针对MTA1基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用.方法 设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Western blotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化.结果 把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCT GCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达.结论 成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础.     

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

靶向Livin基因siRNA载体的构建和沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察该载体对食管癌细胞Livin基因表达的沉默效应。方法:依据siRNA设计原则,分析Livin mRNA序列,设计并合成2个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pSUPER-neo载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹法将重组质粒转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR检测转染细胞Livin mRNA的表达。结果:经过酶切鉴定与测序,构建的靶向Livinα和Livinβ基因的siRNA载体,结果正确;RT-PCR检测显示,转染细胞Livin mRNA的表达水平降低。结论:成功构建沉默细胞Livin基因表达的siRNA载体。     

表达PTEN同时沉默Livin基因载体的构建和鉴定

目的 构建表达PTEN基因、同时又沉默Livin基因的复合载体,探讨调控PTEN和Livin基因对胃癌细胞的影响.方法 根据GenBank中人DNA的PTEN基因(NM_000314)和Livin(NM_139317)基因的全长序列设计,分别构建出表达PTEN基因的真核表达载体pCL-neo-PTEN和沉默Livin基因的siRNA载体pRNAT-U6.1-Livin.切下pRNAT-U6.1-siLivin中的Livin siRNA单元,将其重组入pCL-neo-PTEN;鉴定得到表达PTEN同时沉默Livin基因的重组载体pCL-neo-PTEN-siLivin.脂质体包裹3个重组载体分别转染胃癌BGC823细胞,荧光定量RT-PCR和Western印迹检测胃癌BGC823细胞PTEN和Livin基因mRNA和蛋白表达情况.结果 经过限制性酶切和测序鉴定得到重组子pCL-neo-PTEN、pRNAT-U6.1-Livin和pCL-neo-PTEN-siLivin.转染pCL-neo-PTEN-siLivin的胃癌BGC823细胞中PTEN基因mRNA(0.897±0.112)和蛋白高水平表达,与对照组细胞(0.277±0.036)比较差异有统计学意义(P<0.05),与转染pCL-neo-PTEN的比较差异无统计学意义(P>0.05);转染pCL-neo-PTEN-siLivin的胃癌BGC823细胞中Livin基因mRNA(0.071±0.009)和蛋白表达抑制,与对照组细胞(0.338±0.044)差异有统计学意义(P<0.05),与转染pRNAT-U6.1-siLivin的差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建出表达PTEN基因同时又沉默Livin基因的重组载体.     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

针对人免疫缺陷病毒1型辅助受体CCR5 RNA干扰表达载体的构建

目的:抑制细胞表面人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的辅助受体CCR5表达, 阻止HIV-1进入靶细胞.方法:设计CCR5靶向的发夹状siRNA,合成2条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹pRNAT-U6.2-siCCR5后转染U937细胞,采用RT-PCR和流式细胞术分别检测CCR5基因mRNA和蛋白表达的变化.结果:重组子pRNAT-U6.2-siCCR5,经过测序鉴定与设计一致.RT-PCR检测显示, 转染pRNAT-U6.2-siCCR5细胞的CCR5基因表达水平显著降低于未转染对照组和转染空载体细胞(P<0.05).未转染对照组U937细胞表面CCR5的表达率为(83.10±6.52)%, 转染空载体组为(81.44±4.97)%,转染pRNAT-U6.2-siCCR5组为(1.94±0.06)%,3组间差异有统计学意义(P<0.05).结论:成功构建出沉默细胞CCR5基因表达的siRNA载体.     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

目的 采用RNAi抑制食管癌EC9706细胞株MTA1基因的表达,观察对食管癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 用脂质体包裹转染沉默MTA1表达的siRNA表达载体人食管癌细胞EC9706.定量RT-PCR和免疫印迹分别检测MTAl mRNA和蛋白表达情况;划痕损伤实验和细胞体外侵袭实验分别测定迁移和侵袭的影响.结果 定量RT-PCR检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低;转染沉默MTA1的siRNA表达载体组的食管癌细胞划痕未愈合,穿透Matrigel的细胞数量明显减少,与未转染组、转染空载体组和转染无关序列siRNA载体组比较差异有显著性(P<0.05).结论 RNA干扰介导的MTA1基因表达沉寂可有效降低食管癌细胞侵袭和迁移;MTA1基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点.     

慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立

目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒siRNA和表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞.方法:构建CEA siRNA载体:依据siRNA靶序列设计原则,针对人CEA的cDNA序列,设计并合成编码siRNA的3对寡核苷酸序列,克隆入siRNA载体(pRNAT-U6.2/Lenti)中构建3个重组体pRNAT-U6.2-SCEA.构建CEA表达载体:以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.然后进行重组慢病毒分剐感染EC9706细胞,G418筛选得到稳定感染细胞株.分别用荧光定量Real-time RT-PCR和Western blot检测EC9706细胞中CEA基因表达抑制或增强的效果.结果:EC9706病毒感染48 h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达.经过RTPCR和Western-blot验证:得到3株稳定CEA低表达的EC9706细胞株,其中一个CEA的表达几乎得到完全抑制,1株稳定CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA).结论:建立了稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞株,成功调控食管癌EC9706细胞中CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

RNAi沉默polβ基因部分逆转食管鳞癌细胞顺铂耐药性

目的 通过RNA干扰（RNAi）技术沉默DNA聚合酶polβ的表达,观察其对食管癌细胞顺铂（cDDP）耐药性的影响。方法 构建靶向polβ基因的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2及阴性对照载体pRNAT-U6.2/Lenti-polβC,将其感染人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706/cDDP,通过RT-PCR、蛋白质印迹分析和免疫荧光实验观察细胞polβ的表达情况,采用MTT法观察不同浓度顺铂对细胞生长的抑制作用并计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度（IC₅₀）和耐药指数（RI）。结果 靶向polβ的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1和pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2感染EC9706/cDDP后均可下调polβ的mRNA和蛋白表达水平,其中前者效果更为显著。顺铂以剂量依赖方式抑制EC9706/cDDP细胞增殖,感染pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβC的EC9706/cDDP细胞及未感染EC9706/cDDP细胞对顺铂的IC₅₀分别为55.71、62.41、63.11 μg/mL,耐药指数分别为13.9、15.5、15.7,其中前者与后二者相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论 polβ的表达与食管鳞癌细胞系EC9706/cDDP顺铂耐药性有关,沉默其表达可部分逆转EC9706/cDDP细胞对顺铂的耐药性。     

调控Livin基因表达对食管癌EC9706细胞生物学行为的影响

目的:探讨调控Livin基因表达对食管癌EC9706细胞生长速度、细胞凋亡以及放射线敏感性的影响.方法:取EC9706细胞,分7组,siRNA组、Livinα组、Livinβ组分别用脂质体包裹法转染沉默Livin表达的siRNA载体pSUPER-neo-Sli1、Livinα表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα及Livinβ表达载体pIRES2-AcGFP-Livinβ;Livinα/β组同时转染pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,空siRNA载体组转染pSUPER-neo,空表达载体组转染pIRES2-AcGFP,空白对照组不转染.取各组细胞,荧光定量RT-PCR法检测Livin mRNA表达情况,MTT法测定细胞生长曲线,TUNEL法检测细胞凋亡,同时检测Caspase-3 活性及放射线敏感性.结果:与空白对照组比较,空表达载体组、空siRNA载体组细胞倍增时间、凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性差异均无统计学意义(P＞0.05).与空白对照组比较,Livinα组、Livinβ组和Livinα/β组细胞倍增时间、凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性均降低(P＜0.05);siRNA组细胞凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性增加(P＜0.05),细胞倍增时间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:调控EC9706细胞Livin基因的表达,可有效改变细胞的生物学行为;Livin基因可能成为肿瘤治疗的新靶点.