两种方法提取的人血清对体外培养人真皮成纤维细胞促增殖作用的比较研究

摘要：目的使用两种不同方法提取人血清,研究对比得出最快速、廉价、安全而有效的富含生长因子的人血清提取方法,以促进
其在临床上的应用。方法分离并培养人真皮成纤维细胞。分别使用全血凝固后离心法和Anitua法提取人血清。测定各血清
样本中PDGF-AB及TGF-β1的含量。分别使用含有10%胎牛血清（FBS）和10%人血清（HS）的DMEM培养基培养成纤维细胞,
比较不同培养基对细胞形态、活力、增殖的影响。结果各组细胞形态正常,增殖活力良好。B组（全血凝固后离心组）细胞的数
量及活力均明显高于其他各组（P<0.05）,且该法获得的血清中生长因子含量最高（P<0.05）,与生长曲线及MTT曲线所示结果
一致。结论全血凝固后离心法提取的HS内所含生长因子浓度最高,对细胞生长促进作用最大,提取方法简单、廉价、有效。
     

人表皮细胞的培养方法探讨

目的 探讨适合临床推广、应用的人表皮细胞培养方法。方法 对比人表皮细胞在无血清培养基K—SFM及有血清培养基DMBM中的生长情况。结果 人表皮细胞在无血清培养基K—SFM中生长快，细胞形态好，不易被成纤维细胞污染。结论 应用无血清培养基K—SFM培养人表皮细胞，方法简便，适合临床推广应用。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性研究

目的建立体外分离培养人骨髓间充质干细胞(Human Bone-marrow Mesenchymal Stem Cells,hBMSCs)的方法,建立稳定的hBMSCs体外扩增体系。方法采用密度梯度离心法分离、培养hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表型、细胞周期、绘制生长曲线。结果在体外培养条件下,hBMSCs贴壁生长,为成纤维细胞样,CD34/CD45阴性、生长曲线呈S型。结论采用密度梯度离心法获得的hBMSCs纯度较高,形态单一,生长稳定、增殖能力较强,具有独特的生物学特征。     

益气养阴法及其组方抗细胞衰老的实验研究

目的:研究益气养阴法及其组方对体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞衰老的影响。方法:将健康雄性SD大鼠随机分为中药组、维生素E组、生理盐水组,采用益气养阴中药、维生素E胶丸、生理盐水分别灌胃3组大鼠,提取含药血清,将提取的血清培养二倍体人胚肺成纤维细胞(MRC-5)。从第28代开始在培养液中加入10%含药血清培养细胞,观察细胞形态、细胞群体倍增曲线、细胞传代次数、细胞生长曲线情况,并进行组间对比分析。结果:中药组与维生素E组及生理盐水组比较,中药组细胞开始出现衰老的时间及细胞死亡的时间明显延迟,差异有统计学意义(P<0.01);用含药血清培养后,中药组细胞密度较维生素E组及生理盐水组明显增高(P<0.01);中药组细胞传代代数与维生素E组比较差异有统计学意义(P<0.05);而生理盐水组细胞传代代数,明显低于中药组及维生素E组(P<0.01)。结论:益气养阴中药组方可以显著延长体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞的寿命,同时能增强衰老细胞的增殖分裂能力,从而延缓细胞的衰老。     

人食管上皮细胞培养、冻存及复苏方法的实验研究

目的比较K-SFM无血清培养基及DMEM有血清培养基在人食管上皮细胞培养中的作用,并比较不同冻存方法对人食管上皮细胞复苏后存活率的影响,探讨适合应用于组织工程食管研究的人食管上皮细胞培养、冻存及复苏方法。方法人食管上皮细胞来源于食管癌患者手术切除的食管。采用组织块法和消化法培养,两种方法均分别加入K-SFM无血清培养基及DMEM有血清培养基。采用直接观察、锥虫蓝染色活力鉴定及细胞计数法绘制细胞生长曲线,对比细胞在不同培养基中的生长情况。分别以两种培养基配制的冻存液进行冻存,复苏后的细胞采用锥虫蓝染色法鉴定其存活率。结果细胞呈典型“铺路石”状排列,免疫组织化学检测细胞角蛋白呈阳性结果,证明培养的细胞为人食管上皮细胞。人食管上皮细胞在K-SFM无血清培养基中生长快,细胞形态好,不易被成纤维细胞污染。以K-SFM培养液配制的冻存液冻存的细胞复苏后的存活率明显高于以DMEM配制的培养液。结论应用K-SFM无血清培养基培养和冻存人食管上皮细胞的方法简便、培养效果好,适合推广应用。     

银耳多糖对肝癌细胞株HepG-2增殖的影响

目的:研究银耳多糖对肝癌HepG-2细胞增殖的影响。方法:采用高温浸提的方法提取银耳多糖,并进行提取定量;将银耳多糖作用于肝癌HepG-2细胞,采用台盼蓝排斥试验测定细胞活力和生长曲线。结果:在分别培养1 d、2d和3 d后,银耳多糖干预各组的活细胞率都低于对照组(P<0.001)。生长曲线法显示,银耳多糖干预各组的细胞倍增时间延长,银耳多糖对增殖细胞的杀伤率最高达89.29%(>80%),且存在剂量依赖关系。结论:银耳多糖对肝癌HepG-2细胞具有直接抑制作用。     

