蛋白C基因复合杂合突变导致的肺栓塞及家系研究

摘要：目的了解1例肺栓塞患者及其家系成员发生蛋白C缺陷症的分子发病学机制。方法收集先证者及其家系成员的枸橼
酸钠抗凝血,采用发色底物法检测PC活性（PC∶A）、蛋白S活性（FPS∶A）和抗凝血酶活性（AT∶A）,采用ELISA方法检测PC抗原
（PC∶Ag）水平。采用PCR方法对先证者PC基因所有9个外显子及其侧翼序列进行扩增、测序,发现突变后,对先证者家系成员
的PC基因有关外显子片段进行PCR扩增和测序。结果先证者及其父亲、母亲和妹妹均为Ⅱ型PC缺陷症患者。PC基因测序
结果显示先证者的PC基因分别出现了位于3号外显子第5540位碱基的G→A的杂合突变和位于第7号外显子第10230位碱基
C→T的杂合突变,导致PC E29K和R147W双杂合突变。先证者父亲携带PC E29K杂合突变,而先证者母亲和妹妹均为PC
R147W杂合突变的携带者。结论先证者为PC E29K和R147W基因复合杂合突变携带者,且这两种突变分别遗传自其父母。
其中,PC E29K错义点突变为目前国际上尚未见报道的新突变,而PC R147W是一种已报道的常见于遗传性易栓症患者的可导
致Ⅱ型PC缺乏的错义点突变。
     

复合杂合蛋白C基因突变致静脉血栓的分子发病机制研究

目的对2个复合杂合的蛋白C(PC)基因突变致静脉血栓的家系进行临床表型、基因型和分子发病机制的研究。方法对血浆蛋白C活性(PC:A)和抗原(PC:Ag)分别用发色底物法和ELISA法进行测定,以凝血酶生成试验检测患者凝血功能的变化。PCR法扩增先证者PC基因的9个外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。RT-PCR法结合定点突变法构建PC基因野生型和突变型表达质粒(PCwt、PCR178W、PCD255H、PCL-34P、PCT295I),瞬时转染COS-7细胞,检测细胞内、外PC:Ag的含量。利用细胞免疫荧光染色观察内质网和高尔基体中PC蛋白的定位。结果先证者1,28岁青年男性,临床诊断为下肢深静脉血栓和肺栓塞,PC:A21%,PC:Ag18.36%,为I型蛋白C缺陷症,基因分析显示在其PC基因7号和9号外显子分别存在R178W和D255H的复合杂合突变,其中D255H来自其父亲;先证者2,男,16岁,PC:A21%,PC:Ag20.04%,Ⅰ型PC缺陷症,在其PC基因的2号和9号外显子分别存在L-34P和T295I的复合杂合突变,其中L-34P来自其母亲,T295I来自其父亲。凝血酶生成试验显示其父母的抗凝功能减弱,凝血酶调节蛋白(TM)抑制凝血酶生成的能力降低。体外表达研究显示,PCL-34P只有7%分泌至细胞外,细胞内PC:Ag也只有8.72%,说明存在严重的分泌障碍和细胞内降解加速现象;PCR178W只有极少量(8%)从细胞内分泌,而PCD255H和PCT295I分别有57%和34%分泌至细胞外,细胞内PC:Ag含量分别是44.38%、38.05%和61.57%。细胞免疫荧光染色显示,PCT295I突变蛋白在内质网中滞留,在高尔基体中定位减少导致分泌减少。结论复合杂合性PC基因突变(R178W和D255H、L-34P和T295I)是导致此两例先证者1型遗传性PC缺陷症的原因。R178W、D255H、L-34P是国内首次报道的PC基因突变,T295I是国际首次报道的PC基因突变,分泌障碍和细胞内降解是R178W、D255H、L-34P和T295I导致PC缺陷症的分子机制。     

