蛋白C基因复合杂合突变导致的肺栓塞及家系研究

摘要：目的了解1例肺栓塞患者及其家系成员发生蛋白C缺陷症的分子发病学机制。方法收集先证者及其家系成员的枸橼
酸钠抗凝血,采用发色底物法检测PC活性（PC∶A）、蛋白S活性（FPS∶A）和抗凝血酶活性（AT∶A）,采用ELISA方法检测PC抗原
（PC∶Ag）水平。采用PCR方法对先证者PC基因所有9个外显子及其侧翼序列进行扩增、测序,发现突变后,对先证者家系成员
的PC基因有关外显子片段进行PCR扩增和测序。结果先证者及其父亲、母亲和妹妹均为Ⅱ型PC缺陷症患者。PC基因测序
结果显示先证者的PC基因分别出现了位于3号外显子第5540位碱基的G→A的杂合突变和位于第7号外显子第10230位碱基
C→T的杂合突变,导致PC E29K和R147W双杂合突变。先证者父亲携带PC E29K杂合突变,而先证者母亲和妹妹均为PC
R147W杂合突变的携带者。结论先证者为PC E29K和R147W基因复合杂合突变携带者,且这两种突变分别遗传自其父母。
其中,PC E29K错义点突变为目前国际上尚未见报道的新突变,而PC R147W是一种已报道的常见于遗传性易栓症患者的可导
致Ⅱ型PC缺乏的错义点突变。
     

一个遗传性蛋白C缺陷症家系表型与基因突变分析

目的：对一个遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系进行实验室表型检测和基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法：对先证者及其家系成员（共3代6人）进行血浆蛋白C活性（PC:A）、蛋白C抗原（PC:Ag）含量及其他相关凝血指标检测。采用DNA直接测序法分析先证者蛋白C基因（PROC）9个外显子及侧翼序列,发现突变位点,再对其家系成员进行该位点的突变检测。用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸突变位点的保守性;用PolyPhen-2在线生物信息学软件分析突变对蛋白质功能的危害程度;用Swiss-PdbViewer软件和PIC程序进行蛋白模型分析。结果：先证者、其儿子和二姐的血浆PC:A与PC:Ag均平行下降,介于39%～58%。这3人的PROC基因第9外显子携带c.997G＞A杂合错义突变（p.Ala291Thr）。生物信息学软件分析提示：p.Ala291Thr为有害突变;Ala291在同源物种间不高度保守;蛋白模型分析显示：p.Ala291Thr突变导致Thr291与Pro327之间新增一氢键,改变了氨基酸的空间构型,使PC的稳定性下降。结论：该先证者PROC基因第9外显子存在c.997G＞A杂合错义突变,导致p.Ala291Thr;p.Ala291Thr为未报道过的新突变,是该家系遗传性PC缺陷症的主要原因。     

蛋白C基因C5498T致Ⅰ型遗传性蛋白质C缺陷症

目的 对一个遗传性Ⅰ型蛋白C(PC)缺陷症家系进行基因突变的检测。方法 分别用ELISA和发色底物法测定血浆蛋白Ｃ活性和抗原。用PCR法对先证者PC基因的9个外显子及其侧翼、内含子2序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。突变位点经限制性内切酶分析证实。结果先证者的蛋白C活性和抗原分别为26％和1．43g／L。先证者表现为PＣ基因外显子3区杂合错义突变Ｃ5498T,引起Arg15→Ｔrp。在基因启动子区存在2405C／T、2418A／G、2583A／T多态性。结论 该突变导致遗传性Ⅰ型PC缺陷症。     

Pro 275 Ser纯合突变导致的Ⅱ型遗传性蛋白C缺陷症

目的 对1例Ⅱ型遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系进行基因突变的检测。方法 分别用发色底物法和ELISA测定血浆蛋白C活性和抗原。用PCR法对先证者PROC基因的9个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物经割胶纯化后直接测序,检测其基因突变。家系成员DNA在先证者PROC基因突变区域扩增后测序。突变位点经限制性内切酶分析证实,并经105例健康体检者作对照以排除基因多态性。结果 先证者的蛋白C活性和抗原分别为5％和13．9％。PROC基因测序分析发现先证者表现为外显子9区C12625T纯合错义突变,该突变引起编码的蛋白CPro275Ser氨基酸替换。结论 Pro275Ser纯合突变是导致该例先证者Ⅱ型遗传性Pc缺陷症的分子机制,该突变为国际首报。     

