小鼠脑动脉平滑肌钙激活钾通道基本特性和动力学调控研究

目的采用膜片钳技术记录小鼠脑动脉平滑肌细胞上的大电导钙激活钾通道(BKCa)和自发瞬时外向电流(STOCs),研究了其基本特性以及钙离子对通道动力学的调控。方法采用两步法急性酶分离小鼠脑动脉,得到单个平滑肌细胞。使用200μg/mL两性霉素B为穿孔剂进行穿孔全细胞膜片钳实验,包括全细胞宏观电流记录和STOCs记录,采用inside-out和outside-out构型进行单通道电流记录。结果 BKCa宏观电流和STOCs能够被BKCa的特异性阻断剂IbTX(200nmol)阻断。BKCa单通道具有明显电压依赖性(半数最大激活电压V1/2=78.09mV)、K+选择性和钙敏感性(Ca2+解离常数Kd=0.881μmol),能够被胞外IbTX阻断。胞内Ca2+调控通道动力学特性主要表现为减少了开放时间常数,促进了通道由关闭向开放的转变。结论 BKCa宏观电流和STOCs非常容易记录,单通道活性好,具有BKCa的电生理学特性。小鼠脑动脉平滑肌是研究BKCa功能活动和血管活性药物作用机制的良好实验标本。     

一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法

目的：探讨一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法,使细胞内环境保持稳定,改善常规全细胞膜片钳破膜所造成的封接不稳定。方法：以人肠系膜动脉平滑肌细胞为研究对象,采用穿孔全细胞膜片钳技术,记录人肠系膜动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道（big-conductance Ca2＋-activated potassium channels,BKCa）宏观电流以及自发性瞬时外向电流（spontaneous transient outward currents,STOCs）。结果：采用这种穿孔全细胞膜片钳技术,能有效记录到人肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa和STOCs。结论：穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法,该方法的建立为今后更深入的研究提供实验基础。     

雌激素对正常人肠系膜血管平滑肌细胞自发性瞬时外向电流的作用

目的 研究雌激素(estrogen,E)对正常人肠系膜血管平滑肌细胞自发性瞬时外向电流(spontaneous transientoutward currents,STOCs)的作用,探讨雌激素对该细胞上大电导钙激活钾通道(Large-ounductance Ca2 -activated potassiumchannels,BKCa)的作用机制.方法 用急性酶分离方法分离人肠系膜血管平滑肌细胞,采用全细胞穿孔膜片钳技术记录谊细胞上的自发性瞬时外向电流.结果 雌激素可浓度依赖性地激活正常人肠系膜血管平滑肌细胞上的STOCs,当雌激素浓度从0μM增加到10、70、200、300μM时,其幅度和频率都增加.其中幅度分别增加了(68.15±10.82)%(n=10,P<0.01)、(131.63±35.33)%(n=10,P<0.01)、(192.02±57.85)%(n=10,P<0.01)、(269.34±70.64)%(n=10.P<0.01);频率分别增加了(29.30±8.61)%(n=10,P<0.01)、(89.17±21.76)%(n=10,P<0.01)、(164.33±43.51)%(n=10,P<0.01)、(205.09±62.49)%(n=10,P<0.01).结论 雌激素可直接激活正常人肠系膜血管平滑肌细胞自发性瞬时外向电流,是通过增加其幅度和频率而激活的,为进一步探讨雌激素对大电导钙激活钾通道的作用机制提供了实验依据.     

IP_3、钙火花与平滑肌的K_(Ca)通道之间的调控关系

三磷酸肌醇（Trisphosphate inositol，IP3）是广为人知的胞内第二信使，其作用是从胞内钙库释放钙，启动胞内信使系统，从而激发一系列生理活动，所有这些生理活动的产生都是由细胞膜上离子通道的电活动介导的。在这些离子通道中钙激活钾通道（KCa）作为负反馈调节肌张力的效应器而受到更为广泛的重视。研究表明，K^＋通道功能缺陷可致血管收缩和痉挛，降低其舒张动脉的能力；而K^＋通道过度激活可能参与内毒素休克所引致的低血压。此外，在不同的部位KCa通道起着不同的作用，小动脉上的KCa通道可以对抗压力诱发的血管收缩，而胃肠道平滑肌（gastrointestinal smooth inuscle，GISM）上的KCa通道可作为抑制性神经递质的效应器。上世纪九十年代中期在脑动脉血管平滑肌上的局部钙瞬态即钙火花（calcium sparks）被认为是由胞内钙库钙释放所产生的，它可以激活KCa通道。     

