重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG休眠菌的促生长作用

目的观察重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG的促生长作用。方法将测序正确的Rv2450c基因克隆到表达载体pET32a(+)中,获得RpfE蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的蛋白分别与结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗进行Western blot分析。分别将10pmol/L和100pmol/L的RpfE加入到休眠BCG的培养基中,观察RpfE蛋白对BCG的促生长作用。结果得到融合组氨酸残基的重组RpfE蛋白,Western blot结果显示该蛋白分别与活动期结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗在40kDa处发生反应。100pmol/L的RpfE蛋白对BCG休眠菌具有明显的复苏和促生长作用。结论构建了MtbRv2450c基因的重组表达载体,纯化获得了RpfE重组蛋白,该蛋白对BCG休眠菌具有复苏和促生长作用。     

结核分枝杆菌Rv1884基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的　克隆表达结核分枝杆菌Rv1884基因 ,序列测定正确后进行融合表达、纯化。方法　采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1884编码基因 ,用限制性内切酶消化后插入到pGEM Teasy中 ,序列测定正确后 ,再亚克隆到融合表达载体 pPro EXHT中 ,转化大肠杆菌DH5α ,目的基因经IPTG诱导 ,由T7启动子调控表达了氨基端带 6个连续组氨酸残基的Rv1884蛋白 ,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果　获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1884蛋白基因 ,得到融合 6个组氨酸残基的Rv1884蛋白纯度大于 85 %。结论　构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的重组表达载体 ,并获得了高纯度的融合表达蛋白 ,为以后的深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌的复苏因子

1998年Mukamolova在细菌因子一文中首先提出了复苏因子（Resuscitation promoting factor Rpf）的新概念，并证实复苏因子是由有活性的微球菌分泌的一种蛋白质．它在皮摩尔级浓度就能有效地促进休眠的非生长同源菌的复苏和生长。Mukamolova同时也证实微球菌复苏因子类似基因广泛地存在于富含G＋C的革兰氏阳性菌中（如链霉菌：分枝杆菌；棒状杆菌），并找到了结核分枝杆菌复苏因子家族（RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE）。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的 克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达.方法 采用热启动聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白.结果 经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0.6,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22.8%.结论 构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础.     

Rv1508c调节和促进分枝杆菌对链霉素药物敏感性的研究北大核心CSCD

目的通过检测抗结核药物-利福平、异烟肼以及链霉素对结核分枝杆菌RD区(Region of Differences,RD)基因的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,筛选对3种抗结核药物敏感或耐药的毒性结核分枝杆菌RD区基因。方法将结核分枝杆菌RD6、RD9和RD15区基因与穿梭质粒pMV261连接,连接产物电转化耻垢分枝杆菌中。分别将对数生长期的耻垢分枝杆菌以及重组耻垢分枝杆菌中加入浓度倍比稀释的异烟肼(0.031 25~4μg/ml)、利福平(0.031 25~4μg/ml)和链霉素(0.031 25~4μg/ml)100μl,37℃培养2d后,用酶标仪测A600值。用Graphpad Prism5计算IC50值并进行统计学分析。结果成功构建RD6、RD9和RD15区基因重组质粒,电转化入耻垢分枝杆菌后通过检测利福平、异烟肼以及链霉素对以上RD区基因的IC50值,成功筛选出对链霉素敏感的RD6区基因Rv1508c。同时对Rv1508c在分枝杆菌(毒性结核分枝杆菌H37Rv、减毒结核分枝杆菌H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌)中的分布做了鉴定,确定其只存在于H37Rv和H37Ra中。结论结核分枝杆菌RD6区基因Rv1508c能促进分枝杆菌对链霉素的敏感,使链霉素杀伤分枝杆菌作用增强,Rv1508c作为链霉素一个靶点,在今后研究中,Rv1508c可作为抗结核药物增敏剂的应用。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

