P300/CBP相关因子在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的：检测P300/CBP相关因子（P300/CBP-associated factor,PCAF）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）中的表达情况,分析其与肝癌临床病理特征之间的相关性。方法：收集40例HCC及对应癌旁组织,运用RT-PCR、免疫组化技术检测PCAF在肝癌及对应癌旁组织中的表达情况,研究PCAF蛋白表达与肝癌临床病理特征之间的相关性;应用Western blot技术检测人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中PCAF蛋白的表达。结果：PCAF mRNA及蛋白在肝癌组织中的表达低于对应的癌旁组织（P=0.000）;PCAF蛋白低表达与肿瘤肝内转移（rs=0.413,P=0.037）、门脉侵犯（rs=0.589,P=0.011）和高TNM分期（rs=0.513,P=0.029）相关;人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中PCAF 蛋白的表达较正常肝细胞株LO2降低（P=0.000）。结论：肝癌细胞系及肝癌组织中PCAF表达下调,且PCAF的表达下调与肝癌的恶性病理特征相关。     

下调PMEPA1表达对肝癌细胞HepG2增殖与转移的影响

目的 观察沉默前列腺跨膜雄激素诱导蛋白1(PME-PA1)对肝癌细胞HepG2增殖和迁移的影响.方法 应用qRT-PCR、免疫组化染色和Western blot方法检测PMEPA1在肝癌细胞HepG2中mRNA和蛋白表达情况.分析PME-PA1在肝细胞性肝癌(HCC)组织中的表达及其与临床病理特征的关系.使用siRNA干扰肝癌细胞HepG2中PMEPA1的表达,并应用MTT法,Transwell法检测肝癌细胞HepG2的增殖及迁移能力.结果 PMEPA1蛋白在HCC组织中表达高于正常肝组织.肝癌组织内PMEPA1蛋白表达与HCC患者肿瘤大小(P=0.0366)和淋巴结转移(P=0.0358)密切相关.与HCC患者性别、年龄、AFP水平高低、脉管浸润、组织学分级及TNM分期等均无相关性.PMEPA1-siRNA肝癌细胞HepG2 PMEPA1蛋白及mRNA表达均下调(P<0.01).siPMEPA1转染细胞增殖能力及迁移能力均降低(P<0.01).结论 PMEPA1表达可能促进HCC的增殖和迁移.     

乙型肝炎病毒复制对肝细胞Id家族表达的影响

目的：研究肝细胞中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制对分化抑制因子（inhibitor of differentiation,Id）家族表达的影响。方法：利用qRT-PCR、Western blot检测分析Id家族在HBV瞬时或稳定复制的肝癌细胞中表达水平的变化,并在HBV复制质粒PCH9-HBV1.1转染的正常肝细胞和HBV转基因小鼠肝组织细胞模型中进一步验证。将乙型肝炎病毒S蛋白（hepatitis B virus S protein,HBs）、乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein,HBc）、乙型肝炎病毒DNA聚合酶（hep－atitis B virus DNA polymerase,HBp）、乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）的过表达质粒转染HepG2细胞,检测各组与载体对照组细胞中Id家族表达水平的变化,分析比较乙肝病毒编码的4种蛋白对Id家族的调控作用。利用荧光素酶报告基因检测病毒各组分蛋白对Id蛋白启动子活性的影响。结果：瞬时转染HBV表达质粒的HepG2细胞较对照组细胞,Id1、Id3的mRNA和蛋白表达水平均降低（mRNA：t=3.952、3.189,P=0.017、0.033;蛋白：t=10.532、4.155,P=0.000、0.014）;HepG2.2.15中Id1、Id3 mRNA和蛋白的表达水平较HepG2对照组均下降（mRNA：t=5.553、7.211,P=0.005、0.002;蛋白：t=4.193、3.849,P=0.014、0.018）;HepAD38（Tet-）中Id1、Id3蛋白的表达量较 HepAD38（Tet+）组均降低（t=3.052、3.712,P=0.038、0.021）。同时,HBV的复制可以抑制LO2细胞及小鼠肝组织中Id1、Id3的表达（mRNA：t=14.564、3.281、3.489、3.495,P=0.000、0.030、0.025、0.025;蛋白：t=5.651、5.336、4.948、5.149,P=0.005、0.006、0.008、0.007）。转染HBV病毒各编码蛋白质粒的HepG2细胞中,HBc组Id1、Id3较载体对照组的mRNA表达水平降低最明显（77.7%、76.2%,F=9.945、37.528,t=6.481、10.915,P=0.000、0.000）,Western blot结果显示HBx组Id1、Id3蛋白表达量下降最明显（86.2%、68.4%,F=38.225、7.159,t=12.550、5.295,P=0.000、0.001）。双荧光素酶报告基因检测结果表明,HBc组Id1、Id3启动子活性较对照组降幅最大（62.2%、56.3%,F=16.530、5.210,t=5.442、3.222,P=0.000、0.019）。结论：乙型肝炎病毒可以抑制肝组织、细胞中Id1及Id3的表达,其中HBc对Id1、Id3 mRNA的下调最明显,HBx则对Id1、Id3 蛋白水平上的抑制作用最明显。     