腺苷三磷酸对冠状动脉平滑肌细胞大电导钙离子激活钾通道的作用

冠状动脉平滑肌细胞膜上存在许多大电导钙离子激活钾通道(BK通道),该通道具有电压依赖性和钙敏感性。研究发现,腺苷三磷酸可通过激活非选择性阳离子门控通道P2X受体使细胞外钙离子内流增加,也可以通过G蛋白偶联受体P2Y使细胞内三磷酸肌醇敏感钙库释放钙离子,升高细胞内钙浓度,从而激活BK通道,起到扩张冠状动脉的作用。     

Ca~( )与平滑肌收缩及冠脉痉挛

平滑肌的收缩有赖于外来的Ca~( )。Ca~( )主要经膜的电位敏感通道和受体活化通道进入细胞内,并触发内贮钙的释放。当[Ca~( )]内升至10~(-6)M时,Ca~( )通过钙调整蛋白激活肌凝蛋白轻链激酶使肌凝蛋白磷酸化。磷酸化的肌凝蛋白和肌纤蛋白相互作用产生收缩。近年来发现冠状动脉平滑肌收缩所产生的痉挛是形成缺血性心脏病的原因之一。冠脉痉挛可导致心绞     

钙池操纵的Ca~(2+)通道在IL-13促气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的:探讨钙池操纵的Ca2+(SOC)通道在Th2型细胞因子IL-13促进气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖中的作用。方法:体外分离培养大鼠ASMCs,IL-13孵育36 h后,以Fluo 3-AM为钙荧光示踪剂,采用激光共聚焦显微镜,测定大鼠ASMCs基础Ca2+水平以及肌浆网钙泵抑制剂Thapsigargin(TPG)诱发的内钙释放和经SOC通道的外钙内流;采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法),检测SOC通道阻断剂SKF-96365对IL-13促增殖作用的影响。结果:①IL-13作用36 h后,ASMCs的内钙释放及经SOC通道的钙内流反应明显高于对照组(P<0.05),并且这种钙内流反应能部分被SOC通道阻断剂SKF-96365抑制(P<0.01)。②IL-13能促进气道平滑肌细胞增殖,该作用可被SKF-96365抑制(P<0.01)。结论:IL-13对气道平滑肌细胞的促增殖作用可能部分是通过促进SOC通道钙离子内流反应来实现的。     

氟灭酸对豚鼠耳蜗螺旋动脉平滑肌细胞膜电位和兴奋性接头电位的作用

目的:观察氯通道阻断剂氟灭酸(NFA)对耳蜗螺旋动脉平滑肌细胞膜电位和电刺激血管周围交感神经纤维引起兴奋性接头电位(EJP)的影响。方法:在耳蜗螺旋动脉平滑肌离体标本上,运用细胞内微电极记录技术研究非甾体类抗炎药物对平滑肌细胞的作用。结果:100μmol/L NFA引起低静息膜电位平滑肌细胞产生了(14.7±4.4)mV的超极化反应,引起高静息膜电位平滑肌细胞仅产生了(1.4±0.8)mV的超极化反应(P<0.01)。NFA引起低静息膜电位平滑肌细胞的反应是浓度依赖性的,这一超极化反应能被钙激活钾通道的阻断剂北非蝎毒素(charybdotoxin)和iberiotoxin阻断。另外,在高静息膜电位的平滑肌细胞,NFA对刺激引起的平滑肌细胞EJP有更明显的抑制作用(P<0.01),但对低静息膜电位的平滑肌细胞引起的EJP作用不明显(P>0.05)。结论:NFA既能通过阻断钙激活的氯通道抑制平滑肌细胞产生的EJP,又能激活钙激活钾通道使平滑肌细胞产生超极化反应,表现出对平滑肌细胞作用的多样性。     

大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞的分离及其生理特性

目的建立一种有效、方便的急性分离方法，用于研究生理和病理状态下血管张力及其反应性变化机制。方法采用木瓜酶、胶原酶XI两步消化法分离单个血管平滑肌细胞。结果分离出的血管平滑肌细胞数量多，细胞内钙分布均匀：在10mmol／L咖啡因的作用下，血管平滑肌细胞内钙浓度增加、细胞收缩；分离的血管平滑肌细胞膜表面光滑，容易与玻璃微电极形成高阻封接．可记录到稳定的钾电流。结论两步酶消化法所分离出的血管平滑肌细胞膜具有良好的钙激活钾通道活性，其IP3受体和Ryanodine受体具有敏感的反应性，其收缩蛋白功能良好。     

