细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复软骨缺损的实验研究

[目的]通过将骨髓间充质干细胞（MCSc）诱导的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞接种到三维多孔β-磷酸三钙（β-TCP）生物陶瓷支架材料上，体外构建骨软骨复合体，探讨以β-TCP为载体建造组织工程化软骨修复骨软骨缺损的可行性。[方法]将β-TCP多孔陶瓷加工成圆柱状，并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上分别接种从犬骨髓干细胞培养成的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞，将细胞-支架复合体共同培养1周后，移植到犬关节软骨缺损处。植入后12、16周末取材，进行大体观察、组织学及组织化学等观察。[结果]复合体体内移植后，在犬关节软骨缺损处有新生软骨形成，形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。[结论]β-TCP多孔陶瓷可作为支架材料，复合细胞后具有修复软骨缺损的作用。     

残耳软骨细胞种植于聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物形成组织工程软骨

目的探讨以聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯(PHB-PHH)共聚物为细胞外支架、以残耳软骨作为种子细胞形成组织工程软骨的可能性。方法取先天性小耳畸形8例患者的残耳软骨，以胶原酶消化后种植于PHBPHH支架，体外培养1周后种植于8只裸鼠一侧背部皮下为实验组，另一侧只植入支架材料作为对照组。于4周、8周后取出标本，做大体观察及HE染色、Masson三色染色检查。结果4周时实验组镜下显示有新生软骨形成，但仍有部分支架材料残留；8周时实验组标本大体观察及HE染色、Masson三色染色检查新生软骨与人耳软骨相似，支架材料已完全吸收。对照组无软骨形成。结论以残耳软骨作为种子细胞，以PHB-PHH共聚物为细胞外支架可以形成组织工程软骨，新生软骨大体观察、组织学检查与人耳软骨相似。     

可降解高分子丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)三维支架的细胞相容性和鼻软骨组织工程

目的 探讨可生物降解丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)(80∶20)三维多孔支架生物相容性及用于构建组织工程鼻软骨可行性,为临床鼻软骨缺损的修复提供新来源.方法 体外分离培养新生兔关节软骨细胞,采用计算机形态分析和MTT法检测兔软骨细胞在PLGA膜和支架表面粘附、扩展和增殖情况.将培养扩增的兔软骨细胞,按6×106 cels/ml浓度接种于预加工的人鼻软骨外形PLGA多孔支架内,抗坏血酸体外诱导培养4周,形成软骨样组织,倒置显微镜、组织切片、扫描电镜观察人工软骨的组织形态结构.结果 培养开始阶段,软骨细胞在PLGA膜表面粘附较差,以后逐渐增高,24小时接近于对照组;MTT法结果显示,软骨细胞在PLGA支架内培养7天时细胞绝对数量明显增加,而相对增殖率逐渐下降.肉眼观察,培养物为人鼻软骨外形的透明软骨样组织,具有一定弹性和硬度,表面有大量软骨基质形成;倒置显微镜下可见人工软骨周围有大量软骨细胞聚集和细胞外基质形成.组织切片及扫描电镜分析,多孔支架材料的网孔不完整,孔内有大量软骨细胞和细胞外基质,可见典型软骨陷窝样结构.结论 可生物降解PLGA制备的三维多孔支架具有较好生物相容性和可塑性,可用于组织工程鼻软骨体外构建,具有潜在的临床应用价值.     

非降解聚氨酯弹性体支架材料体外构建残耳软骨用于修复耳廓组织的可行性

目的:探讨以非降解聚氨酯弹性体支架材料体外构建残耳软骨用于修复耳廓组织的可行性。方法:分离30例临床小儿畸形患者软骨细胞,经培养、扩增后制成细胞悬液滴加于圆盘状聚氨酯支架上,体外培养21d后接种于裸鼠体内培养42d,应用扫描电镜观察细胞-支架复合物生长情况,同时使用免疫组织化学法观察成软骨细胞冰冻切片情况。结果:软骨细胞体外培养3周后形成的细胞-支架复合物的形态学及组织学较正常耳廓软骨组织相差甚远,而在裸鼠体内培养6周的细胞-支架复合物外观光滑细腻,与正常耳廓软骨组织相近,经免疫组织化学法分析可见新生的软骨组织细胞间质中存在蓝黑色的丝网状弹力纤维。结论:聚氨酯材料能够成为组织工程耳廓软骨的支架材料,且体内培养较体外培养更利于软骨组织的生长。     