乙肝病毒X蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路调控Gankyrin表达

目的：研究乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBX）对Gankyrin表达水平的影响以及Wnt/β-catenin信号通路在HBX基因调控Gankyrin表达中的作用。方法：HBX腺病毒表达载体（Ad-HBX-GFP）感染转染2种人肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721细胞,Si-HBX分子（Si-HBX oligo）用 LipofectamineTM 2000转染入HepG2.2.15细胞,用RT-PCR和Western blot法检测HBX与Gankyrin的表达情况;β-catenin腺病毒载体转染HepG2、SMMC-7721细胞,用Western blot法检测β-catenin与Gankyrin的表达情况;在沉默β-catenin表达的HepG2、SMMC-7721细胞中过表达HBX基因,Western blot法检测β-catenin与Gankyrin的表达情况。结果：①HepG2.2.15细胞中Gankyrin mRNA与蛋白表达水平均高于HepG2细胞（P＜0.05）。②HepG2与SMMC-7721细胞系中Ad-HBX-GFP组Gankyrin mRNA与蛋白表达水平均高于绿色荧光蛋白腺病毒表达载体（Ad-GFP）组（P＜0.01）。③HepG2.2.15细胞中Si-HBX组Gankyrin mRNA与蛋白表达水平均低于Si-阴性对照（Si-NC）组（P＜0.01）。④在HepG2与SMMC-7721细胞系中过表达HBX后,Ad-HBX-GFP组β-catenin的蛋白表达水平均高于Ad-GFP组（P＜0.01）。⑤在HepG2与SMMC-7721细胞系中过表达β-catenin后,β-catenin腺病毒表达载体（Ad-β-catenin-GFP）组Gankyrin的蛋白表达水平均高于Ad-GFP组（P＜0.01）。⑥在HepG2与SMMC-7721细胞系中沉默β-catenin后,过表达HBX基因,Si-β-catenin腺病毒表达载体（Ad-si-β-catenin-RFP）组与红色荧光蛋白腺病毒表达载体（Ad-RFP）组相比,Gankyrin的蛋白表达水平未见升高（P＜0.01）。结论：HBX-Wnt/β-catenin-Gankyrin信号转导通路存在与肝癌细胞中,抑制β-catenin的功能可阻遏HBX对Gankyrin的上调作用,本结果将可能为肝癌的治疗提供新的思路。     

BIRC6在肝细胞癌中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的：检测baculoviral IAP repeat-containing 6（BIRC6）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织及癌旁组织中的表达情况并探讨其在HCC中的功能。方法：收集40例HCC及对应癌旁组织,运用qRT-PCR及免疫组化染色技术检测BIRC6在HCC及对应癌旁组织中的表达情况;qRT-PCR技术检测人正常肝细胞株LO2、HCC细胞株HepG2和SMMC-7721中BIRC6 mRNA表达;应用BIRC6 siRNA转染人HCC细胞SMMC-7721,通过MTT和流式细胞仪检测转染后细胞活力和细胞凋亡变化。结果：BIRC6在HCC组织中的表达高于对应的癌旁组织（P=0.004）,HCC组织中BIRC6蛋白高表达与较大肿瘤体积（＞5 cm）和高TNM分期相关（P=0.029;P=0.002）;正常肝细胞株LO2中BIRC6 mRNA表达水平明显低于HCC细胞株HepG2和SMMC-7721（P=0.000）,下调BIRC6表达导致SMMC-7721细胞活力降低和细胞凋亡增加（P=0.000）。结论：BIRC6高表达与HCC的恶性临床病理特征相关,BIRC6在HCC中可能作为凋亡抑制因子发挥功能。     