蛋白C错义突变Met406Ile致静脉血栓栓塞症的遗传表型及蛋白结构分析

目的 探讨l例蛋白C错义突变(Met406Ile)导致静脉血栓栓塞症的遗传表型和蛋白结构变化.方法 对1例遗传性蛋白C缺陷症家系进行家系调查.采用发色底物法检测家系成员蛋白C活性.抽提外周血基因组DNA,聚合聚合酶链反应(PCR)扩增PROC基因9个外显子,利用直接测序法进行基因序列分析.针对先证者突变位点,对其家系成员进行相应位点DNA测序.利用同源模建技术重建突变体PC三维空间构象,分析突变对其三维空间结构的影响.结果 先证者及4位家系成员蛋白C活性不同程度下降,分别为29.7％,42.2％,42.4％,67.3％和70.7％.其中先证者与3位家系成员携带相同突变类型(c.1218G＞A,Met406Ile).另1家系成员携带PROC基因多态性(rs1799810).同源模建显示:Met406Ile突变导致氨基酸残基间VDW作用半径减小,其中Gly418:C与Ile406CG2,Gly418:C与Ile406HG23,Leu419:N与Ile406:HG23间距离分别减少至2.0733(a)、1.620 45(a)和1.446 52(a).突变后PC蛋白能量由-8.504 54 kcal/mol增加至1210.04 kal/mol,范德华相互作用能变化显著.结论 该PC突变家系的9号外显子c.1218G＞A导致Met406Ile错义突变,突变后局部氨基酸互相碰撞,影响PC蛋白空间结构的稳定性.     

一个Ⅱ型遗传性抗凝血酶缺陷导致深静脉血栓形成的家系分析

目的 对一个Ⅱ型遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症家系进行表型及基因突变分析,探讨该症与深静脉血栓形成的关系。方法 回顾2020年2月于温州医科大学附属第一医院神经内科确诊的1例发生深静脉血栓的患者（先证者）临床资料;同时采用随机抽样法选取本院100名健康体检者作为正常对照。检测先证者及其家系成员（共3代11人）的血浆AT活性（AT:A）、AT抗原（AT∶Ag）、蛋白C活性（PC∶A）及蛋白S活性（PS∶A）等指标并进行分析。采用Sanger测序法分析SERPINC1基因全部外显子、侧翼序列、5’和3’端非编码区,寻找基因突变位点以及通过反向测序予以证实。运用3个在线生物信息学软件（MutationTaster、PolyPhen-2、LRT）分析突变氨基酸的致病性。结果 先证者及其大儿子、二女儿和外孙女的AT∶A均显著降低,分别为正常对照的32%、43%、52%和48%,先证者及其家系成员PC∶A、PS∶A及AT∶Ag指标均无明显异常,表现为Ⅱ型AT缺陷症。基因分析显示：先证者SERPINC1基因第7号外显子存在c.1346T>A杂合错义突变（p.Leu417Gln）,其大儿子、二女儿...     

一个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型与基因突变分析

目的：对一例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员进行凝血指标和基因表型分析,初步探讨其分子发病机制。方法：在Stago仪器上检测家系各成员外周血的血浆AT活性（AT:A）、AT抗原（AT:Ag）等凝血指标;提取外周血DNA并测序,定位基因突变位点;利用生物信息学软件分析突变对蛋白功能的影响。结果：先证者及其外祖母、父亲、母亲和弟弟的AT:A均有不同程度降低,且AT:Ag同步下降,所有家系成员蛋白S活性（PS:A）和蛋白C活性（PC:A）指标均无明显异常,表现为I型AT缺陷症。基因分析显示：先证者SERPINC1 基因存在第1号外显子c.1A＞G杂合错义突变（p.Tyr2stop）以及第5号外显子c.1005G＞A杂合同义突变;其父亲携带c.1A＞G杂合错义突变,其外婆、母亲和弟弟携带c.1005G＞A杂合同义突变。保守性分析显示,Tyr2在同源物种间高度保守;MutationTaster、PolyPhen-2和LRT三个在线生物信息学软件分析均显示p.Tyr2stop突变为“致病的、有害的”;蛋白模型分析显示,p.Tyr2stop突变会引起AT基因翻译过程提前终止,产生截短蛋白。结论：该先证者及家系成员AT:A和AT:Ag不同程度降低与SERPINC1 基因上存在的c.1A＞G杂合错义突变和c.1005G＞A杂合同义突变有关。     