Rv1508c调节和促进分枝杆菌对链霉素药物敏感性的研究

目的通过检测抗结核药物-利福平、异烟肼以及链霉素对结核分枝杆菌RD区(Region of Differences,RD)基因的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,筛选对3种抗结核药物敏感或耐药的毒性结核分枝杆菌RD区基因。方法将结核分枝杆菌RD6、RD9和RD15区基因与穿梭质粒pMV261连接,连接产物电转化耻垢分枝杆菌中。分别将对数生长期的耻垢分枝杆菌以及重组耻垢分枝杆菌中加入浓度倍比稀释的异烟肼(0.031 25~4μg/ml)、利福平(0.031 25~4μg/ml)和链霉素(0.031 25~4μg/ml)100μl,37℃培养2d后,用酶标仪测A600值。用Graphpad Prism5计算IC50值并进行统计学分析。结果成功构建RD6、RD9和RD15区基因重组质粒,电转化入耻垢分枝杆菌后通过检测利福平、异烟肼以及链霉素对以上RD区基因的IC50值,成功筛选出对链霉素敏感的RD6区基因Rv1508c。同时对Rv1508c在分枝杆菌(毒性结核分枝杆菌H37Rv、减毒结核分枝杆菌H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌)中的分布做了鉴定,确定其只存在于H37Rv和H37Ra中。结论结核分枝杆菌RD6区基因Rv1508c能促进分枝杆菌对链霉素的敏感,使链霉素杀伤分枝杆菌作用增强,Rv1508c作为链霉素一个靶点,在今后研究中,Rv1508c可作为抗结核药物增敏剂的应用。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

康乐霉素A体外抗结核活性的初步研究

目的发现新安莎类抗生素，康乐霉素A体外抗结核活性。方法应用色谱技术从地中海诺卡氏菌康乐变株1747-64发酵液中分离康乐霉素A，并采用试管二倍稀释法，进行康乐霉素A对耻垢分枝杆菌（ATCC14468），结核分枝杆菌H37Rv（ATCC27294），H37Ra（ATCC25177），临床分离的氧氟沙星（OFLX）敏感结核分枝杆菌以及临床分离的耐氧氟沙星结核分枝杆菌最低抑制浓度（Minimal Inhibitor Concentration，MIC）的试验。结果康乐霉素A对耻垢分枝杆菌活性弱，MIC为64μg／ml，对结核分枝杆菌H37Rv，H37Ra的MIC为8μg／ml，对临床分离的氧氟沙星敏感结核分枝杆菌菌株的MIC范围为1～8μg／ml，临床分离的耐氧氟沙星结核分枝杆菌菌株的MIC范围为1～16μg／ml。结论新安莎类抗生素，康乐霉素A体外具有明显的抗结核活性，有望成为新抗结核药物或先导化合物。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a（＋）载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。     

3种结核分枝杆菌复活促进因子基因的克隆、原核表达与纯化鉴定

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子B(rpfB)、D(rpfD)、E(rpfE)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化。方法采用聚合酶链反应(PCR)以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板扩增出rpfB(1089bp),rpfD(465bp)和rpfE片段(519bp),并连接在pET32a( )载体上,重组质粒用酶切和DNA测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达了rpfB,rpfD和rpfE3种蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现分别在61kDa、39kDa、41kDa处有特异性蛋白条带。结论成功构建了3种重组表达质粒pET32a( )-rpfBv、pET32a( )-rpfDv、pET32a( )-rpfEv,并获得了3种高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表达、纯化与鉴定

目的 克隆结核分枝杆菌Rv3803c和Rv3846基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中进行表达和纯化。 方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增出Rv3803c和Rv3846基因片段,克隆至pGEX-6P-1表达载体中,测序正确后,在E.coli Rosetta中诱导表达,GST标签亲和层析法纯化蛋白,考马斯亮蓝染色及Western-blot分析鉴定。 结果 重组质粒pGEX-Rv3803c、pGEX-Rv3846测序表明核苷酸序列与设计完全一致。其在E.coli Rosetta中的存在形式均为可溶部分约50%、包涵体约50%,相对分子质量约为56 000和45 000, 纯化的GST-Rv3803c、GST-Rv3846样品纯度90%以上。完整的GST-Rv3803c的浓度大约为0.1 mg/ml,完整的GST-Rv3846的浓度大约为0.5 mg/ml。即相当于每升E.coli Rosetta培养物中,GST-Rv3803c产量为：0.25 mg/L、GST-Rv3846产量为1.25 mg/L。 结论 成功获得了纯化蛋白Rv3803c（MPT51）和Rv3846（SodA）,为进一步研究MPT 51和SodA蛋白的辅助诊断价值、构建保护性疫苗提供了实验依据。     

