Role of calcium signaling in down-regulation of aggrecan induced by cyclic tensile strain in annulus fibrosus cells

Objective： To study the role of intracellular calcium signal pathway in the down-regulation of aggrecan induced by cyclic tensile strain in the annulus fibrosus cells. Methods： The expression of aggrecan mRNA and core protein were respectively detected with RT-PCR and western blot after the channels transmitting calcium ions were blocked with EGTA, gadolinium and verapamil. Results： EGTA, gadolinium and verapamil partially prevented the effects of cyclic tensile strain on the expression of aggrecan in annulus fibrosus cells. Conclusion： The calcium signaling is involved in the down-regulation of proteoglycan resulting from cyclic tensile strain in the annulus fibrosus cells.     

纤维环穿刺法建立兔椎间盘退变模型

目的:拟建立一个有效的可重复的椎间盘退变模型.方法:取健康成年新西兰大白兔40只,体质量2.5~3.0 kg,雌雄不限,随机分为纤维环穿刺组和对照组,每组20只.经腹膜外入路暴露L4/5、L5/6两个椎间隙,采用21号针头从椎间隙侧前方刺入L4/5、L5/6椎间盘的纤维环,深度控制在5 mm.对照组仅分离暴露椎间盘,不做任何处理.术后1、2、4、6、8周每组随机选取4只兔子行MRI、HE染色及Ⅱ型胶原免疫组化观察退变椎间盘的变化.结果:MRI观察发现,纤维环穿刺组术后椎间盘T2信号强度呈持续减弱趋势,椎间隙高度也不断下降.从术后2周开始两组差异有统计学意义(P<0.05).HE染色观察发现,随着时间进展,纤维环穿刺组髓核细胞逐渐减少,8周时组髓核组织几乎完全变性,被纤维软骨组织替代.Ⅱ型胶原免疫组化染色示,纤维环穿刺组Ⅱ型胶原表达随时间呈进行性下降,从术后第2周开始两组差异有统计学意义(P<0.05).结论:纤维环穿刺法可以诱导兔椎间盘缓慢退变,为深入研究椎间盘退变机制及治疗手段提供可靠的动物模型.     

组织工程椎间盘纤维环种子细胞的培养和鉴定

目的建立兔椎间盘纤维环细胞体外培养体系,为组织工程椎间盘纤维环的研究提供种子细胞。方法采用酶消化法分离兔椎间盘纤维环细胞,进行单层培养,观察其形态结构和生物学特性,通过甲苯胺蓝、免疫细胞化学染色等方法对其细胞表型进行鉴定。结果成功进行细胞单层培养,细胞形态为圆形或多角形;原代细胞生长较慢,第一代细胞生长加快;细胞具有甲苯胺蓝异染性;有I、Ⅱ型胶原的阳性表达。结论成功培养兔椎间盘纤维环细胞,表型鉴定符合纤维环细胞特征,能够为组织工程椎间盘纤维环的研究提供种子细胞。     

白藜芦醇通过影响线粒体膜电位诱导HepG2细胞凋亡

目的 研究白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的机制,探讨白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡过程中线粒体膜电位的变化。方法采用MTT法测定白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制作用,通过荧光染色及流式细胞术检测细胞凋亡,电子显微镜观察细胞超微结构的变化,用Rhodaminel23和TMRE标记细胞线粒体膜电位（△ψ）,并分别通过流式细胞仪和共聚焦激光扫描显微镜检测。结果低浓度白藜芦醇（≤25μmoFL）对HepG2细胞的生长抑制作用不显著,而高浓度白藜芦醇（〉25μmol／L）显著地抑制HepG2细胞的生长,且呈时间和浓度的依赖性（F=18．532,P〈0．05）;流式细胞术分析显示,白藜芦醇能显著诱导HepG2细胞凋亡,且呈浓度依赖性（P〈0．05）;白藜芦醇能降低HepG2细胞线粒体膜电位。结论白藜芦醇抑制HepG2细胞增殖,并诱导细胞凋亡,白藜芦醇使HepG2细胞线粒体膜电位去极化,提示线粒体膜电位去极化在白藜芦醇诱导细胞凋亡的过程中起作用。     

