多基因修饰小鼠诱导多潜能干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的观测胰岛素转录关键调控因子胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX-1)、神经分化因子1(NeuroD1)及肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)对小鼠诱导多潜能干细胞(iPS细胞)分化为胰岛素分泌细胞的作用。方法筛选鉴定小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程的iPS细胞。以重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP联合感染小鼠iPS细胞,体外培养后以RT-PCR检测胰岛B细胞功能基因表达;免疫荧光检测胰岛素蛋白表达及定位;ELISA检测不同糖浓度(0、5、10、20、30、40mmol/L)下胰岛素的分泌量。结果起源于MEFs的iPS细胞能形成边缘光整的致密克隆,表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织,显示MEFs被成功地重编程为iPS细胞。Ad-PDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP感染的小鼠iPS细胞能分化为胰岛类B细胞,RT-PCR结果显示其胰岛B细胞功能基因的表达与小鼠胰岛B细胞株MIN6相似。免疫荧光检测可见胰岛类B细胞内有胰岛素表达。ELISA检测结果显示胰岛类B细胞对不同浓度葡萄糖有较好的反应性。结论胰岛素转录关键调控因子PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用,使小鼠iPS细胞分化为具有显著胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。     

Reprogramming of adult human neural stem cells into induced pluripotent stem cells

Background Since an effective method for generating induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human neural stem cells (hNSCs) can offer us a promising tool for studying brain diseases,here we reporte...     

淫羊藿苷对人牙髓干细胞神经向分化作用的初步研究

目的 探讨淫羊藿苷（ICA）对人牙髓干细胞（DPSC）神经向分化的作用。方法 分离培养DPSCs后,采用不同浓度ICA(0.01μmol、0.10μmol、1.00μmol、10.00μmol)处理DPSCs。CCK-8法检测ICA对细胞增殖活力的影响,确定其最佳促DPSCs增殖浓度。分别进行细胞形态学观察和Nestin细胞免疫荧光检测。Western blotting检测DPSCs神经向分化相关蛋白Nestin、βⅢ-tubulin及NSE的表达。结果 不同浓度ICA细胞相对活力值比较,差异有统计学意义（P <0.05）,其中以0.10μmol ICA细胞相对活力最高。与对照组比较,ICA组神经球的直径增加（P <0.05）,Nestin荧光强度增强（P <0.05）,Nestin、βⅢ-tubulin、NSE蛋白相对表达量升高（P <0.05）。结论 ICA能够有效促进DPSCs增殖,提高DPSCs神经向分化能力。     

低氧环境可体外促进人诱导多能干细胞分化为拟胚体

目的 探讨人诱导多能干细胞向拟胚体分化过程中,生理性低氧环境在拟胚体悬浮和贴壁阶段的影响及其相关机制。方法 本研究中拟胚体悬浮阶段分为悬浮常氧组（21% O2）和悬浮低氧组（5% O2）,贴壁阶段分为贴壁常氧组（21% O2）、贴壁低氧组（5% O2）、贴壁低氧组＋HIF-1α抑制剂Echinomycin。首先采用免疫荧光法鉴定人诱导多能干细胞的多能性,人诱导多能干细胞消化后分别在21%氧气和5%氧气条件下悬浮培养5 d,利用显微镜观察悬浮阶段拟胚体的形成和形态变化,5 d后检测拟胚体中三胚层标记基因的表达情况。接着分别取等量的拟胚体接种到明胶包被的培养皿,继续在21%和5%氧气条件下培养2 d,观察贴壁阶段拟胚体的粘附性能和粘附后向外周扩增速度的差异,检测低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达情况,随后在5%氧气条件下使用HIF-1α特异性抑制剂Echinomycin后,再次检测低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达情况。结果 常氧组和低氧组的拟胚体均具有三胚层分化的潜力。与常氧培养组相比,低氧组悬浮拟胚体周围的凋亡碎片明显减少,且较早出现囊性拟胚体,获得的拟胚体大小更加均匀一致。此外,低氧组的拟胚体贴壁数量明显高于常氧组（P<0.05）,拟胚体贴壁后向外生长的速度明显快于常氧组（P<0.05）。低氧组HIF-1α的mRNA未显著上调（P>0.05）,而β-catenin和VEGFA的mRNA显著上调（P<0.05）;在蛋白质水平,低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达均上调（P<0.05）。低氧组使用HIF-1α特异性抑制剂Echinomycin后,低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的蛋白质表达均下调（P<0.05）。结论低氧条件不影响拟胚体的三胚层分化潜力。生理性低氧可以促进悬浮拟胚体的形成和成熟,并且能增强拟胚体的贴壁和贴壁后增殖性能,初步证实通过激活HIF-1α/β-catenin/VEGFA信号通路,提升人诱导多能干细胞的分化能力。     

