定细胞活力。(3)将已分化的C2C12细胞分为对照组、C26模型组、C26+甘草多糖组。除对照组外,其他各组均给予C26结肠癌细胞条件培养液;同时,甘草多糖干预组分别给予0.5、1、2 mg/ml甘草多糖。孵育48 h后,HE染色观察肌管形态,并测定肌管直径。(4)将已分化的C2C12细胞分为对照组、共培养模型组、共培养+甘草多糖组。除对照组外,其他各组均给予共培养细胞条件培养液;同时,甘草多糖干预组分别给予0.5、1、2 mg/ml甘草多糖。孵育48 h后,HE染色观察肌管形态,并测定肌管直径。(5)不同的条件培养液或共培养条件培养液与甘草多糖(2 mg/ml)协同干预后,Western blot检测信号传导与转录激活因子3(STAT3)蛋白表达及磷酸化水平。结果:(1)3种条件培养液均可诱导肌管直径减小(P0.01),且共培养模型组的相对肌管直径较C26模型组显著降低(P0.05)。(2)≤2.5 mg/ml甘草多糖对细胞活力无明显影响。(3)与C26模型组相比,C26+甘草多糖(0.5、1和2 mg/ml)组细胞的相对肌管直径显著升高(P0.01)。(4)与共培养模型组相比,共培养+甘草多糖(0.5、1和2 mg/ml)组细胞的相对肌管直径显著升高(P0.01)。(5)3种条件培养液干预后均可诱导C2C12肌管细胞STAT3磷酸化水平升高,且共培养模型组的p-STAT3/STAT3蛋白表达比值明显高于C26模型组(P0.01)。与共培养模型组相比,共培养+甘草多糖(2 mg/ml)组p-STAT3/STAT3蛋白表达比值显著下调(P0.01)。结论:甘草多糖可能通过抑制STAT3信号通路减轻C26结肠癌细胞与RAW264.7巨噬细胞共培养体系诱导的肌管萎缩。     

兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

目的建立高纯度、高丰度的兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养方法,并对培养的肌卫星细胞体外增殖和成肌特性进行观察。方法采用改良I型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法结合差速贴壁培养以分离、纯化1周龄幼兔小腿三头肌来源的骨骼肌卫星细胞。镜下观察肌卫星细胞生长形态,结蛋白(Desmin)免疫组化染色鉴定体外培养的肌卫星细胞,MTT法绘制细胞生长曲线,并对分离培养的肌卫星细胞成肌特性进行诱导培养观察。结果差速贴壁后的悬浮肌卫星细胞折光性强,呈透亮球形,数量较多,贴壁生长后逐渐变为长梭形;免疫组化染色检测分离培养的细胞高表达Desmin,证明为肌卫星细胞,纯度高达95%;传代培养的肌卫星细胞24 h后开始增殖,第3~7天处于对数生长期,第8天后进入平台期;不经诱导分化培养基培养的肌卫星细胞也可融合形成肌管,但形成肌管速度不及诱导分化培养组快速。结论成功建立了具有操作简便、不易污染和纯度高的兔骨骼肌卫星细胞分离、培养方法,为采用肌卫星细胞为种子细胞的再生医学研究奠定实验基础。     

成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程的动态变化

目的 探讨成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程中的动态表达。方法 用盐酸布比卡因局部注射制作肌肉损伤模型,在损伤后不同时间点取腓肠肌行冰冻切片,HE染色显示损伤肌肉的病理变化,用SABC法检测MyoD与myogenin的表达。结果 MyoD在肌肉损伤后18 h开始表达,48 h达高峰;myogenin在肌肉损伤后24 h开始表达,72 h达高峰。结论 MyoD与myogenin在肌肉损伤后的再生修复过程中起作用,可作为鉴定肌肉前体细胞和反映肌肉再生的指标。     