种植于硅橡胶膜上的大鼠纤维环细胞的表型特征研究

目的:比较种植于硅橡胶膜或塑料培养板的大鼠纤维环细胞的表型特征. 方法:利用倒置相差显微镜及透射电镜观察种植于不同基质的大鼠纤维环细胞形态的变化;利用甲苯胺蓝染色观检测蛋白多糖的表达情况;通过RT-PCR法检测Ⅰ,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA的表达情况;采用流式细胞术观察细胞表面整合素β1的表达情况;同时检测了纤维环细胞在硅橡胶膜上的黏附情况. 结果:种植于不同基质的纤维环细胞形态学观察无明显差别;在两种基质上的纤维环细胞甲苯胺蓝染色无差异;Ⅰ,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA及细胞膜整合素β1的表达亦无明显差异;纤维环细胞可以黏附于硅橡胶膜上生长. 结论:种植于硅橡胶膜上的纤维环细胞表型特征无改变,为进一步研究力学刺激对纤维环细胞的影响提供实验基础.     

新型组织工程椎间盘纤维环支架材料的制备和形态学观察

目的 探讨脱矿脱细胞骨基质环结构特点是否适合用于构建组织工程椎间盘纤维环细胞支架.方法 取兔股骨近端骨制成环状,经改进的脱矿脱细胞方法处理并制成支架材料,进行大体、光镜、电镜观察并测量平均孔径.结果 材料为环状,质地柔韧,多孔结构;HE染色光镜观察显示支架材料为嗜酸性,为不均匀的多孔结构;扫描电镜观察发现支架材料为相互沟通的多孔结构,平均孔径为99μm.结论 脱矿脱细胞骨基质环结构特点适合作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架材料.     

雷公藤甲素通过依赖于caspase的线粒体途径促进子宫内膜癌细胞凋亡

目的:研究雷公藤甲素对子宫内膜癌HEC-1B细胞生长和凋亡的调节作用,探讨其促进子宫内膜癌细胞凋亡的作用途径?方法:①细胞增殖/毒性检测试剂(CCK-8)测定雷公藤甲素对HEC-1B细胞的生长抑制作用及加入caspase抑制剂(z-VAD-fmk)后对其作用的影响;②Western blot法检测用药后caspase-3?9和bcl-2蛋白表达情况及z-VAD-fmk对caspase-3?9蛋白表达的影响?结果:CCK-8比色法显示雷公藤甲素对子宫内膜癌HEC-1B细胞的生长有明显的抑制作用,且存在时间和浓度依赖性(P < 0.01),在48?72 h作用效果明显?加入z-VAD-fmk后,雷公藤甲素对HEC-1B细胞生长抑制作用显著下降但仍高于对照组(P < 0.01)?Western blot结果同样证明加入z-VAD-fmk后,caspase-3?9蛋白的表达有一定的减弱但仍高于对照组(P < 0.05);同时随着药物浓度的增加,caspase-3?9蛋白表达逐渐升高,bcl-2蛋白表达逐渐降低(P < 0.05)?结论:雷公藤甲素对子宫内膜癌HEC-1B细胞的生长有明显的抑制作用,通过依赖于caspase的线粒体凋亡途径促进子宫内膜癌HEC-1B细胞凋亡?     

兔椎间盘纤维环细胞单层和立体培养条件下细胞表型的比较

目的 观察单层培养和藻酸盐立体培养对兔椎间盘纤维环细胞基因表达的影响.方法 10只新西兰大白兔腰椎椎间盘纤维环细胞经体外单层培养扩增后取第一代细胞分别同时行单层培养和藻酸盐立体培养1周,通过实时RT-PCR检测细胞Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因不同的表达情况.结果 在相差显微镜下,单层培养的椎间盘纤维环细胞呈贴壁生长的梭形或多角形细胞,其Ⅰ型胶原基因表达最高,Ⅱ型胶原基因表达其次,蛋白聚糖基因表达最低,符合成纤维细胞的细胞表型.而在藻酸盐凝胶珠内,同样的纤维环细胞呈圆形,被一层藻酸盐凝胶膜囿于凝胶珠内,其Ⅰ型胶原,Ⅱ型胶原基因表达明显下降,而蛋白聚糖基因明显升高,成为该培养条件下纤维环细胞表达最高的基因.结论 藻酸盐立体培养对兔椎间盘纤维环细胞维持软骨样细胞基因表型具有一定作用.     