结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

目的 评价Mtb复苏因子DNA疫苗（resuscitation-promoting factor DNA,Rpf-DNA）对Mtb感染宿主的免疫保护作用。 方法 构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗,180只BALB/c小鼠（4周龄）分为6组,每组30只,分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫,H37Rv标准株气溶胶感染。检测血清复苏因子（Rpf）抗体、IFN-γ;RpfD、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验;检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2;对肺组织进行病理学检测和细菌负荷（CFU）计数。 结果 （1）疫苗免疫组血清Rpf D、Rpf E抗体水平：Rpf D组0.32±0.1,Rpf E组0.39±0.1,BCG组0.02±0.01,空质粒组0.01±0.0,生理盐水组0.09±0.04,空白对照组0.03±0.01,RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D：45.6,43.2,45.1,45.7;Rpf E：51.6,53.6,51.0,52.2;P值均<0.01。血清IFN-γ：Rpf D组（43.9±24.8）pg/ml,Rpf E组（45.9±21.0）pg/ml,BCG组（21.0±11.0）pg/ml,空质粒组（7.9±4.9）pg/ml,生理盐水组（4.7±2.1）pg/ml,空白对照组（5.8±4.7）pg/ml,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组比较差异有统计学意义（F值分别为Rpf D：10.2;Rpf E：12.4;P值均<0.05）, 与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D：15.6,17.8,17.3;Rpf E：17.5,21.1,20.7;P值均<0.01。（2）淋巴细胞增殖实验CCK-8：Rpf D组176.0±4.2,Rpf E组183.0±4.3,BCG组101.0±1.1,空质粒组100.0±6.8,生理盐水组104.0±8.4,空白对照组116.0±2.2,RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：9.5,10.1,10.0,9.0;Rpf E：11.2,12.9,11.7,10.3;P值均<0.05。细胞杀伤实验：Rpf D组32.0±3.2,Rpf E组30.0±4.2,BCG组16.0±5.9,空质粒组3.3±1.5,生理盐水组6.7±0.5,空白对照组7.3±3.5,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：8.8,14.5,13.7,11.9;Rpf E：8.1,12.5,11.6,11.1;P值均<0.05。（3）Rpf D、Rpf E蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测：IL-2：Rpf D组9.5±2.4,Rpf E组9.2±1.2,BCG组2.4±2.1,空质粒组1.2±0.3,生理盐水组1.8±1.0,空白对照组1.5±0.7,Rpf D、Rpf E质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：12.5,14.6,13.5,13.9;Rpf E：12.0,13.6,13.1,13.2;P值均<0.05。IFN-γ：Rpf D组22.2±5.7,Rpf E组28.7±14.4,BCG组16.1±10.1,空质粒组9.8±1.6,生理盐水组13.2±2.1,空白对照组15.7±2.9,RpfD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：7.8,12.6,8.7,8.3;Rpf E：11.3,16.4,14.7,14.2;P值均<0.05。 结论 实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫,有希望成为结核病候选疫苗之一。     

结核分枝杆菌RpfA融合蛋白的免疫学和生物学特性的初步研究

目的在大肠杆菌中表达并纯化结核分枝杆菌RpfA融合蛋白,并初步研究其免疫学和生物学特性。方法Rp-fA融合蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果。分离小鼠的脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞增殖指数,ELISA法检测培养液上清IFN-γ,IL-2含量;MTBH37Rv毒株静脉感染免疫小鼠,测定脾脏细菌负荷。将不同浓度的复性RpfA融合蛋白和特异性多抗加入到MTBH37Ra中,测定H37Ra的生长曲线。结果RpfA融合蛋白免疫小鼠的脾淋巴细胞的增殖指数达到3.57,高于生理盐水对照组的1.27(P<0.05);培养上清中IFN-γ含量为362.99±72.75ng/L,IL-2含量为210.10±20.19ng/L,而生理盐水对照组含量均低于50ng/L(P<0.05)。免疫小鼠脾脏细菌负荷计数为5.57±0.37(log10CFU±S),而生理盐水对照组为6.54±0.22(P<0.05)。RpfA融合蛋白对H37Ra的生长有明显促进作用,而加入特异性多抗后可以抑制RpfA融合蛋白的促生长作用。结论RpfA融合蛋白免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫,可能作为基因疫苗的候选组分。RpfA融合蛋白对H37Ra生长有明显的刺激作用,可能作为快速培养检验结核分枝杆菌的添加组分。     