肾上腺髓质素对人牙髓干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨肾上腺髓质素（adrenomedullin,ADM）对人牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）增殖、成牙本质分化能力的影响。方法 体外培养的人DPSCs传至第3代,培养液中加入不同浓度ADM（10^-6、10^-7及10^-8 mol/L）处理细胞24 h,并设置空白对照组。流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,定量PCR和蛋白质印迹法检测成牙本质分化标记物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的mRNA及蛋白表达。结果 细胞周期检测结果显示,3种浓度ADM干预DPSCs后G₂/S/M期细胞比例均较空白对照组上升（P<0.05）,但各干预组间差异无统计学意义; 细胞凋亡检测结果显示,3种浓度ADM干预组的Annexin Ⅴ⁺/PI^-标示细胞比例均较空白对照组下降（P<0.05）,但各干预组间差异无统计学意义; 定量PCR及蛋白质印迹检测结果显示,DPSCs中ALP mRNA及蛋白表达较空白对照组上升（P<0.01）,但各干预组间差异无统计学意义。结论 ADM具有促进DPSCs的增殖、抑制凋亡及促其向成牙本质分化的作用。     

诱导性多潜能干细胞的研究进展与应用

分化成熟的体细胞可在体外被重编程为诱导性多潜能干细胞,后者具有与胚胎干细胞相似的自我更新能力和发育多潜能性,同时避免了免疫排斥和伦理问题.患者特异性的诱导性多潜能干细胞将成为再生医学、药物筛选和毒理测试的理想工具.     

猪诱导多能干细胞可定向分化为前脑GABA能神经元前体

目的 探讨猪诱导多能干细胞（iPSCs）体外定向分化为GABA能神经元前体的方法体系。方法 猪iPSCs诱导分化为GABA能神经元前体遵循两个阶段,第1阶段,猪iPSCs悬浮培养,第3天时形成类胚体,采用神经诱导培养基NIM（SB431542、DMH1、FGF2）继续诱导,第12天分化为原始神经上皮细胞。第2阶段,使用含Pur、B27的NIM培养基悬浮培养形成神经球,至第21天时形成GABA能神经元前体。CM-DiI标记后,定向移植帕金森（PD）模型大鼠黑质纹状体,检测其在宿主脑内存活、迁移及分化状况。结果 猪iPSCs在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性标记OCT4、Nanog、SSEA1和TRA-160,并且核型分析显示没有其他物种来源细胞污染。第12天经诱导分化获得原始神经上皮细胞能够形成玫瑰花环结构,并表达其表面标记物（PAX6、SOX2 和 Nestin）与神经微管蛋白标志物 Tuj1。第 21 天诱导细胞高表达 GABA 能神经元前体的表面特异性抗原NKX2.1和前脑标志物FOXG1。移植8周后,体内可分化为GABA能神经元与多巴胺能神经元,明显改善PD大鼠运动行为。结论 结合无血清培养基筛选法逐步定向诱导猪iPSCs高效分化为前脑GABA能神经元前体,移植后能够显著改善PD大鼠的运动功能障碍,为诱导GABA能神经元前体移植治疗神经损伤疾病奠定基础。     