姜黄素氧化损伤线粒体诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的探讨姜黄素诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的机制。方法 80μmol/L姜黄素作用于肝癌细胞后,用流式细胞仪检测细胞过氧化氢(H2O2)、线粒体膜电位和细胞亚二倍体凋亡峰情况;比较姜黄素组和预处理组(姜黄素联合过氧化氢酶)线粒体膜电位和细胞亚二倍体凋亡峰变化情况。结果 80μmol/L姜黄素作用于肝癌细胞1、2、3h后检测H2O2分别为(13.49±3.23)%、(52.43±6.04)%、(48.21±7.18)%,以2h时间点最高。细胞线粒体膜电位在6、12h分别为(59.68±4.47)%、(29.83±6.22)%,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞亚二倍体凋亡峰在24、48h分别为(26.53±4.28)%、(39.50±6.14)%,差异有统计学意义(P<0.01)。过氧化氢酶均能抑制上述2项指标改变,差异有统计学意义(P<0.05)。结论姜黄素作用肝癌细胞后产生H2O2,H2O2损伤细胞线粒体,呈时间依赖性诱导肝癌细胞凋亡。     

昆明山海棠碱通过线粒体途径诱导Jurkat淋巴瘤细胞株细胞凋亡

目的 研究昆明山海棠碱通过线粒体途径诱导细胞凋亡的作用。方法 THH碱多剂量多时间点诱导Jurkat细胞后，采用Western blotting检测细胞内Bcl-2表达的含量、采用JC—1原位染色方法、细胞免疫化学和流式细胞术等手段在单细胞水平分析细胞线粒体膜Apo2．7分子以及线粒体膜电位(△Ψm)的变化。结果 THH碱诱导后Bcl-2蛋白表达下调，线粒体膜电位明显下降，线粒体膜Apo2．7蛋白分子表达显著增加。结论 THH碱可通过线粒体途径诱导Jurkat T淋巴瘤细胞株发生凋亡，并且Bcl—2蛋白参与了线粒体凋亡功能的启动。     

扶正抑瘤颗粒对小鼠肝癌H22细胞凋亡率及线粒体膜电位的影响

目的:观察扶正抑瘤颗粒对小鼠肝癌H22细胞凋亡率及线粒体膜电位的影响。方法:48只荷瘤小鼠随机分为模型组、环磷酰胺治疗组、扶正抑瘤颗粒大剂量治疗组和扶正抑瘤颗粒小剂量治疗组,分别予以相应药物治疗14 d。碘化丙啶染色,流式细胞术检测各组小鼠肝癌H22细胞的凋亡率。采用荧光探针罗丹明123负载,激光扫描共聚焦显微镜下观察H22细胞的荧光强度,分析H22细胞线粒体膜电位的大小。结果:扶正抑瘤颗粒可以提高小鼠肝癌H22细胞的凋亡率,降低H22细胞的线粒体膜电位,与模型组比较,差异有统计学意义。结论:扶正抑瘤颗粒的抗肿瘤机制可能与降低肿瘤细胞线粒体膜电位,诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

姜黄油诱导人肝癌细胞凋亡及其机制

探讨姜黄油的抗肝癌作用及其作用机制,采用二甲基噻唑蓝比色法(MTT)检测肝癌细胞的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率以及线粒体膜电位的变化,Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9以及细胞色素C的表达。结果发现,姜黄油能时间依赖性地抑制肝癌细胞的生长,降低线粒体膜电位并诱导其凋亡;升高细胞内Bax与Bcl-2的比值;诱导细胞色素C从线粒体中的释放并激活caspase-9和caspase-3。结果提示姜黄油可能通过线粒体途径诱导肝癌细胞的凋亡。     

替尼泊苷和洛莫司汀诱导脑胶质瘤细胞凋亡的机制

 目的 为探讨化疗药物替尼泊苷、洛莫司汀在脑胶质瘤化疗过程中诱导细胞凋亡的作用机制,以对其临床中的疗效进行有效监控。方法 取40例脑胶质瘤组织,分离培养胶质瘤细胞,加替尼泊苷和洛莫司汀,干预24、48、72 h时分别用流式细胞术（flow cytometre,FCM）测定脑胶质瘤细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）、细胞周期和Bcl-2/Bax水平,并进行趋势性分析。结果 随着化疗药物干预时间的延长,MMP降低的比例迅速上升、细胞周期凋亡峰比例上升,Bcl-2表达下降,Bax表达大幅上升,Bcl-2/Bax比值下降。结论 替尼泊苷和洛莫司汀在脑胶质瘤化疗过程中诱导细胞凋亡的效果显著,VM-26对细胞周期的作用更强,在凋亡检测指标中MMP为最敏感、快捷的检测指标。     