蛋白C P275S突变导致遗传性蛋白C缺陷症的分子机制研究

目的研究蛋白C（PC）基因P275S突变导致遗传性PC缺陷症的分子机制。方法构建PC基因野生型和P275S突变型表达质粒,并瞬时转染HEK293T细胞和COS 7细胞进行体外表达。ELISA检测转染细胞上清液和细胞裂解液的PC抗原;实时荧光RT-PCR（real time,RT-PCR）检测转染细胞PC mRNA表达量的改变;细胞免疫荧光染色检测PC在内质网和高尔基体内的分布。结果转染细胞上清液和细胞裂解液中的PC P275S抗原分别为野生型PC抗原的22.6%和78.9%;实时RT-PCR结果显示,与野生型PC相比,PC P275S突变体在mRNA水平没有减少;细胞免疫荧光染色显示,野生型PC蛋白在内质网和高尔基体中均有大量分布,而PC P275S突变蛋白主要位于内质网中。结论分泌障碍和细胞内降解是PC P275S导致PC缺陷症的原因。     

同一等位基因复合杂合突变导致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症

目的对1例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断。方法采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员的AT抗原（AT：Ag）和AT活性（AT：A）,抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因（SERPINC1）7个外显子及其侧翼序列,应用直接测序法对先证者进行AT基因序列分析。针对先证者中发现的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在100例正常人中筛查以排除多态性。结果先证者AT：Ag和AT：A分别为114 mg/L和54.8%。其AT基因外显子2区发现了2个杂合点突变,分别为c.134G〉A和c.342T〉G。其家系部分成员检测到相应的杂合突变。家系遗传分析表明,2个杂合突变位于同一等位基因。结论同一等位基因复合杂合突变是导致该家系Ⅰ型遗传性AT缺陷症的分子原因。     

抗凝血酶基因C2757T杂合突变致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症

遗传性抗凝血酶(antithrombin,AT)缺陷症是由AT基因突变引起,可分2型：Ⅰ型主要表现为AT抗原(AT：Ag)和活性(AT：A)水平的同步减低,Ⅱ型由AT结构异常所致。国外已报道300余例,基因突变种类超过130种;但国内仅我们报道过1例。本文对另一个AT缺陷症家系进行研究。发现此家系为Ⅰ型遗传性AT缺陷症,由AT基因C2757T杂合突变引起。     

复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI缺陷症家系分析

目的 寻找复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI(FXI)缺陷症患者家系的致病基因并初步探讨其分子致病机制。方法 检测先证者及家系成员(共13人)血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FXI活性(FXI:C)及FXI抗原(FXI:Ag)等指标;提取基因组DNA,用Sanger测序法分析先证者F11基因的全部外显子和侧翼序列,发现突变位点后反向测序予以证实,并检测家系成员相应的突变位点区域。ClustalX软件分析突变位点的保守性;用MutationTaster和PROXIEAN在线生物信息学软件预测突变位点对蛋白质功能的影响。用Swiss-PdbViewer软件构建突变蛋白模型。结果 先证者APTT明显延长,为85.9 s,其FXI:C和FXI:Ag均降低,分别为2%和4.8%;其母亲、二哥、二姐、侄子、外甥女和儿子FXI:C和FXI Ag也有不同程度下降。先证者F11基因第8外显子存在c.841C> T(p.Gln263stop)杂合突变及第10内含子3’端剪切位点突变(IVSJ-4del gttg);其母亲、二哥、侄子携带p.Gl...     