家兔骨骼肌钙释放通道放射配基分析法的建立

为建立骨骼肌肌浆网 (SR)钙释放通道的检测方法 ,探索在骨骼肌中建立钙释放通道放射配基分析的最适宜条件 ,采用蔗糖梯度离心提取骨骼肌肌浆结合的最适宜条件。结果发现 ,37℃水浴下 ,在 0～ 6 0 min内 ,[3H]ryanodine与骨骼肌肌浆网的结合量迅速增加 ,90 min时基本达到平衡 ,90～ 12 0 min内基本无变化。匀浆蛋白在 0 .4～ 0 .6 g/ml、[3H]ryanodine在 1～ 30nmol/L 最适宜 [3H]ryanodine与骨骼肌肌浆网钙释放通道的结合。家兔骨骼肌钙释放通道放射配基分析法的建立@吴乐$南京医科大学!南京210029 @张缪佳$南京医科大学!南京210029 …     

质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+转运的影响

目的：观察ＤＮＡ与骨骼肌肌质网蛋白结合后对肌质网功能的影响。方法：应用差速离心分离大鼠骨骼肌肌质网,并用４５ＣａＣｌ２作为示踪剂,观察质粒ＤＮＡｐｃＤＮＡ３和ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ对肌质网钙转运功能的影响。结果：两种质粒均可明显增加肌质网Ｃａ２＋摄取,呈明显的量效关系,并且也可促进肌质网钙释放。结论：外源质粒ＤＮＡ可影响肌质网钙转运功能。     

小檗碱对急性分离成年大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的　研究小檗碱对急性分离大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ] i)的影响。方法　采用酶解法分离单个大鼠心肌细胞 ,用钙敏感的荧光指示剂Fluo 3/AM染色 ,以荧光强度 (FI)来代表 [Ca2 + ] i,应用激光扫描共聚焦显微镜实时监测FI的变化。结果　在静息状态下 ,小檗碱 (3～ 1 0 0 μmol/L)对 [Ca2 + ] i 无影响。 3～ 1 0 0 μmol/L小檗碱对KCl 60mmol/L介导的钙内流也无影响。但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)对caffeine 1 0mmol/L引起的钙动员有明显促进作用 (P <0 .0 1 )。结论　小檗碱对于KCl通过电压依赖性钙通道 (VDC)介导的 [Ca2 + ] i 升高无影响 ;但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)可能通过影响RyRs而促进肌浆网 (SR)内钙外流 ,也可能对SR钙摄取 ,钙的跨膜转运及Na+ Ca2 + 交换有抑制作用     

低频复合生理频率慢性电刺激对肺气肿兔膈肌肌浆网Ca2+-ATP酶活性及Ca2+摄取和释放动力学的影响

目的 研究低频复合生理频率慢性电刺激后肺气肿兔膈肌肌浆网(SR)Ca2 -ATP酶及钙离子摄取和释放动力学的适应性变化.方法 采用木瓜蛋白酶雾化吸入法建立肺气肿模型:测定正常对照组、肺气肿组和肺气肿慢性电刺激(CES)组SR Ca2 -ATP酶的活性及Ca2 的摄取和释放动力学变化.结果 (1)(10 40)Hz慢性电刺激后,膈肌SRCa2 -ATP酶活性增高(P＜0.05).10Hz组Ca2 -ATP酶活性降低(P＜0.05).(2)(10 40)Hz慢性电刺激后,膈肌SRCa2 摄取和释放功能增强(P＜0.05);10Hz组膈肌SRCa2 摄取和释放功能减弱(P＜0.05).结论 不同频率的CES可导致膈肌SRCa2 -ATP酶的活性及Ca2 的摄取和释放动力学产生不同的适应性变化,慢性低频复合生理频率电刺激能增强膈肌SRCa2 -ATP酶活性,提高肺气肿兔膈肌SRCa2 摄取和释放能力,可能是体外膈肌起搏对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者膈肌康复治疗的较好频率模式之一.     