SOX2对牙髓干细胞神经分化的促进作用及其意义

目的：探讨转录因子SOX2对牙髓干细胞（DPSCs）神经分化的影响,为研究DPSCs神经分化的机制提供依据。方法：从人源第三磨牙牙髓中分离DPSCs（DPSCs组）,通过逆转录病毒感染方法构建过表达SOX2的DPSCs（DPSCs-SOX2组）,以空白载体感染的DPSCs作为对照组（DPSCs-vector组）,采用神经分化培养基诱导各组DPSCs分化为神经前体细胞（NPCs）。采用CCK-8法分析各组NPCs的增殖指数（PI）;采用qPCR和流式细胞术检测各组NPCs中Nestin和Pax6基因的表达水平;采用免疫荧光和流式细胞术分析各组NPCs在神经元分化方面的能力和分化后β3-Tubulin的表达效率。结果：通过神经分化培养基的定向诱导,正常DPSCs、DPSCs-vector和DPSCs-SOX2均可通过分化形成NPCs,但DPSCs-SOX2组NPCs的PI和NPCs中Nestin和Pax6表达水平明显高于DPSCs组和DPSCs-vector组（P<0.05）;DPSCs-SOX2组NPCs在神经元分化方面也具有一定的优势,分化后细胞的β3-Tubulin表达效率明显高于其他2组（P<0.05）。结论：SOX2对DPSCs的神经分化具有一定的促进作用。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

地中海贫血患者来源外周血及脐带血细胞诱导式多能干细胞的建系和造血分化

目的：探讨地中海贫血（地贫）患者特异诱导式多能干细胞系（ iPSCs）细胞模型的建立及造血分化能力。方法采集HbH病引产胎儿（α地贫）的脐带血、双重杂合子β地贫输血患者（基因型为IVS－Ⅱ－654／CD17）外周血各1例,分离单核细胞后进行短期培养,核转染再程序化为iPSCs,检测iPSCs未分化状态和多能性标志物。 iPSCs与OP9细胞共培养向造血干细胞诱导分化,进行吉姆萨染色检查和流式细胞术检测造血干细胞的分化结果。结果地贫患者iPSCs表达干细胞多能性标志物Oct4、SSEA4、Tra－1－60、Tra－1－81,碱式磷酸酶染色阳性,悬浮培养可以形成类球形拟胚体,畸胎瘤形成实验显示地贫患者iPSCs可分化为内、中、外胚层细胞。流式细胞术检测结果显示CD34＋细胞分别为8.71％（α－iPSCs分化结果）和4.46％（β－iPSCs分化结果）。结论α、β地贫患者外周血与脐带血可再程序化为 iPSCs,该细胞系具有多能分化特性,与OP9共培养能分化为造血干细胞。     

人脱落乳牙牙髓干细胞与人恒牙牙髓干细胞成骨分化及破骨能力的差异

目的比较处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞（SHED）和恒牙牙髓干细胞（DPSCs）的成骨分化及破骨能
力,探讨两者在成骨和破骨相关分子的表达情况。方法体外分离、培养和纯化处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干
细胞与恒牙牙髓干细胞;两种干细胞在成骨诱导14 d 和21 d,分别进行ALP染色、茜素红染色,并通过Real-time PCR检测
SHED和DPSCs矿化诱导后的成骨与破骨相关基因表达。结果倒置显微镜下观察,SHED和DPSCs形态均为长梭形;两种干
细胞经矿化诱导后,茜素红染色可见SHED的矿化结节计数多于DPSCs（P<0.05）,SHED的ALP活性亦强于DPSCs（P<0.05）。
RT-PCR检测结果显示,经矿化诱导后两种干细胞均表达成骨与破骨相关基因Runx2、OCN、ALP、OPG和RANKL,但DPSCs的
Runx2、OCN 和ALP的表达水平均低于SHED（P<0.05）,且SHED反应细胞破骨/成骨能力的RANKL/OPG 的比值显著高于
DPSCs（P<0.05）。结论与DPSCs相比,SHED不仅具有较强的成骨分化能力,还兼有较强的破骨能力,为SHED参与生理性根
吸收骨改建的调控机制提供实验依据。
     

羊水中多能性干细胞的培养及分化

羊水中存在多能性干细胞,它们不仅阳性表达胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)表面标志物,如SSEA-4,保持未分化状态的转录因子OCT-4,胚胎多能性维持因子Nanog等;而且阳性表达成人干细胞(adult stem cell,ASC)表面标志物CD29和CD44等,在特定的诱导条件下能够分化为代表三胚层生殖层系。     