蛋白C基因新突变的分子发病机制研究

目的对一个新发现的蛋白C（protein C,PC）基因突变PC E29K进行体外表达研究以探讨其导致PC缺陷的分子发病机制。方法采用定点突变方法构建PC E29K突变表达质粒,脂质体法转染COS-7细胞、培养。采用ELISA法测定培养上清液和细胞裂解液中的PC：Ag,用激光共聚焦显微镜对培养细胞进行细胞免疫荧光染色分析。结果转染了突变质粒的Cos-7细胞培养上清中PC：Ag的含量为野生型的23.7%,细胞裂解液中PC：Ag的含量为野生型的81.1%。PC E29K突变型蛋白多在内质网中滞留,在高尔基体中定位减少。结论 PC E29K仅有部分从细胞内分泌出来,且部分在细胞内降解,因此,分泌障碍和部分降解加速是该突变导致PC缺陷的直接原因。     

一个复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XII缺陷症家系分析

目的：对一个复合杂合基因突变导致的遗传性凝血因子XII（FXII）缺陷症家系进行实验室表型和基因突变分析,寻找致病基因并初步探讨其分子发病机制。方法：检测先证者及其家系成员（共3代5人）血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血因子VIII促凝活性（FVIII:C）、凝血因子Ⅸ促凝活性（FIX:C）、凝血因子XI促凝活性（FXI:C）、XII促凝活性（FXII:C）和FXII抗原含量（FXII:Ag）等指标以明确诊断。采用PCR直接测序法分析先证者F12基因所有的外显子及其侧翼序列,对可疑的突变反向测序进行验证,并对家系成员的相应突变位点区域进行检测。采用ClustalX-2.1-win软件和4个在线生物信息工具（Mutation Taster、Poly-Phen-2、PROVEAN和SIFT）分析氨基酸突变位点的保守性和突变对蛋白质功能的可能影响;用Swiss-Pdb Viewer 4.0.1软件对突变位点进行蛋白模型相互作用分析。结果：先证者APTT为59.1 s,明显延长;FXII:C和FXII:Ag分别降低至4%和5%,其父亲、母亲、女儿的FXII:C和FXII:Ag降低至32%～37%。基因分析发现先证者F12基因第13号外显子存在复合杂合基因突变,即c.1561G＞A杂合错义突变（p.Glu502Lys）和c.1637T＞C杂合错义突变（p.Met527Thr）;其父亲为p.Met527Thr携带者,母亲和女儿为p.Glu502Lys携带者。保守性分析结果表明,Glu502和Met527在同源物种间高度保守;4个在线生物信息学软件对该两个突变的预测结果一致,均预示很可能是有害突变,可引起相关疾病。突变蛋白模型分析显示,野生型Glu502与His365之间形成1条氢键,Glu502替换为Lys502导致氢键的消失;野生型Met527与Leu524之间形成1条氢键,Met527替换为Thr527导致Thr527-Leu524之间增加2条氢键。结论：该先证者F12基因第13号外显子上存在p.Glu502Lys和p.Met527Thr复合杂合突变,推测该突变遗传自具有血缘关系且分别存在p.Glu502Lys和p.Met527Thr杂合子的父母,并与该家系FXII水平降低有关。     

蛋白C错义突变Met406Ile致静脉血栓栓塞症的遗传表型及蛋白结构分析

目的 探讨l例蛋白C错义突变(Met406Ile)导致静脉血栓栓塞症的遗传表型和蛋白结构变化.方法 对1例遗传性蛋白C缺陷症家系进行家系调查.采用发色底物法检测家系成员蛋白C活性.抽提外周血基因组DNA,聚合聚合酶链反应(PCR)扩增PROC基因9个外显子,利用直接测序法进行基因序列分析.针对先证者突变位点,对其家系成员进行相应位点DNA测序.利用同源模建技术重建突变体PC三维空间构象,分析突变对其三维空间结构的影响.结果 先证者及4位家系成员蛋白C活性不同程度下降,分别为29.7％,42.2％,42.4％,67.3％和70.7％.其中先证者与3位家系成员携带相同突变类型(c.1218G＞A,Met406Ile).另1家系成员携带PROC基因多态性(rs1799810).同源模建显示:Met406Ile突变导致氨基酸残基间VDW作用半径减小,其中Gly418:C与Ile406CG2,Gly418:C与Ile406HG23,Leu419:N与Ile406:HG23间距离分别减少至2.0733(a)、1.620 45(a)和1.446 52(a).突变后PC蛋白能量由-8.504 54 kcal/mol增加至1210.04 kal/mol,范德华相互作用能变化显著.结论 该PC突变家系的9号外显子c.1218G＞A导致Met406Ile错义突变,突变后局部氨基酸互相碰撞,影响PC蛋白空间结构的稳定性.     