同一等位基因复合杂合突变导致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症

目的对1例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断。方法采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员的AT抗原（AT：Ag）和AT活性（AT：A）,抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因（SERPINC1）7个外显子及其侧翼序列,应用直接测序法对先证者进行AT基因序列分析。针对先证者中发现的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在100例正常人中筛查以排除多态性。结果先证者AT：Ag和AT：A分别为114 mg/L和54.8%。其AT基因外显子2区发现了2个杂合点突变,分别为c.134G〉A和c.342T〉G。其家系部分成员检测到相应的杂合突变。家系遗传分析表明,2个杂合突变位于同一等位基因。结论同一等位基因复合杂合突变是导致该家系Ⅰ型遗传性AT缺陷症的分子原因。     

甲状腺激素受体β基因突变致甲状腺激素抵抗综合征家系分析

目的：对1例甲状腺激素抵抗综合征（RTH）先证者及其家系成员进行甲状腺激素受体β（TRβ）基因突变检测,并分析误诊情况。方法：取得先证者及家系成员知情同意后,收集RTH先证者及家系成员的临床资料,抽取先证者及其余10名家系成员的外周血抽提基因组DNA,应用PCR扩增TRβ基因的3-10号外显子编码区并直接测序,分析家系成员误诊情况。结果：11名家族成员中共发现3名患者,DNA测序结果显示先证者及其儿子、母亲TRβ第9外显子存在c.1234 A＞G（p.A317T）错义突变,为杂合突变。先证者表现为心悸消瘦,先证者儿子表现为多动,先证者母亲症状不明显。先证者和其儿子因在外院被误诊甲状腺功能亢进症已行放射性碘治疗,需终身甲状腺激素替代,先证者母亲因症状隐匿未被误诊误治。结论：TRβ基因第9外显子c.1234 A＞G突变是引起本家系RTH的原因,提高对该病的认识有助于避免不适当的治疗。     

一例原发性肺动脉高压家族的临床与遗传学特点

目的 阐明家族性原发性肺动脉高压(PPH)的临床与遗传学特点。方法 对河南省驻马店地区1例PPH家系成员进行了详细的临床及实验室检查。采集所有家系成员外周血并提取DNA,设计BMPR2基因外显子1-13含侧翼内含子序列引物,对聚合酶链式反应(PCR)扩增产物纯化后测序,与正常BMPR2基因序列比较。以100名正常志愿者的临床检查和测序结果作为对照。结果 发现先证者及其弟弟和先证者之女共3人患有重度肺动脉高压,肺源性心脏病,心脏扩大,心功能Ⅲ级。其中以先证者病情最为严重,35岁时发病。先证者之母于42岁发病,43岁去世;而先证者之女13岁即已发病。先证者其他家系成员临床检查未见异常。测序证实先证者等3例患者的BMPR2基因11号外显子的第491位密码子发生C—T转换,导致该位置编码的精氨酸(R)变为色氨酸（W),而其他家系成员没有发现此突变。对照组未见临床及遗传学检查的异常。结论 BMPR2基因的R491W错义突变可致汉族人群家族性PPH的发生,提示与白种人一样,BMPR2基因也是我国PPH重要的致病基因。此突变表型在本家系中表现出症状严重,外显率高的特征,且没有健康携带者,并有发病年龄逐渐提前的趋势。     

Biochemical activity and gene analysis of inherited protein C and antithrombin deficiency in two Chinese pedigrees