小鼠牙髓干细胞培养及诱导分化

目的 :分离、培养小鼠牙髓干细胞并诱导分化 .方法 :采用酶消化培养法获得小鼠的单个牙髓细胞悬液 ,细胞密度调整为 1× 10 4/孔细胞 ,用 2 0 0mL·L -1胎牛血清的α MEM培养液培养 14d ,挑出细胞克隆消化传代 ,TGF β、BMP2 、bFGF细胞因子诱导 ,PCR检测DSPP的mRNA的表达 .结果 :小鼠牙髓细胞呈集落状生长 ,克隆形成率为 1.6 -2 .5个 / 10 4细胞 ,所形成的集落细胞结合紧密 ,细胞体积小、胞核大 ,经细胞因子刺激后的细胞表达DSPP的mRNA .结论 :培养的小鼠牙髓集落状生长的细胞具有干细胞增殖快等特性 ,细胞因子可诱导小鼠牙髓干细胞定向分化     

全反式维甲酸促进多能干细胞向间充质干细胞样细胞分化

目的探索全反式维甲酸(RA)和SB431542对胚胎干细胞(ES)及诱导多能干细胞(i PS)分化为间充质干细胞(MSC)样细胞的影响。方法将培养的鼠ES和i PS根据不同的分化条件分为对照组、SB431542组及RA不同浓度组,对照组为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)完全培养基,SB431542组为DMEM完全培养基中含10μmol·L-1SB431542,RA不同浓度组的DMEM中分别含0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA。分化培养4 d后观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物CD105和干细胞抗原1(Sca-1)的表达,以CD105+细胞和Sca-1+细胞的比例确定i PS和ES向MSC分化的程度。结果小鼠ES和i PS在ESGRO-2i培养基里生长较好。ES分化4 d后,对照组和SB431542组ES和i PS分化成内皮样细胞,在含有不同浓度RA的培养基中ES和i PS可有效分化为纤维状细胞。ES分化4 d后,SB431542组Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),CD105+细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在RA 0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA组中,ES分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P<0.05),Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),但与SB431542组比较显著降低(P<0.05);0.20 nmol·L-1RA组的CD105+和Sca-1+细胞比例显著高于0.05、0.10、0.40 nmol·L-1RA组(P<0.05)。i PS分化4 d后,SB431542组CD105+细胞和Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05)。0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA组中,i PS分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P<0.05),Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),但与SB431542组比较均显著降低(P<0.05);0.20 nmol·L-1RA组Sca-1+细胞比例显著高于0.05、0.10、0.40 nmol·L-1RA组(P<0.05),0.20 nmol·L-1RA组CD105+细胞比例显著高于0.05、0.10 nmol·L-1RA组(P<0.05),但与0.40 nmol·L-1RA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用RA可以促进ES和i PS向MSC样细胞分化,分化方法较为简单,分化周期较短,为多能干细胞向MSC样细胞的分化提供了一定的方法基础。     

氯化锂对牙髓干细胞增殖与分化的影响

目的 检测氯化锂对人牙髓干细胞（dental pulp stem cells, DPSCs)细胞增殖与分化的影响。方法 收集18~25岁患者因正畸拔除的健康完整前磨牙或智齿,用改良组织块法分离培养牙髓干细胞;利用免疫荧光染色与流式细胞术对分离培养的细胞进行细胞来源鉴定;利用细胞计数试剂盒（CCK-8）测定不同浓度氯化锂对牙髓干细胞增殖的影响,选择适宜浓度的氯化锂对牙髓干细胞进行矿化诱导培养,利用茜素红染色观察矿化结节形成以及荧光定量PCR实验研究氯化锂对牙髓干细胞分化的影响。结果 流式细胞术及免疫组化染色结果显示原代人牙髓干细胞来源与标志物与间充质干细胞表现一致;CCK-8法检测结果表明2.5mmol/L的氯化锂对牙髓干细胞增殖具有促进作用;选用该浓度下的氯化锂对牙髓干细胞进行矿化诱导培养,茜素红染色与荧光定量PCR结果显示,氯化锂对牙髓干细胞牙向分化具有促进作用。结论 一定浓度的氯化锂对牙髓干细胞细胞增殖与细胞分化具有促进作用。     