C反应蛋白在肺栓塞患者中的临床价值

目的分析急性炎症因子C反应蛋白在深静脉血栓合并肺栓塞患者中的临床价值。方法对西安交通大学医学院第一附属医院2009年3月-2010年3月之间收住院的经过顺行性静脉造影或下肢静脉超声临床确诊的静脉血栓栓塞症患者268例进行统计,分为单纯深静脉血栓组(198例)和深静脉血栓合并肺栓塞组(70例),常规测定血浆C反应蛋白含量,分析两组C反应蛋白有无统计学差异。结果应用SPSS 13.0软件进行统计分析,并进行独立样本的t检验,结果表明深静脉血栓合并肺栓塞组C反应蛋白(72.780±33.724)mg/L明显高于单纯深静脉血栓组(39.220±49.633)mg/L,P<0.05。结论 C反应蛋白显著异常患者肺栓塞的可能性较大,C反应蛋白可以作为深静脉血栓住院患者合并肺栓塞的预测因子。     

蛋白C p.Ala333Thr突变引起遗传性蛋白C缺陷症的分子机制

目的：探讨蛋白C（PC）p.Ala333Thr突变导致遗传性蛋白C缺陷症（IPCD）的分子机制。方法：使用氨基酸多序列比对工具T-Coffee评估突变氨基酸位点的保守性,使用突变有害性评分工具PolyPhen-2预测突变对PC结构和功能的危害性。利用定点突变试剂盒QuickMutationTM构建PC基因（PROC ）野生型和p.Ala333Thr突变型质粒,并瞬时转染入HEK-293T细胞进行体外表达,RT-qPCR检测突变PC转录24 h后的mRNA水平变化,利用蛋白印迹法（Western blot）和ELISA分别检测突变PC胞内外水平变化,并对细胞内质网、高尔基体PC进行免疫荧光染色,初步探讨p.Ala333Thr突变导致IPCD的分子机制。结果：多序列比对结果显示PC的Ala333位点保守性不高,PolyPhen-2对PROC 的p.Ala333Thr突变评分为0.763。成功转染野生型与p.Ala333Thr突变型PROC 质粒后,突变型PROC 转录水平无明显变化;Western blot结果显示,突变型PROC的PC表达量明显下降;免疫荧光染色结果显示,野生型PC在内质网和高尔基体均有大量分布,而p.Ala333Thr突变型PC主要分布于内质网。结论：PROC p.Ala333Thr突变可能导致了PC的错误折叠和加工障碍,造成胞外PC表达量下降,最终引起了IPCD的发生。     

蛋白C、蛋白S缺乏症相关肺动脉血栓栓塞2例并文献复习

为提高对蛋白C(PC)/蛋白S(PS)缺乏症相关的肺动脉血栓栓塞症临床表现、诊治方法的认识,本研究分析了湘雅二医院收治的2例PC/PS缺乏相关肺动脉血栓栓塞患者的临床特点,并进行相关文献复习。两位男性患者年龄分别为29,26岁,临床症状主要表现为自发性反复双下肢肿痛,或胸闷气促、胸痛,或视力下将。血管彩超示下肢静脉血栓形成; 肺部血管造影(CTA)示双下肺动脉栓塞; 血清同型半胱氨酸浓度升高,血浆PC/PS总量明显降低,病例1为PC 57.4%,PS 28.9%; 病例2为PS 33.4%。患者行常规抗凝治疗疗效差,予以维生素B6、维生素B12联合抗凝治疗后症状改善。中青年无明显诱因的反复发作性下肢深静脉血栓形成及肺血栓栓塞,应考虑先天性易栓症可能性,血浆PC,PS浓度及活性检测具有重要的诊断治疗意义。     