以聚羟基丁酸已酯为支架材料的组织工程隆鼻法的实验研究

目的:研究以聚羟基丁酸已酯(PHB)为支架材料形成的组织工程软骨作为隆鼻填充材料的可行性。方法:实验组:取兔的耳软骨细胞,行体外培养扩增,达到一定数量后,再接种于PHB支架上,置于新西兰白兔的鼻背部骨膜下,从大体和组织学方面观察软骨形成情况;对照组:单纯以未接种软骨细胞的支架移植于兔的鼻背部骨膜下,于相同时间点进行检测。结果:实验组:植入4周后该复合物在兔鼻背下支架表层有软骨层形成,并可见软骨细胞突入至支架材料中间。8周后支架材料继续降解,软骨细胞及细胞基质生成明显,伴有少量血管及胶原长入,对照组无相应变化。结论:以聚羟基丁酸已酯(PHB)为支架材料的组织工程软骨可用于隆鼻的填充材料。     

以β-磷酸三钙多孔陶瓷为载体建造组织工程化人工软骨

目的 通过将软骨细胞接种到三维多孔β－磷酸三钙（β－TCP）陶瓷支架材料上,探讨以β－TCP为载体建造组织工程化软骨的可行性。方法 将β－TPC多孔陶瓷加工成圆片状,并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上接种从兔关节软骨分离的软骨细胞,将细胞－陶瓷复合体置于旋转细胞培养系统（RCCS）内,培养1周后,将其移植到裸鼠背部皮下。植入术后4,8,16周取材,进行大体观察、组织学及组织化学等观察。结果 复合体体内移植后,在裸鼠皮下有新生软骨形成,形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。结论 β－TPC多孔陶瓷是软骨细胞较适宜的贴附基质,以其为支架能够在体内建造出具有精确解剖形状的人工软骨。     

聚羟基丁酸酯载体人工软骨体内培育的实验研究

目的 探讨聚羟基丁酸酶（ＰＨＢ）泡沫材料作为软骨细胞支架材料以及体内培育组织工程化人工软骨的可行性。方法 取４周龄雄性新西兰幼免关节软骨、胶原酶消化,将所获软骨细胞种植到ＰＨＢ泡沫材料上,体外培养１周后,将细胞－支架材料复合体移植到兔背背部下皮,以单纯植入聚羟基丁酸酯泡沫材料及接种软骨细胞组为对照组。分别于术后第４、８、１２周取材,进行大体观察及组织学、免疫组织化学观察。结果 软骨细胞＝支架材料复     

体内外联合培养提高组织工程管状软骨构建质量

目的 探讨利用组织工程技术提高管状软骨的构建质量.方法 PLA/PGA共纺材料均匀地缠绕在硅胶模具上形成管状支架材料.从兔耳郭软骨分离软骨细胞,在体外培养扩增后接种于支架材料,软骨细胞-材料复合物先体外培养2 d.实验动物分为3组:直接植入组(DI组),自体软骨细胞材料复合物直接植入兔颈部皮下.联合培养组(CC组),复合物继续用相同的培养基在体外培养2周后再植入兔颈部皮下.单纯材料组(SO组),在颈部皮下单纯植入材料和硅胶模具.在植入后1,2,4和8周定时取材,行大体观测,组织学染色,生物化学和分子生物学检测和生物力学评定,主要评估炎症反应程度和软骨形成情况.结果 植入1周时,DI和SO组材料纤维周围有明显的炎症反应,大量白细胞浸润;第4周时,两组炎症明显减退,DI组形成的工程软骨被纤维组织分隔成散在的岛状;第8周时,材料基本降解,炎症消散,但DI组软骨无改善.体外培养2周后,CC组软骨细胞已分泌了许多细胞外基质,将部分降解的材料纤维包裹在内,此时植入体内没有引起明显的炎症反应;第4周时,材料完全降解并形成了相对均质、成熟的软骨组织,各项检测指标均优于同时间点DI组构建的软骨,接近正常气管软骨.结论 体内外联合培养可以明显减轻软骨细胞-PLA/PGA复合物植入具有免疫功能的实验动物自体内引发的炎症反应,提高组织工程管状软骨的构建质量.     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架异位构建组织工程化软骨的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与软骨脱细胞基质多孔支架(cartilage ECM-derived porous scaffold,CEDPS)在裸鼠体内异位构建软骨的可行性,并建立利用PKH26荧光和分子荧光活体成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况的新方法.方法 PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs,接种入CEDPS支架,体外进行电镜、Desd/Live荧光染色观察,然后植入裸鼠背部,4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测,与荧光图像比较.结果 体外培养的BMSCs-CEDPS复合体电镜检查结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞基质分泌增加,Dead/Live染色表明BMSCs在支架内部活性良好.4周后活体荧光示踪显示BMSCs在支架内生长良好,无扩散趋势,BMSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织,番红"O"、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的BM-SCs.结论 利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织.PKH26标记与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归.     