将成人神经祖细胞重编程为诱导多能干细胞

Since an effective method for generating human neural precursor (NP) cells induced iPS cells can offer us a promising tool for studying human brain diseases, here we report direct reprogramming of adult human NP cells into iPS cells by retroviral transduction using four defined factors. NP cells were successfully isolated and cultured from the hippocampus tissue of epilepsy patients. When combined with four factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc), iPS cell colonies were successfully obtained. Morphology, gene expression, and epigenetic status confirmed that these hNP-derived iPS cells exhibited ESC-like properties, including the ability to differentiate into all three germ layers both in vitro and in teratomas. Hence, our optimized method would be useful for generating human iPS cells from hNP cells and provide an important tool for studying neural system diseases.     

生物钟基因Clock对小鼠诱导性多能干细胞分化的影响

 目的  研究生物钟基因Clock对小鼠诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)非定向分化的作用。方法  将Teto-FUW-OSKM、M2rtTA、PsPAX2 和PMD2.G 4种质粒共转染293FT细胞,收集病毒上清,转染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)获得小鼠iPSC,并通过检测多能性基因表达及其体外分化能力对小鼠iPSC进行鉴定;通过RT PCR检测小鼠iPSC在非定向分化和拟胚体形成过程中生物钟基因的表达,以及生物钟基因Clock下调后,与野生型细胞相比小鼠iPSC多能性基因的表达和形态学改变。结果  通过慢病毒感染MEF的方式获得了小鼠iPSC;小鼠iPSC在非定向分化过程中,生物钟基因Clock、Per2、Rev-erbα表达升高;生物钟基因Clock下调后,小鼠iPSC分化能力下降,多能性基因Sox2、Oct4、Klf4表达升高。结论  生物钟基因Clock对小鼠iPSC的非定向分化起到重要作用。     

Induced pluripotent stem cells and hepatic differentiation

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are generated by reprogramming somatic cells to a pluripotent state by the introduction of specific factors. They can be generated from cells of different origins, such as fibroblasts, keratinocytes, hepatocytes, and blood. iPSCs are similar to embryonic stem cells (ESCs) in several aspects, such as morphology, expression of pluripotency markers, and the ability to develop teratoma that contains tissue from three germ layers. In addition, iPSCs can undergo tridermal differentiation, including hepatic specific lineages. Considering that iPSCs could be a source of hepatocyte regeneration, iPSC-based therapy has been widely implicated in the treatment of liver disease and hepatic regeneration. In the present review, we discuss the therapeutic potential of iPSCs in hepatic repair and focus on the clinical applications of iPSCs.     

脂肪组织源性干细胞分步诱导分化为神经元样细胞

目的探讨脂肪组织源性干细胞(ADSCs)诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法 ADSCs分离自雄性SD大鼠附睾脂肪垫,差速贴壁法纯化ADSCs,传至第3代培养细胞行流式细胞术行表型鉴定(CD106,CD11b,CD45,CD90,CD29,CD49d),并进行成脂诱导。取鉴定后的ADSCs用分步诱导法,即先用含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)、2%B27的DMEM/F12培养基I培养,诱导其向神经干细胞转分化,再用含10 ng/ml胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),10 ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF),1μmol/L维甲酸(RA)的培养基II诱导分化为神经元样细胞(NLCs),免疫细胞化学法鉴定细胞表面标记物巢蛋白(nestin),神经细胞特异性标志微管相关蛋白(MAP2),神经元核蛋白(NeuN)。结果分离纯化的ADSCs CD90、CD29表达强阳性;成脂诱导分化后细胞油红O染色阳性;ADSCs经培养基I培养7 d后聚集成球样细胞团悬浮于培养液中,表达nestin;继而用培养基II诱导分化4 h后细胞球逐渐贴壁,球周边少数细胞向外发出突起,形似神经元,MAP2、NeuN均呈阳性。结论特定条件下,ADSCs在体外可被逐步诱导分化为NLCs。