心衰大鼠心肌SR Ca2+泵活性和Ca2+释放通道密度的变化及培哚普利干预的影响

目的　探讨ACEI干预慢性心衰对心肌肌浆网(SR)Ca     

Effect of tetrandrine on cellular electrophysiology and calcium uptake of myocardium in guinea pigs and dogs

目的　本文旨在研究汉防已甲素对豚鼠及狗的心肌动作电位 (AP)、收缩力及肌浆网钙吸收的作用。方法　用玻璃微电极的方法 ,研究用药后心肌细胞AP、dV/dt、峰张力 (PT)及dT/dt等指标的改变 ,并用生化方法估价用药后心肌肌浆网钙吸收率及无机磷释放等指标的变化。结果　汉防已甲素起着浓度依赖性和频率依赖性负性变力性作用 ,且缩短了动作电位时程。汉防已甲素抑制心肌dT(E) /dt和dT(L) /dt,也抑制了心肌张力 ,并降低了慢动作电位的dV/dt和幅度 ,这些暗示汉防已甲素可阻止慢钙通道。另外 ,与Thapsigargin(一种特异性肌浆网Ca2 ATP酶抑制剂 )进行了比较 ,汉防已甲素较之更为明显地抑制了心肌的收缩。结论　汉防已甲素是一种植物性广谱钙离子拮抗剂。它不仅阻止电压操纵的钙通道 (象其它作者所报导的那样 ) ,而且在影响Ca2 ATP酶及肌浆网钙释放通道方面也起着重要的作用。我们的资料提示钙通道对心肌收缩似乎比肌浆网更为关键。     

逼尿肌不稳定大鼠中RyR通道对自发性收缩影响的实验研究

目的为探索逼尿肌不稳定(detrusor instability,DI)自发收缩过度活跃的肌源性基础,观察RyR(ryanodine receptor,RyR)通道在DI及正常逼尿肌中对自发收缩调节的影响,以及RyR表达差异.方法手术形成大鼠部分膀胱出口梗阻(partial bladder outlet obstruction,BOO),8周后进行充盈性测压获得DI模型.新鲜膀胱镜下分离肌条,离体收缩实验用相应试剂干预记录收缩变化;RyR蛋白表达差异用Western blot分析.结果RyR阻滞剂Ryanodine干预后,正常肌条收缩频率明显增加,但此效应在DI没有发现.Western blot分析提示RyR在DI逼尿肌表达显著减少.结论研究提示RyR通道在逼尿肌自发收缩中负性作用机制可能在于RyR通道释放Ca2 激活膜上钙敏感钾通道而降低收缩活性,此机制在DI明显减弱;这可能导致DI逼尿肌收缩过度活跃.     

心衰大鼠心肌SR Ca~(2+)泵活性和Ca~(2+)释放通道密度的变化及培哚普利干预的影响

目的　探讨ACEI干预慢性心衰对心肌肌浆网 (SR)Ca2 + 泵活性和Ca2 + 释放通道 (RyR2 )密度的影响及意义。方法　通过结扎大鼠左冠脉建立慢性心衰模型 ,以培哚普利进行干预 ,对照观察血流动力学、左室心肌SRCa2 + 泵活性、[3 H]-ryanodine与RyR2 最大结合量 (Bmax)、Kd 值。结果　与对照组 (C组 )相比 ,心衰组 (F组 )LVEDP显著升高 (P <0 0 1) ,+dp/dtmax、-dp/dtmax显著降低 (P <0 0 1) ,培哚普利组 (P组 )LVEDP显著低于F组 (P <0 0 1) ,+dp/dtmax、-dp/dtmax显著高于F组 (P <0 0 1)。F组心肌SRCa2 + 泵活性、[3 H]-ryanodine与RyR2 最大结合量Bmax显著低于C组 (P <0 0 1) ,也显著低于P组 (P <0 0 1) ,三组Kd 值无显著差异 (P >0 0 5 )。心肌SRCa2 + 泵活性与 +dp/dtmax、-dp/dtmax显著正相关 (r=0 5 16 1、0 6 172 ,P <0 0 1)。结论　培哚普利长期干预慢性心衰 ,能够改善心肌SRCa2 + 泵活性 ,增加RyR2 密度 ,可能与其改善心肌舒缩功能及心肌保护作用有关。     