中药对软组织损伤骨骼肌再生影响的形态学观察

目的：探讨中药对软组织损伤骨骼肌再生的影响。方法：昆明种小鼠50只,制作创伤模型,口服中药为实验组,未用中药为对照组,术后分别于第2,3,5,7,10d处死,组织切片,HE染色,观察骨骼肌再生的情况。以评价中药对软组织损伤骨骼肌再生的影响。结果：中药可以促进肌卫星细胞激活,成肌细胞增殖,分化,融合以及肌管形成,结论：中药可以促进软组织损伤骨骼肌再生。     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养及鉴定

目的：探讨骨骼肌卫星细胞体外培养，鉴定的方法。方法：采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌卫星细胞，经差速贴壁法纯化后，在培养液中进行培养，观察不同血清浓度下，卫星细胞生长融合的情况，倒置显微镜观察细胞形态，利用结蛋白免疫细胞化学染色方法鉴定肌卫星细胞。结果：细胞经过两步消化和差速贴壁后，纯度在90%以上，在生长培基中，细胞分裂增生；在融合培基中，细胞发生融合，形成肌管。结论：成年大鼠肌卫星细胞在不同的培养条件下可增生或分化，结蛋白免疫细胞化学染色可以早期鉴定骨骼肌卫星细胞。     

含胎肌条件培养液的DMD原代肌组织培养体系的建立

应用含胎肌条件培养液的培养体系对 DMD 和正常肌组织进行原代培养。经倒置相差显微镜、透射电镜和 Desmin 免疫细胞化学技术鉴定,显示该培养体系能使肌组织成肌细胞生长并大量繁殖,分化良好,全部形成肌管。提示含胎肌条件培养液的培养体系能激活正常人及患者的肌卫星细胞,具有良好定向培养肌细胞的能力。     

神经生长因子对大鼠骨髓基质细胞增殖和向成骨分化的影响

目的:观察神经生长因子(NGF)对大鼠骨髓基质细胞(BMSC)增殖和向成骨分化的影响。方法:体外培养大鼠BMSC,流式细胞术鉴定表面标志物;加成骨培养液培养至第3代,分为对照组(不加NGF)和实验组(加入100 ng/ml NGF),测定第1、3、5天第3代BMSC细胞增殖活性(MTT法)和碱性磷酸酶(ALP)活性,应用Von Kossa染色比较2组成骨性能。结果:CD90、CD105为强阳性表达,CD34、CD45为阴性。MTT法测得实验组第1、5天细胞的平均吸光度与对照组差异均无统计学意义(P>0.05),而第3天实验组高于对照组(P<0.05),实验组ALP表达明显高于对照组(P<0.01);Von Kossa染色形成钙化结节也较对照组数量增多,面积增大。结论:NGF无明显促进大鼠BMSC增殖的作用,但可促进其向成骨细胞分化。     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖

目的探讨成年大鼠原代骨骼肌卫星细胞体外培养方法,观察细胞的增殖、成肌分化特性。方法采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化鉴定所获取细胞的肌源性标志desmin。MTT法观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖特性并绘制生长曲线图。同时观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性。结果所分离的原代骨骼肌卫星细胞纯度在90%以上。细胞体外培养时在第3天进入对数生长期,5～6d进入增殖平台期。细胞体外培养时无须特殊诱导可以自发出现成肌定向分化,相互融合形成具有自发收缩特性的肌管细胞。结论体外培养获取的骨骼肌卫星细胞数量可以满足组织工程研究的需要。     

早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞的表达

目的:研究早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞中的特异性表达.方法:利用RT-PCR研究不同时期C57鼠和不同代龄SD大鼠骨髓干细胞早期肌肉特异性mRNA(包括MyoD,Myf5,myogenin,MRF4和desmin)的表达.结果:Myf5及desmin在新鲜分离、培养了2 d和7 d的悬浮与贴壁的C57小鼠骨髓干细胞中均有表达,没有检测到MyoD,myogenin和MRF4在此时期小鼠骨髓干细胞的表达.MyoD与desmin在原代至第6代SD大鼠骨髓间质干细胞中均有表达,没有检测到myogenin和MRF4在各代细胞中的表达.结论:骨髓干细胞能表达一定水平的早期肌肉特异性mRNA.     