高表达的eEF-2K基因沉默对肝细胞癌增殖、侵袭和凋亡的影响

目的：检测eEF-2K基因在肝细胞癌（HCC）组织内的表达并分析其表达水平对HCC细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法：用RT-qPCR及Western blot方法检测了64例肝癌组织及癌旁肝组织、五种HCC细胞系LM3, Hep3B, Huh7, 97H, HepG2及人正常肝细胞系 LO2中eEF-2K基因在mRNA及蛋白水平的表达。用eEF-2K 特异性siRNA沉默LM3及Hep3B细胞性中eEF-2K基因后，经qPCR检测确认。随后用CCK-8，Transwell方法与流式细胞技术检测eEF-2K基因沉默对增殖、侵袭与凋亡的影响。结果：相较癌旁组织，HCC组织内eEF-2K mRNA与蛋白表达显著上调（P＜0.05）；与正常人肝细胞系LO2相比，肝癌细胞系LM3, Hep3B, 97H, HepG2, Huh7中的eEF-2K mRNA和蛋白表达分别升高（Ｐ＜0.05）。在LM3及Hep3B细胞系中用特异性siRNA沉默eEF-2K后，与非特异性siRNA对照组相比，细胞增殖活性和侵袭能力显著降低（P＜0.05），凋亡率显著升高（P＜0.05）。TCGA数据库分析结果表明eEF-2K高表达与肝癌预后不良相关（P＜0.05）。结论：eEF-2K蛋白在肝癌组织和细胞中高表达且与预后不良相关；沉默eEF-2K后肝癌细胞增殖和侵袭能力降低并诱发凋亡，提示eEF-2K可用作HCC潜在的预后标志物和治疗靶点。     

γ-谷氨酰转移酶ⅠmRNA亚型联合甲胎蛋白mRNA检测对肝癌的诊断价值

目的：探讨γ-谷氨酰转移酶ⅠmRNA（GGTⅠmRNA）亚型和甲胎蛋白（AFP）mRNA检测对肝癌的诊断价值。方法：运用RT—PCR检测肝脏组织标本和人肝细胞株QSG-7701、人肝癌细胞株HepG2中GGTⅠmRNAA、B、C3种亚型和AFP mRNA的表达。结果：AFP mRNA在肝癌组织中的表达显著高于非癌肝组织、癌旁组织和远癌组织。GGTⅠmRNAA亚型主要在非癌肝组织中表达，B亚型主要在远癌组织、癌旁组织、癌组织中表达。人肝细胞株QSC-7701中GGTⅠmRNAC亚型阳性表达。人肝癌细胞株HepG2中AFP mRNA、GGTⅠ mRNAB亚型表达阳性。GGTⅠmRNAB亚型联合AFP mRNA诊断肝癌的阳性率可达98．0％，小肝癌的阳性率达95．2％。结论：在肝脏癌变的过程中存在着GC-TⅠmRNAA亚型向B亚型的转化，联合监测GGTⅠmRNA亚型和AFPmRNA有助于对肝癌的早期诊断。     

HBX在肝癌细胞中通过下调miR-199a增强AKT的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)调节miR-199a的表达在HBV相关性肝癌发生中的分子机制.方法 重组HBX腺病毒(Ad-HBX)感染人肝癌HepG2细胞,HBX的siRNA转染稳定表达HBV基因的人肝癌HepG2.2.15细胞,荧光定量PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、miR-199a、AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、AKT的蛋白表达水平;分别用miR-199a mimics和miR-199a inhibitor的转染肝癌细胞后,荧光定量PCR方法检测肝癌细胞中AKT的mRNA表达水平及运用Westem blot检测肝癌细胞中AKT的蛋白表达水平.结果 miR-199a在HepG2.2.15细胞中表达水平显著低于HepG2细胞,并且证实其表达下调受到了HBX的调控(P＜0.05),HepG2.2.15细胞中AKT表达水平显著高于HepG2细胞(P＜0.05),在HepG2.2.15细胞中过表达miR-199a能明显下调AKT表达水平以及在HepG2细胞中抑制miR-199a能明显上调的AKT表达水平(P＜0.05),此外,miR-199a的表达量在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低.结论 HBX可以通过miR-199a调节AKT导致HBV相关性肝癌发生.     

应用荧光定量PCR检测肝细胞癌微小转移

目的：探讨甲胎蛋白（AFP）-mRNA在肝细胞癌（HCC）患者外周血中的表达和临床意义。方法：采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-PCR）方法,检测25例HCC患者外周血中AFP-mRNA的表达。结果：HCC患者外周血中AFP-mRNA表达率显著高于肝炎和肝硬化患者（P〈0.01）。HCC患者外周血中AFP-mRNA表达与患者的肝外转移可能相关,与患者的临床分期、肿瘤直径、数目、血清AFP水平无明显相关（P〉0.05）。结论：AFP-mRNA可作为血液循环中肝癌细胞的标志物。     

膜蛋白DLK1在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

目的探讨DLK1蛋白及甲胎蛋白（AFP）在肝细胞癌（HCC）组织中表达的临床意义。方法用免疫组织化学法检测88例HCC患者肝癌组织和癌旁肝组织中DLK1及AFP的表达。结果88例HCC患者肝癌组织中DLK1蛋白阳性50例（56．8％），AFP阳性39例（44．3％）。其中在AFP阴性组中仍有高达25．0％的DLK1蛋白呈明显的阳性表达。DLK1在肝癌组织中的阳性率明显高于AFP。所有患者癌旁肝组织DLK1蛋白及AFP均为阴性。结论DLK1蛋白检测对HCC有重要的诊断价值，肝组织DLK1蛋白和AFP联合检测可以明显提高HCC的病理诊断率。