Background We identified the gene mutations in two Chinese pedigree of type Ⅰ hereditary protein C deficiency and type Ⅰ hereditary antithrombin deficiency.Methods The plasma level of protein C activity (PC: A), protein C antigen ( PC: Ag) , protein S activity, antithrombin activity (AT: A) and antithrombin antigen (AT: Ag) of propositi and two family members were detected using ELISA and chromogenic assay, respectively. All exons and intron-exon boundaries of protein C gene and antithrombin gene were analyzed by direct sequencing of the corresponding amplified PCR products in DNA from the propositus.Results The plasma PC: A and PC: Ag of propositus 1 was 26% and 1.43 mg/dl, respectively. The PC: Ag and PC: A of his father were normal. The decreased PC: A level was seen in his mother and 4 of his maternal pedigree. PS: A and AT: A were all normal in pedigree 1 members. A C5498T heterozygous mutation in exon 3 of protein C gene, resulting in the substitution of Arg for Trp at the 15th amino acid, was identified in propositus 1 and 8 of his relatives. The plasma AT: A and AT: Ag of propositus 2 was 48.6% and 10.4 mg/dl, respectively. The reduced AT: A and AT: Ag levels were found in his father and 5 of paternal pedigree. PC: A, PC: Ag and PS: A were all in normal range. A heterozygous 13387-9G deletion in exon 6 of antithrombin gene was identified in propositus 2. This mutation introduced a frameshift and a premature stop at codon 426 and existed in 6 members of pedigree 2.Conclusion The C5498T heterozygous mutation in exon 3 of protein C gene, first reported in China,leads to type Ⅰ hereditary protein C deficiency. The 13387-9G deletion, a novel mutation, can cause antithrombin deficiency and thrombosis.     

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病四个家系的NOTCH3基因突变研究

目的 报告4个伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)家系的NOTCH3基因突变特点。方法 对4个经临床和病理检查证实的CADASIL家系中的先证者作NOTCH3基因编码区外显子1～12的聚合酶链反应(PCR)和DNA测序,对家系2和4中的部分亲属也作了同样的检查。结果 4个家系中的先证者均发现有NOTCH3基因的杂合性错义突变,先证者1为外显子3的268C→T突变,先证者2为外显子3的322C→T突变,先证者3为外显子3的328C→T突变,先证者4为外显子11的1819C→T突变,分别造成Notch3蛋白质R90C、C108R、R110C和R607C4个位点氨基酸的替换。其中先证者2的C108R突变尚未见文献报道。在家系2和家系4中,部分成员也携带与先证者同样的突变。结论 这4个家系的CADASIL病均由NOTCH3基因的突变引起,不同位点的基因突变导致相似的临床表现。     

一个新的双重杂合突变Met306Val和Thr181Asn导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症

目的 对1例遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺乏症患者及其家系成员进行凝血因子Ⅶ（FⅦ）基因分析,揭示其发病的分子机制。方法提取先证者及其家系成员外周血基因组DNA,聚合酶链反应（PCR）法扩增FV0基因8个外显子及其侧翼序列,核苷酸序列分析检测FV0基因异常;将先证者突变序列、家系成员和100名正常人相应序列的PCR产物用限制性内切酶EC091I消化,以进一步确定基因突变位点并排除基因多态性;用蛋白质分子模型模拟软件对基因突变的分子结构病理学进行分析。结果先证者FV0基因8号外显子的10833位核苷酸发生A→G杂合突变,导致Met306Val;先证者7号外显子的9643位核苷酸发生C→A杂合突变,导致Thr181Asn。家系分析前者遗传于母亲,后者遗传于父亲,先证者胞妹为A10833G（Met306Val）杂合子。蛋白质空间构型模拟分析发现,Met306Val突变位于FⅦ分子的表面,产生空间位阻影响蛋白的结构和功能。结论FⅦ基因Met306Val和m18lAsn双重杂合突变是导致该遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症的分子机制;推测Met306Val突变改变了蛋白质分子的空间构型,从而影响FⅦ蛋白的功能。Met306Val突变是一种国际上尚未报道的新的突变类型。     

His348Gln杂合突变伴hrg353Gln杂合多态性导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系分析