Feasibility of Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell–Derived Extracellular Matrix Scaffold for Cartilage Tissue Engineering

Extracellular matrix (ECM) materials are widely used in cartilage tissue engineering. However, the current ECM materials are unsatisfactory for clinical practice as most of them are derived from allogenous or xenogenous tissue. This study was designed to develop a novel autologous ECM scaffold for cartilage tissue engineering. The autologous bone marrow mesenchymal stem cell–derived ECM (aBMSC‐dECM) membrane was collected and fabricated into a three‐dimensional porous scaffold via cross‐linking and freeze‐drying techniques. Articular chondrocytes were seeded into the aBMSC‐dECM scaffold and atelocollagen scaffold, respectively. An in vitro culture and an in vivo implantation in nude mice model were performed to evaluate the influence on engineered cartilage. The current results showed that the aBMSC‐dECM scaffold had a good microstructure and biocompatibility. After 4 weeks in vitro culture, the engineered cartilage in the aBMSC‐dECM scaffold group formed thicker cartilage tissue with more homogeneous structure and higher expressions of cartilaginous gene and protein compared with the atelocollagen scaffold group. Furthermore, the engineered cartilage based on the aBMSC‐dECM scaffold showed better cartilage formation in terms of volume and homogeneity, cartilage matrix content, and compressive modulus after 3 weeks in vivo implantation. These results indicated that the aBMSC‐dECM scaffold could be a successful novel candidate scaffold for cartilage tissue engineering.     

体内外环境对组织工程软骨组织结构与力学性能的影响

目的 探讨体外构建组织工程化软骨在体、内外环境中力学性能及组织结构的变化,以及微环境对组织形成的影响,为工程化软骨构建提供适当参数。方法 体外培养扩增人胎儿关节软骨细胞,取第2代细胞以6×107个细胞/ml密度接种到聚羟基乙酸/聚乳酸(Polyglycolic acid/Polylactic acid,PGA/PLA)材料制成的圆柱形三维支架上,常规体外培养4周后,分为体内组(C、D组)和体外组（A、B组）,C、D组植于裸鼠皮下,A、B组继续常规培养液培养,于6、12周后取材,以正常软骨作为对照,行大体观察,以及组织学、组织化学、生物力学、超微结构等检测。结果 A、B、C、D4组均形成大体形态良好的透明软骨样组织。C、D组软骨呈乳白色,表面光滑,超微结构上胶原纤维排列致密而有规则,可形成有横纹的粗大胶原纤维,类似正常成人软骨;A、B组颜色偏黄,表面略粗糙,外观及超微结构近似半透明的胎儿关节软骨。工程化软骨植入体内12周后压缩弹性模量及胶原直径分别为（38.28±3.95）MPa和（41.58 ±2.78）nm,明显优于体外同时期组的(4.12±0.63) MPa和（15.83±1.70）nm(P ＜0.01)。结论 组织工程软骨的结构和功能在体内环境逐步成熟,体内组软骨超微结构上能形成粗大胶原纤维网络,胶原的交联增强可能是其力学性能较体外组明显提高的重要原因。     

纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞作为软骨组织工程支架的可行性及有效性,并为后续研究可注射性材料做基础。方法：体外分离培养软骨细胞后接种到纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料体外培养4周,然后植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学观察。并进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果。结果：大体观察4周后,实验组软骨缺损区可有乳白色组织修复,12周可修复完全,并无明显凹凸感。光镜下8周可见大量软骨细胞修复,并在TB染色下见Ⅱ型胶原比4周时明显增多。12周时软骨陷窝结构形成,细胞形态排列及Ⅱ型胶原与正常软骨组织相近。结论：纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损。并为构建可注射性修复材料提供途径。     

骨组织工程研究中的美学考量

目的：分别以珊瑚羟基磷灰石(CHA)、藻酸钙为成骨细胞载体，观察裸鼠体内的构建特定形态和可注射组织工程骨的可行性。方法：取兔髂骨，获取骨髓基质干细胞，经体外扩增培养诱导后，获得骨髓基质成骨细胞，分别与CHA和藻酸盐复合，植入和注射于裸鼠背部皮下，6、8周后进行大体观察、组织学和X线检查，观察软骨和骨的形成。以单纯CHA和藻酸盐植入作为对照。结果：植入CHA／成骨细胞组和注射藻酸盐/成骨细胞复合物组均有骨样组织形成，具备骨髓腔样结构，而对照组无骨形成。结论：CHA和藻酸盐均是较好的骨组织工程支架材料，复合成骨细胞后可构建特定形态和可注射组织工程骨。     

海螵蛸与兔软骨细胞组织的生物相容性

目的 探讨海螵蛸作为新生兔关节软骨体外细胞培养支架材料的可行性.方法 消化分离新生兔关节软骨细胞,接种于自制海螵蛸片支架上培养,从倒置相差显微镜和扫描电镜观察其亲水性和对细胞的吸附力.结果 预湿海螵蛸支架的亲水性优于未预湿海螵蛸支架,使软骨细胞更易扩散至支架孔隙.软骨细胞-支架复合体培养1周后,细胞开始在预湿海螵蛸支架上黏附、伸展、增殖;2周后细胞融合成片,布满整个支架孔隙并产生基质.结论 海螵蛸多孔支架与兔软骨细胞具有良好的生物相容性,可以作为软骨组织工程中细胞培养支架的新材料.     