一个遗传性蛋白C缺陷症家系表型与基因突变分析

目的：对一个遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系进行实验室表型检测和基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法：对先证者及其家系成员（共3代6人）进行血浆蛋白C活性（PC:A）、蛋白C抗原（PC:Ag）含量及其他相关凝血指标检测。采用DNA直接测序法分析先证者蛋白C基因（PROC）9个外显子及侧翼序列,发现突变位点,再对其家系成员进行该位点的突变检测。用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸突变位点的保守性;用PolyPhen-2在线生物信息学软件分析突变对蛋白质功能的危害程度;用Swiss-PdbViewer软件和PIC程序进行蛋白模型分析。结果：先证者、其儿子和二姐的血浆PC:A与PC:Ag均平行下降,介于39%～58%。这3人的PROC基因第9外显子携带c.997G＞A杂合错义突变（p.Ala291Thr）。生物信息学软件分析提示：p.Ala291Thr为有害突变;Ala291在同源物种间不高度保守;蛋白模型分析显示：p.Ala291Thr突变导致Thr291与Pro327之间新增一氢键,改变了氨基酸的空间构型,使PC的稳定性下降。结论：该先证者PROC基因第9外显子存在c.997G＞A杂合错义突变,导致p.Ala291Thr;p.Ala291Thr为未报道过的新突变,是该家系遗传性PC缺陷症的主要原因。     

ACTA-I基因复合杂合突变引起β-酮硫解酶缺乏症临床分析

目的：探讨β-酮硫解酶缺乏症（BKTD）的临床特点,以期早期诊断指导临床实践。方法：回顾性分析温州医科大学附属第二医院育英儿童医院收治的1例经基因测序确诊的BKTD病例,收集其临床症状、辅助检查结果和诊治方案。文献复习BKTD的诊治策略。结果：患儿,男,4岁,因酮症酸中毒2次入院。第1次发作年龄为1岁10个月,发作时血气分析均提示重度代谢性酸中毒,血氨、血乳酸、血脂、尿酸均正常。第1次发作时尿酮体++++,尿气相质谱检测显示除酮体升高外,2-甲基-3-羟基异丁酸升高。第2次发作伴低血糖,血糖2.6 mmol/L,血β-羟丁酸明显升高,血游离脂肪酸正常高限,尿酮体++。血串联质谱示3-羟基丁酸肉碱轻度增高,尿气相质谱示3-羟基丁酸增高,基因测序结果示ACTA-I c.370A＞C、c.473A＞G复合杂合突变,确诊BKTD。结论：婴幼儿在禁食或呼吸道感染或胃肠炎后发生无法解释的严重酮症酸中毒时需考虑BKTD的可能,血串联质谱、尿气相质谱分析有时无典型提示,需要ACTA-I基因型的检测做确诊。     

阿托伐他汀对急性肺动脉栓塞患者血清C-反应蛋白的影响

目的探讨阿托伐他汀早期干预对急性肺动脉血栓栓塞患者血清C-反应蛋白的影响。方法选取2010年10月～2012年12月确诊为急性肺动脉血栓栓塞患者58例。均给予常规治疗15 d。将其分为两组。对照组（n=32）给予常规治疗,阿托伐他汀组（n=26）在常规治疗基础上加用阿托伐他汀20 mg。比较两组血气分析、C-反应蛋白表达水平、右室内径、肺动脉压。应用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析,以P〈0.05为差异有统计学意义。结果阿托伐他汀组血气分析中动脉血氧分压（PaO2）在入院后6 h、3 d、15 d均略高于对照组[（83.25±10.01）mm Hg比（77.40±12.11）mm Hg,（90.34±4.01）mm Hg比（86.16±4.11）mm Hg,（89.59±3.05）mm Hg比（93.63±3.55）mm Hg,1 mm Hg=0.133 kPa],差异有统计学意义（P〈0.05）。阿托伐他汀组C-反应蛋白表达水平在入院后6 h、15 d低于对照组[（20.53±7.66）μg/L比（25.50±7.91）μg/L,（11.58±5.61）μg/L比（15.36±6.72）μg/L],差异有统计学意义（P〈0.05）。治疗15 d阿托伐他汀组右室内径[（23.1±5.5）mm比（28.4±6.3）mm]、肺动脉压平均值[（30.4±6.3）mm Hg比（36.6±8.5）mm Hg]低于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论常规治疗加用阿托伐他汀可进一步降低急性肺动脉栓塞患者C-反应蛋白表达水平,改善低氧血症,降低肺动脉压,可成为急性肺动脉栓塞患者辅助治疗的选择。     