目的：对1例遗传性凝血因子Ⅶ（FVH）缺陷患者进行基因分析和家系调查,初步探讨其发病的分子机制。方法：检测先证者及其家系成员凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶原活性（FII：C）、凝血因子V活性（FV：C）、FVII活性（FVII：C）和凝血因子x活性（FX：C）及FVII抗原（FVII：Ag）等进行表型诊断;用DNA直接测序法分析先证者Ⅳ基因的全部外显子、侧翼、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,用反向测序证实所发生的突变。结果：先证者PT延长为22．4s,FVII：C和FVII：Ag明显降低,分别为7％和10％;父亲、母亲、姐姐及儿子的PT正常或稍延长,FVII：c分别为63％、54％、57％和46％,FVH：Ag分别为67％、53％、61％和49％;先证者和所有家系成员的APTT及其他凝血指标均在正常参考范围内。测序发现先证者Ⅳ基因第8号外显子存在g．11482T〉G（His348Gln）杂合突变和g．11496G〉A（Arg353Gln）杂合多态性;其母亲、姐姐、儿子均存在F7基因g．11482T〉G杂合突变;父亲存在,7基因g．11496G〉A杂合多态性。结论：肜基因His348Gln杂合突变协同Arg353Gln杂合多态性是导致该先证者FVII缺陷症的分子机制。     

湖北地区一扩张型心肌病家系致病基因筛查

目的 对湖北地区一个扩张型心肌病家系成员进行致病候选基因筛查,寻求家族性扩张型心肌病致病基因,探讨基因型和表型关系.方法 先证者及其家族成员来自湖北省大冶市,先证者于2017年4月在武汉大学人民医院确诊为扩张型心肌病,已有家族成员死亡.详细询问先证者及其家属成员病史、家族史,并进行体格检查、血液指标、心脏超声和心电图检查.对患者的病史、家族史及检查结果分析.与先证者及其家属签订知情同意书,由武汉大学人民医院临床分子诊断中心对先证者候选致病基因全外显子高通量测序,获得可疑突变后,利用Sanger测序验证家系成员是否存在可疑突变.结果 家系先证者(Ⅲ3)和妹妹(Ⅲ2)携带肌联蛋白(TTN)c.100126A>G(P.Thr33376Ala)错义突变.先证者目前心功能下降并伴有恶性心律失常,而其妹妹无明显临床症状,心脏超声检查无异常.结论 本研究发现湖北地区一家族性扩张型心肌病家系存在TTN基因c.100126A>G(p.Thr33376Ala)错义突变,TTN与扩张型心肌病密切相关,是家族性扩张型心肌病重要致病基因.     

2代3人同患家族性高胆固醇血症及其低密度脂蛋白受体基因突变分析

目的　调查姐妹二人同患家族性高胆固醇血症的家系并进行系谱分析。方法　根据患者及其家系的血缘关系绘制家系图谱,分析临床症状和血脂检查资料。结果　先证者女性,17岁,血清胆固醇浓度为18.89 mmol/L,3岁时即有臀部黄色瘤, 17岁时首次发生前壁心肌梗死,其姐血清胆固醇浓度为15.23 mmol/L,全身多处黄脂瘤。初步诊断先证者为纯合子型,其姐为杂合型。检查患儿4代29人,根据血脂和临床表现确诊2例杂子型家族性高胆固醇血症患者,系谱分析该家系遗传方式符合常染色体显性遗传规律。结论　初步证实一个纯合子型家族性高胆固醇血症系谱。     

颗粒状角膜营养不良家系的BIGH3基因突变

目的 以基因突变分析一角膜营养不良家系的致病分子基础.方法 应用PCR产物直接DNA测序及限制性内切酶分析检测家系中7例患者和6例表型正常成员的K3、K12和BIGH3基因突变情况.结果 该家系患者成员在K3与K12基因的编码序列区没有发现突变,而BIGH3基因外显子12存在CGG＞TGG(R555W)突变杂合子,家系表现正常成员及正常对照均无BIGH3基因突变;限制性内切酶分析结果显示突变与疾病表现型呈完全共分离.结论 利用基因突变分析确诊我国首例报道的Meesmann角膜营养不良家系属于颗粒状角膜营养不良,且为BIGH3 R555W杂合突变类型.