EGCG活化线粒体途径诱导人胃癌细胞凋亡

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)通过活化线粒体途径诱导人胃癌BGC823细胞凋亡的作用机制.方法 MTT法检测EGCG对BGC823细胞生长的影响;PI染色流式细胞术(FCM)分析测定细胞凋亡率;细胞线粒体跨膜电位(△(Ψ)m)用荧光染料罗丹明123染色FCM分析测定;Westem blot检测线粒体凋亡信号传导通路相关蛋白的表达.结果 EGCG对BGC823细胞生长有显著抑制作用,呈时间和剂量依赖性.EGCG以剂量依赖方式诱导BGC823细胞凋亡.EGCG(20μg/mL、40 μg/mL、80μg/mL)作用48 h后,BGC823细胞中△(Ψ)m降低,细胞色素c(Cyt c)释放增加,caspase-9蛋白表达增加,呈剂量依赖性.结论 EGCG通过活化线粒体信号传导途径诱导BGC823细胞凋亡.     

小檗碱通过ROS及caspase通路对肝癌HepG2细胞凋亡的作用

目的 探究小檗碱(BBR)对肝癌HepG2细胞的增殖抑制及作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度(0、10、20、40、80 μmol/L) BBR对肝癌HepG2细胞的抑制作用;采用Hoechst 33342染色观察处理后HepG2细胞形态学变化;用流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡率;间接荧光标记法检测BBR对细胞内活性氧簇(ROS)水平的影响;JC-1染色法检测细胞内线粒体膜电位的变化;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、caspase-3、Cleaved-caspase-3的表达变化.结果 MTT法显示BBR可呈剂量、时间依赖性抑制肝癌HepG2细胞活力(P＜0.05);Hoechst 33342染色发现细胞形态发生明显变化,0μmol/L BBR处理的细胞呈淡蓝色,处理组细胞核固缩,形成凋亡小体,细胞凋亡率与药物浓度呈正相关(P＜0.05).流式细胞术发现BBR能使细胞内ROS升高,线粒体膜电位水平下降.Western blot法显示随着药物浓度升高,Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-聚腺苷二磷酸核糖聚合酶表达增强,Bcl-2蛋白表达降低,凋亡相关蛋白caspase-3表达下降.结论 BBR在体外可能通过增加ROS、提高促凋亡蛋白Bax并激活caspase-3表达抑制肝癌HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡.     

Quercetin in combating H2O2 induced early cell apoptosis and mitochondrial damage to normal human keratinocytes

Background Oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of epidermal diseases. This study aimed to investigate the effects of quercetin on the anti-oxidative response and on mitochondrial protection in cultured normal human keratinocytes. Methods Cultured HaCaT cells were treated with different concentrations of H202 （0, 50, 100, 250, 500 pmol/L） for different periods of time （0.5, 1, 2, 4 hours） to establish an oxidative stress model. The cultured HaCaT cells were randomly assigned to control, H2O2, and quercetin＋H2O2 groups. For the quercetin groups, the cells were treated with different concentrations of quercetin （0, 10, 25, 50 umol/L） before exposure to H2O2. Morphological changes of the cells were observed under an inverted microscope and an electron microscope. The cell viability was detected by the MIF method. The cell apoptosis （AnnexinV/propidium iodide double stain） and mitochondrial membrane potential （△ψm） changes were detected by flow cytometry. Results An oxidative stress model of HaCaT cells was established under a suitable concentration （250 umol/L） and treated time of H2O2 （2 hours）. The cell viability and △ψm decreased in a concentration-dependent and time-dependent manner while the percentage of apoptotic cells significantly increased in the H2O2 groups compared with the control group （P 〈0.05）. The cell viability and △ψm of the quercetin treated group increased （P 〈0.05） and the percentage of apoptotic cells decreased at concentrations of 1-50 umol/L quercetin （P 〈0.01） compared with H2O2 treated group. Conclusion Quercetin can relieve the cell damage and apoptosis from H2O2 induced injury to HaCaT cells by anti-oxidation and mitochondrial protection.     