Podocan在牛骨骼肌卫星细胞中的作用及调控

目的:细胞外基质(ECM)在细胞发育,组织修复,调控细胞增殖、分化、粘附和迁移方面具有十分重要的作用。小的富含亮氨酸的重复蛋白(SLRP)家族属于细胞外基质中的一类重要的非胶原蛋白。Podocan,是一个大约由600个氨基酸组成的分泌蛋白,属于SLRP家族中的第五亚类蛋白。Podocan在肾脏、心脏、肝脏、胰腺和血管的平滑肌细胞中均有表达,其对平滑肌细胞的迁移和增殖具有负调控作用,可以调节内膜的增生。本实验室在前期研究工作中通过对牛骨胳肌卫星细胞增殖分化过程的高通量测序结果表明,Podocan在牛骨胳肌卫星细胞中具有一定的表达,随着卫星细胞的分化,其表达量呈显著增加,推测其能够参与牛骨胳肌卫星细胞的分化,与牛肌肉的发育和成熟具有密切关系。方法:本研究以体外培养的牛骨胳肌卫星细胞为实验材料,以2%马血清分别诱导细胞分化2d、3d、4d和5d。收集细胞,采用荧光定量RT-PCR和Western Blot的方法分别检测不同分化程度的牛骨胳肌卫星细胞中Podocan mRNA和蛋白的表达水平。通过免疫荧光染色的方法检测Podocan在细胞中的表达定位。此外,本研究构建Podocan的过表达载体以及shRNA干扰和CRISPR干扰载体,以脂质体2000的方法转染骨骼肌卫星细胞,分别实现Podocan的过表达和抑制,以荧光定量RT-PCR和Western Blot的方法检测Podocan的过表达和抑制效果,同时检测骨骼肌卫星细胞分化的标志基因Myo G(Myogenin)和My HC(Myosin Heavy Chian)的mRNA和蛋白表达水平变化。结果:随着牛骨骼肌卫星细胞分化的进行,Podocan的mRNA和蛋白表达量显著增加,免疫荧光定位结果显示其主要分布在成熟的在肌管的细胞中,而未分化的细胞其表达量较低。Podocan的过表达和抑制载体能够显著增加或抑制其在牛骨骼肌卫星细胞中的表达量,且Myo G和My HC mRNA和蛋白表达水平的检测结果显示,Podocan的表达增加和抑制能够促进或减少骨骼肌卫星细胞分化的程度。结论:Podocan在牛骨骼肌卫星细胞的分化过程中具有重要的调控作用,其促进肌肉分化的分子机制深入探索能够为肌肉生长发育机理的研究及提高肌肉产量的肉牛生产提供帮助。     

大鼠心肌细胞诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的:研究人间充质干细胞(MSCs)向心肌方向分化的机制.方法:将人MSCs以10000/cm2的密度接种,共分为四组:1)对照组;2)共同培养组:人MSCs和新生SD大鼠心肌细胞进行共同培养;3)条件培养液组:将从新生SD大鼠心肌细胞培养中获得的培养液,用于人MSCs的培养;4)细胞匀浆液组:将心肌细胞匀浆液用于人MSCs的培养.分别于实验第2、5、7天收集各实验组的人MSCs,进行Desmin及肌钙蛋白Ⅰ的免疫组化染色.在共同培养组中,同时还用抗人DNA进行的荧光原位杂交,以区分鼠来源的细胞及人来源的细胞.结果:在对照组、条件培养液组及细胞匀浆液组均未检测到心肌特异性蛋白的表达.在共培养组中,第2天,部分人MSCs开始表达Desmin,第5天细胞开始表达cTnI,至第7天阳性表达率达35%左右.结论:与大鼠心肌细胞共同培养可以诱导人MSCs向心肌方向的分化,而心肌细胞的条件培养液及心肌细胞匀浆不能诱导它们的心肌分化.     