Ⅰ型胶原半月板支架负载纤维软骨细胞体外培养

[目的]观察Ⅰ型胶原半月板支架对纤维软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为半月板组织工程支架的可行性及价值。[方法]构建Ⅰ型胶原半月板支架，将体外培养的兔半月板纤维软骨细胞吸附于该支架上三维立体培养，通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对半月板纤维软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。[结果]Ⅰ型胶原能制成理想大小、形状的三维立体多孔半月板支架，纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好，维持表型稳定，分泌胞外基质。[结论]Ⅰ型胶原半月板支架细胞相容性良好，但力学性能相对较差，通过与其它生物材料复合以提高其机械力学强度，可望制得理想的半月板组织工程支架。     

Human shaped thumb bone tissue engineered by hydrogel-beta-tricalciumphosphate/poly-epsilon-caprolactone scaffolds and magnetically sorted stem cells

Traumatic amputation of a thumb with bone loss leaves a patient in severe disability. Reconstructive procedures are restricted by limited shape and have the disadvantage of severe donor-site morbidity. To overcome these limitations, we used a tissue engineering approach to create a distal thumb bone phalanx, combining magnetically sorted 133+ human mesenchymal stem cells (hMSCs) suspended in successful tested hydrogels for bone formation and porous 3-dimensionally printed scaffolds (3DP) in the shape of a distal thumb bone phalanx. Collagen I and fibrin glue hydrogels with suspended hMSCs were first histologically evaluated in vitro for bone formation after 6 weeks.Then 3DP scaffolds, made from a mix of osteoinductive and -conductive beta-tricalciumphosphate (beta-TCP) and poly-epsilon-caprolactone (PCL), with hydrogels and suspended hMSCs, were implanted into nude mice subcutaneously for 15 weeks. Histologic evaluation, high-resolution volumetric CT (VCT) scanning, and biomechanical testing confirmed formation of bonelike tissue. Both hydrogels with CD 133+ hMSCs on 3DP scaffolds supported bone formation. Collagen I resulted in radiologically better bone formation. Bone tissue can be successfully tissue engineered with CD 133+ hMSCs, collagen I hydrogels, and porous 3DP beta-TCP/PCL scaffolds.     

软骨细胞膜片复合3D打印内支撑构建管状软骨的初步研究

目的 利用猪耳廓软骨细胞制备软骨细胞膜片,与3D打印聚酰胺带孔管状支架结合,构建管状软骨组织,用于气管软骨的缺损重建。方法 用酶消化法分离获得原代猪耳廓软骨细胞,以5×105cells/m L的密度将第2代软骨细胞接种于6 cm细胞培养皿上,在软骨细胞膜片培养环境中培养约14 d,获得完整软骨细胞膜片;4层软骨细胞膜片依次卷叠于3D打印的聚酰胺(PA12)带孔管状内支架上,以构建管状软骨组织复合物;体外静态培养12周或裸鼠皮下培养8周,对形成的管状软骨组织行大体观察及石蜡切片组织学染色鉴定。结果 体外静态培养12周后,半透明管状软骨组织形成,组织学染色可见少量分泌的软骨细胞外基质,质软,弹性差;体内培养8周后,白色管状软骨组织形成,其组织学染色可见大量软骨细胞外基质分泌,质较硬,有一定弹性。结论 利用软骨细胞膜片复合3D打印聚酰胺支架,可构建组织工程管状软骨,有望将其用于气管软骨缺损的修复。     

应用旋转生物反应器开展软骨组织工程研究

目的 应用旋转生物反应器(RCCS)在体外条件下培育具有一定形状的组织工程化人工软骨,以便为软骨组织工程产品产业化生产奠定基础。方法 将兔关节软骨细胞接种到圆形或方形可降解聚合物材料上,然后在RCCS内进行培养,并以在培养瓶内培养复合体为对照组。在体外培养期间,对复合体培育产物氨基糖胺聚糖(GAG)及DNA含量进行定量测量。经体外培养后,将复合体植入到裸鼠背部皮下,术后不同时间取材,进行大体、组织学等检查。结果 经RCCS培养的复合体在体外培养期间以及体内植入后均有明显软骨形成,而对照组则仅见少量软骨形成。复合体体外培育产物检测结果表明,在RCCS内培育的复合体GAG和DNA含量明显高于对照组。结论 RCCS与以单层生长方式为主的传统细胞培养装置—培养瓶相比,能够提供更适宜的外部环境,从而有利于软骨细胞在支架内形成人工软骨组织。