姜黄素激活线粒体凋亡通路诱导肝癌细胞Huh7凋亡

目的 观察姜黄素对肝癌细胞Huh7中Bcl-2家族成员表达,cytochrome c胞内定位以及caspase-3活化的影响,探讨姜黄素诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。方法 Western blotting分析姜黄素处理Huh7细胞后Bcl-2,Bcl-xL,Bad,Bid,Beclin,Bag-1和caspase-3蛋白表达的变化;间接免疫荧光技术观察在姜黄素干预后Bad和cytochrome c蛋白的定位及变化。结果 25 μmol•L-1的姜黄素明显上调Huh7细胞中Bad的表达水平,但是对Bcl-2,Bcl-xL,Bid,Beclin和Bag-1的表达并无显著影响。同时,姜黄素能够促使cytochrome c从线粒体释放至胞浆中,以及诱导caspase-3的活化。结论 姜黄素通过激活线粒体凋亡通路诱导肝癌细胞Huh7凋亡。     

PUVA对HL-60细胞凋亡及线粒体膜电位的影响

[目的]研究补骨脂素（PSO）加长波紫外线（UVA）光化学疗法（PUVA）对人白血病细胞HL-60凋亡及线粒体膜电位的影响。[方法]HL-60细胞接受或不接受UVA照射后,在不同浓度PSO培养,电镜下观察细胞超微结构改变,流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化,多因素方差分析法进行统计学处理。[结果]PUVA处理后的HL-60细胞超微结构出现明显的凋亡形态;PSO、UVA照射及PUVA在作用后24 h均可使细胞凋亡率增加,ΔΨm下降,对照组、80μg/mL PSO组、5 m in UVA组及PUVA（80μg/mL PSO＋5 m in UVA）组凋亡率分别为（10.60±0.31）%、（26.94±0.26）%、（28.53±0.05）%、（37.72±0.09）%;线粒体膜电位水平分别为388.47±6.35、173.17±10.89、200.00±2.91以及71.83±9.47,各组间P〈0.01,PUVA的作用明显强于前两者。[结论]PUVA可诱导人白血病细胞HL-60发生凋亡,诱导凋亡的途径之一为下调线粒体膜电位。     

蜂毒肽通过线粒体凋亡途径促进皮肤鳞状细胞癌A431细胞株对5-FU的敏感性

目的探究蜂毒肽通过线粒体凋亡途径促进皮肤鳞状细胞癌A431细胞株对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性机制。方法筛选蜂毒肽作用于A431细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀),并用于后续干预浓度。将A431细胞随机分为对照组(不干预)、蜂毒肽组(0.5 μmol/L蜂毒肽)、5-FU组(0.25 μmol/L 5-FU)和联合组(0.5 μmol/L蜂毒肽+0.25 μmol/L 5-FU)。检测各组A431细胞在24、48、72 h细胞活性、72 h细胞周期占比,以及细胞凋亡率及细胞线粒体凋亡蛋白(Smac)、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、细胞色素C(Cyt C)、促凋亡蛋白(Bax)的蛋白表达量。采用裸鼠荷瘤实验观察各组细胞的肿瘤生长抑制率。结果与对照组相比,不同时间点下蜂毒肽组、5-FU组、联合组的细胞存活率降低(P＜0.05);与蜂毒肽组和5-FU组相比,不同时间点下联合组的细胞存活率降低(P＜0.05)。与对照组比较,蜂毒肽组、5-FU组、联合组的细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例、Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表达增加(P＜0.05);与蜂毒肽组和5-FU组相比,联合组的细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例、Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表达增加(P＜0.05)。与对照组比较,蜂毒肽组、5-FU组、联合组的S期与G2/M期细胞比例降低(P＜0.05);与蜂毒肽组和5-FU组比较,联合组的S期与G2/M期细胞比例降低(P＜0.05)。与蜂毒肽组和5-FU组比较,联合组肿瘤生长第30天的肿瘤生长抑制率升高(P＜0.05)。结论蜂毒肽可增强人皮肤鳞状细胞癌A431细胞对5-FU的敏感性,蜂毒肽和5-FU联合使用可将A431细胞周期有效阻滞在G0/G1期,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,其机制可能与激活线粒体凋亡途径有关。