胰岛素样生长因子1受体在肌损伤组织肌卫星细胞的表达

目的:探讨胰岛素样生长因子1受体(Insulin like growth factor 1 receptor,IGF1R)在正常和注射心脏毒素后,致肌损伤的肌肉组织中具有再生能力的肌卫星细胞表达情况;为进一步研究某些肌肉变性疾病的分子学发病机制和治疗方法提供参考依据.方法:取C57雄性小鼠12只,随机分为6组,1～6组...     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的 建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性.方法 采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞.免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MIT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性.结果 获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desmin呈强阳性表达.体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2 d的潜伏期,5～6 d进入平台期.细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞.结论 酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法.骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞.     

成肌性标志物在人骨髓间充质干细胞分化为肌细胞过程中的表达

目的 研究成肌性标志物在人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)分化为肌细胞过程中的表达情况.方法 体外培养hBM-MSCs,采用免疫荧光法和RT-PCR检测hBM-MSCs中成肌性标志物MyoD、myogenin及desmin的表达.将1×107个hBM-MSCs经尾静脉注入免疫抑制的mdx小鼠体内,于移植后2～24周处死,采用免疫荧光法和RT-PCR检测小鼠骨骼肌内MyoD、myogenin、desmin和人特异性抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达. 结果每100个hBM-MSCs中MyoD、myogenin和desmin阳性细胞数分别为23.5±5.3、30.7±6.2和28.4±5.7,第5代hBM-MSCs中可检测到MyoD、myogenin和desmin mRNA表达.hBM-MSCs移植后2周,mdx小鼠骨骼肌内可检测到少量MyoD和myogenin阳性细胞,4周后可检测到少量desmin阳性细胞.hBM-MSCs移植后2～4周,骨骼肌中开始出现MyoD和myogenin mRNA表达,12～16周较强;移植后8周开始出现desmin mRNA表达,16周后表达渐增强.hBM-MSCs移植后4周,mdx小鼠骨骼肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后开始出现Dys mRNA表达,随着移植后时间延长,Dys表达逐渐增强. 结论 hBM-MSCs具有向骨骼肌细胞分化的潜力,能在受体内分化为骨骼肌细胞.在hBM-MSCs分化为肌细胞的过程中,MyoD和myogenin表达上调可能发挥了重要作用.     

应力作用下成肌细胞分化的信号转导研究

正1成肌细胞分化肌肉发生主要是指在胚胎发育的过程中,其中涉及诸多的生物学过程。在时间上,这一过程可以大致分为以下三个阶段:定向分化、细胞增殖和终极分化[1]。2成肌细胞分化过程中细胞周期的调节成肌细胞分化形成肌管的过程中,成肌细胞从细胞周期中退出,相互融合形成多核的肌管细胞。因此,细胞周期在肌肉发生中起着相当重要     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desm in呈强阳性表达。体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1~2 d的潜伏期,5~6 d进入平台期。细胞汇合至60%~70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。     

咀嚼肌卫星细胞的体外培养及生物学特性的研究

目的:探讨咀嚼肌卫星细胞的体外培养方法并研究其生物学特性。方法:取新生绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠面部咀嚼肌,采用酶消化法分离出咀嚼肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养。采用倒置显微镜及荧光显微镜观察、测定生长曲线等指标,研究咀嚼肌肌卫星细胞的增殖与分化能力,采用骨骼肌肌动蛋白(-αsarcometric actin)单抗免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:酶消化法适于咀嚼肌卫星细胞的分离,体外培养的咀嚼肌卫星细胞增殖速度快。免疫化学染色显示,体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞呈阳性表达。结论:体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞有强的增殖分化能力,能用于颌面部组织工程种子细胞库的构建。