影响急性肺栓塞预后的相关因素分析

目的:探讨影响急性肺栓塞预后的相关因素?方法:回顾性分析245例急性肺栓塞患者的资料并完成随访,将其分为急性期死亡组?后期死亡组及预后良好组,对各组患者的临床资料及死亡原因进行比较?结果:3组患者年龄?性别?吸烟史?合并高血压?糖尿病?冠心病?风心病?慢性肾病?结缔组织病?妊娠及脑血管病的比例无显著性差异?两死亡组合并恶性肿瘤?慢性心衰的比例较高,急性期死亡组合并感染性疾病的比例较高?后期死亡组合并慢性肺病的比例较高,预后良好组有发病前手术史的比例较高?恶性肿瘤进展是两组患者最主要的死因,后期死亡组还有相当比例的患者死于慢性血栓栓塞性肺动脉高压及消化道出血?结论:规范治疗后,部分血栓危险因素的存在可能并不会显著影响患者的预后,但合并恶性肿瘤?慢性肺部疾病?慢性心衰?严重感染性疾病则提示预后不良,以休克及简化肺栓塞严重指数评分为基础的危险分层是评估患者预后的有效方法,在长期随访中要关注慢性肺血栓栓塞性肺动脉高压的发生及消化道出血的预防?     

肺栓塞106例临床分析

目的分析肺栓塞（pulmonary embolism,PE）的临床特点和诊疗方法,提高诊治水平。方法回顾性分析106例住院治疗的PE病例的临床特点、诊断和治疗方法以及效果。结果PE患者近年增加明显,存在易患因素,以下肢静脉深静脉血栓形成为最常见的因素。其症状和体征是非特异性的,最常见临床表现为呼吸困难;螺旋CT、放射性核素肺通气/灌注显像、肺动脉造影等均有助于诊断。溶栓治疗12例,存活10例;介入治疗11例,存活9例;单纯抗凝治疗83例,存活74例。结论提高对PE的认识,对及时准确诊断PE具有重要意义;螺旋CT、放射性核素肺通气/灌注显像、肺动脉造影是诊断PE的有效方法。恰当的治疗策略对改善预后具有积极意义。     

肺动脉高压合并矛盾性栓塞临床分析

目的 探讨肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）合并矛盾性栓塞（paradoxical embolism,PDE）的诊断思路。方法 回顾性总结2001年1月-2012年1月于北京中医药大学附属护国寺中医院住院并诊断PAH患者418例,根据多普勒超声心动图和（或）右心导管检查分为PAH不合并PDE组（350例）和PAH合并PDE组（68例）,对比分析两组一般资料、病死率及医患矛盾投诉的差异,并计算PAH合并PDE患者首发表现的百分比。结果 PAH合并PDE组自身免疫病、慢性阻塞性肺病及肺栓塞病例高于不合并PDE组（P〈0.05）;PAH合并PDE组死亡病例高于不合并PDE组,且合并PDE组以脑卒中为首发表现的病例最多,占51.5%。结论 肺动脉高压合并矛盾性栓塞易被临床忽视或缺少预见性,因其病死率较高且容易造成医患矛盾,应及早处理,对于合并不明原因的体循环动脉栓塞时应考虑到矛盾性栓塞可能。