RyR2磷酸化在心力衰竭中的作用

 心力衰竭在细胞水平主要表现为心肌以兴奋 收缩耦联(excitement contraction coupling,ECC)为基础的收缩功能障碍,而Ca2+信号转导在此过程中起着非常重要的作用。肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)兰尼碱受体(ryanodine receptor type 2,RyR2)是心肌最重要的钙释放通道,RyR2磷酸化是肌浆网钙释放的基础,而RyR2磷酸化主要受蛋白激酶A (protein kinase A ,PKA)和钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的调控。目前对RyR2磷酸化的研究已经非常广泛,但对其涉及心力衰竭的具体发病机制仍有争议,本综述主要针此问题进行阐述。     

心衰大鼠心肌SR Ca2+释放通道数量及其mRNA表达的变化及培哚普利干预的影响

目的　探讨慢性心衰心肌肌浆网 (SR)Ca2 + 释放通道 (RyR2 )数量及其mRNA表达的变化及ACEI干预的影响及意义。方法　通过结扎大鼠左冠脉建立慢性心衰模型 ,以培哚普利进行干预 ,对照观察血流动力学、[3 H]-ryanodine与左室心肌RyR2 最大结合量 (Bmax)和Kd 值、RyR2 mRNA表达水平。结果　与对照组 (C组 )相比 ,心衰组 (F组 )LVEDP显著升高 (P <0 .0 1) ,+dp/dtmax、-dp/dtmax显著降低 (P <0 .0 1) ,培哚普利组 (P组 )LVEDP显著低于F组 (P <0 .0 1) ,+dp/dtmax、-dp/dtmax显著高于F组 (P<0 .0 1)。F组 [3 H]-ryanodine与RyR2 最大结合量Bmax显著低于C组 (P <0 .0 1) ,P组显著高于F组 (P <0 .0 1) ,三组Kd 值无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;F组RyR2 mRNA表达水平显著低于C组 (P <0 .0 1) ,P组显著高于F组 (P <0 .0 1)。结论　慢性心衰心肌SRCa2 + 释放通道数量及其mRNA表达水平降低 ,培哚普利长期干预慢性心衰 ,能够增加RyR2 基因表达 ,增加RyR2 数量 ,可能与其改善心肌收缩功能有关     

Mitochondrial Oxidative Stress Enhances Vasoconstriction by Altering Calcium Homeostasis in Cerebrovascular Smooth Muscle Cells under Simulated Microgravity

Objective Exposure to microgravity results in postflight cardiovascular deconditioning in astronauts.Vascular oxidative stress injury and mitochondrial dysfunction have been reported during this process.To elucidate the mechanism for this condition,we investigated whether mitochondrial oxidative stress regulates calcium homeostasis and vasoconstriction in hindlimb unweighted(HU)rat cerebral arteries.Methods Three-week HU was used to simulate microgravity in rats.The contractile responses to vasoconstrictors,mitochondrial fission/fusion,Ca²⁺ distribution,inositol 1,4,5-trisphosphate receptor(IP3 R)abundance,and the activities of voltage-gated K+channels(KV)and Ca²⁺-activated K+channels(BKCa)were examined in rat cerebral vascular smooth muscle cells(VSMCs).Results An increase of cytoplasmic Ca²⁺ and a decrease of mitochondrial/sarcoplasmic reticulum(SR)Ca²⁺ were observed in HU rat cerebral VSMCs.The abundance of fusion proteins(mitofusin 1/2[MFN1/2])and fission proteins(dynamin-related protein 1[DRP1]and fission-mitochondrial 1[FIS1])was significantly downregulated and upregulated,respectively in HU rat cerebral VSMCs.The cerebrovascular contractile responses to vasoconstrictors were enhanced in HU rats compared to control rats,and IP3 R protein/mRNA levels were significantly upregulated.The current densities and open probabilities of KV and BKCa decreased and increased,respectively.Treatment with the mitochondrial-targeted antioxidant mitoTEMPO attenuated mitochondrial fission by upregulating MFN1/2 and downregulating DRP1/FIS1.It also decreased IP3 R expression levels and restored the activities of the KV and BKCa channels.MitoTEMPO restored the Ca²⁺ distribution in VSMCs and attenuated the enhanced vasoconstriction in HU rat cerebral arteries.Conclusion The present results suggest that mitochondrial oxidative stress enhances cerebral vasoconstriction by regulating calcium homeostasis during simulated microgravity.