结核分枝杆菌ESAT6-RpfE亚单位疫苗的构建与免疫原性研究

目的 构建Mtb ESAT6-RpfE（早期分泌抗原靶6-复活促进因子E）的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究。方法 分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表达纯化ESAT6-RpfE蛋白。采用完全随机的方法将C57BL/6小鼠分组,每组6只,共进行了两次实验,第一次实验分为ESAT6、RpfE、ESAT6 RpfE、PBS、BCG五组,佐剂为二甲基三十六烷基胺（dimethyl dioctyldecyl ammonium bromide,DDA）;第二次实验有ESAT6-RpfE、PBS、BCG三组,佐剂为DPG［DDA+poly(I:C)+明胶］。分别于0、3、6周皮下免疫C57BL/6小鼠。末次免疫8周后,用特异性抗原ESAT6及RpfE刺激,检测其分泌IFN-γ的水平;ELISA检测血清特异性抗体IgG2b、IgG1。结果 PCR扩增的esat6、rpfE基因序列与GenBank报道一致;融合蛋白主要以包涵体形式表达;亚单位疫苗免疫动物能够分泌RpfE特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量［(427.13±100.46)］显著高于PBS组(26.13±22.34;q=7.924,P＜0.001); 分泌ESAT6刺激特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量［(506.50±140.40)］明显高于PBS组(19.25±14.75;q=11.36,P＜0.001)和 BCG组(125.5±46.41;q=8.882, P＜0.001)。ESAT6-RpfE免疫组能诱导产生特异性抗体。结论 成功构建并表达ESAT6-RpfE融合蛋白。此融合蛋白可在C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究。     

单耐利福平结核分枝杆菌耐药分子机制研究

目的 探讨单耐利福平结核分枝杆菌中耐药相关基因突变以及药物外排泵两种不同耐药机制的功能。 方法 从国家结核病参比实验室2007-2008年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐利福平的菌株23株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因rpoB突变情况。提取rpoB无突变菌株的RNA后反转录并采用real-time PCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量,对比菌株最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）实验结果,筛选可能与利福平药物外排相关的基因,并选用大肠埃希菌为模式生物,构建表达载体,检测过表达目的外排泵的大肠埃希菌对利福平的耐药程度以验证。结果 在23株单耐利福平的菌株中,有16株（69.6%）检测到rpoB突变,其中包括531位点突变9株,526位点突变6株及533位点突变1株。Ser531Leu、His526Asp表现为高浓度耐药,其MIC分别为192 μg/ml和256 μg/ml;而突变类型His526Gly、His526Leu、His526Arg和Leu533Pro表现为低浓度耐药,其MIC分别为0.75 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml和0.5 μg/ml。在rpoB未突变菌株中,通过real-time PCR发现Rv2936、Rv0783和Rv0933的转录水平与MIC呈正相关。在对照组和转入pEASY-E1-Rv0933的大肠埃希菌中MIC均为 8 μg/ml,而转入pEASY-E1-Rv2936和 pEASY-E1-Rv0783的大肠埃希菌的MIC均有不同程度的提高,分别为32 μg/ml和16 μg/ml。结论 不同耐药突变类型导致的耐药程度不同,Rv2936和Rv0783可能是与利福平耐药相关的的药物外排泵基因。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核分枝杆菌CFP-10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究

目的　通过构建结核分枝杆菌（结核菌）CFP-10和Rv2626c蛋白表达载体,并在大肠杆菌表达,对其免疫反应性进行鉴定评价。方法　用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA分别扩增出CFP-10、Rv2626c基因,连接到表达载体PET30a上, 在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His - Tag) 镍柱层析纯化重组蛋白;用ELISA方法进行检测。结果　构建了含CFP10、Rv2626c重组质粒的大肠杆菌工程菌, 发现目的蛋白主要以可溶形式存在;用重组CFP10、Rv2626c蛋白组成联合抗原, ELISA方法检测214份血清, 阳性率达77.1%。结论　目的基因克隆入宿主菌中并表达成功, 重组的CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。