人胚胎干细胞培养体系的研究进展

人胚胎干细胞(hESC)具有显著的增殖能力和分化潜能,已经成为研究再生医学、药物学、药理毒理学、人胚胎发育学和功能基因组学的种子细胞库.hESC在长期维持培养中保持增殖潜能和未分化状态需要饲养层细胞或基质蛋白、血清或基因敲除血清(KSR)以及碱性成纤维生长因子、骨形态蛋白、转化生长因子、激活素A等生长因子.本文就hESC培养体系的传统小鼠胚胎成纤维细胞饲养层、人源性饲养层、Matergel胶、KSR取代血清、在基质中加入明确的不同的细胞因子等培养方案和hESC的组织工程学应用的研究现状及进展作一综述.     

胎鼠神经干细胞分离培养和鉴定

目的:建立胎鼠神经干细胞体外培养方法,观察神经干细胞生长特点。方法:采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的无血清培养基对大鼠胚胎大脑组织细胞悬液进行培养,细胞免疫荧光方法对神经干细胞鉴定,MTT法测定不同细胞密度的OD值,绘制生长曲线。结果:从胎鼠脑组织分离培养的细胞巢蛋白阳性。MTT结果显示细胞接种密度以2(×104～105)/ml生长良好(r=0.95,P<0.05)。结论:无血清培养基分离培养的胎鼠脑组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,巢蛋白细胞免疫鉴定为神经干细胞。     

人胚中脑神经干细胞的分离、增殖及分化的研究

目的　探讨人胚中脑腹侧神经干细胞的分离、增殖条件及分化方向。方法　应用表皮生长因子 (ＥＧＦ)和成纤维细胞生长因子 2 (ＦＧＦ 2 )使人胚中脑腹侧幼稚细胞维持在未分化状态并促进其增殖 ;通过克隆分析、细胞增殖曲线及流式细胞仪检测培养细胞的增殖能力 ;应用免疫组织化学方法鉴定这些细胞的分化方向。结果　该细胞群具有一定的增殖能力 ,在撤除生长因子后至少能分化为神经元和星形胶质细胞 ,但未检测到多巴胺能神经元。结论　从人胚中脑腹侧分离出的幼稚细胞具有一定的增殖和自我更新能力 ,有多向分化潜能 ,具备中枢神经系统干细胞的…     

无血清培养人肝癌细胞增生率的变化和bFGF在细胞中的表达

采用无血清培养体系 ,研究肿瘤细胞自分泌调控机制。将人肝癌细胞培养在无血清无外源分裂因子培养基中 ,采用细胞原位计数法和免疫组织化学染色法 ,观察不同时相人肝癌细胞增生率的变化以及碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的表达情况。结果 :人肝癌细胞生长良好 ,其增生速度与其分泌的bFGF量成正比。提示 :肝癌细胞在无外源生长因子的条件下通过分泌bFGF ,以自分泌和旁分泌的方式作用于自身和相邻细胞 ,促进细胞生长和增生。     

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10％胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,分析细胞周期,检测细胞表面抗原。结果采用Percoll（1．073g／mL）分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀,梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50％～70％细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

当归对人脐血间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨当归对人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及当归诱导后脐血间充质干细胞nestin变化情况。方法:无菌条件下收集新生儿脐血,以Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法分离单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)。分离获得的MNCs采用DMEM/F12培养基/10%胎牛血清进行MNCs培养传代。向培养基内加入1μl/ml当归注射液,分为两组,阳性对照组为加当归注射液,阴性对照组不加当归注射液,进行台盼兰染色活细胞计数,以平均数为结果分别绘制两组的细胞生长曲线。对人脐血间充质干细胞进行神经标志物nestin的免疫组化检查。结果:阳性对照组脐血MSCs细胞生长曲线比阴性对照组高,在体外应用当归诱导后表达nestin。结论:当归注射液有促进脐血MSCs分化增值的作用,脐血MSC具有较强的可朔性,当归在体外使脐血间充质干细胞nestin表达增高。     

组织块法培养人胃成纤维细胞及其结缔组织生长因子的表达

[目的]探索人胃成纤维细胞体外培养的技术方法及其结缔组织生长因子表达情况。[方法]采用组织块贴壁培养法进行人胃成纤维细胞体外培养并传代,倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态,并用免疫细胞化学法检测培养细胞的波形蛋白与角蛋白表达。用RT-PCR法检测人胃成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达,免疫细胞荧光染色法检测人胃成纤维细胞CTGF蛋白表达情况。[结果]人胃成纤维细胞培养成功传代,表现为长梭形或星形细胞,免疫细胞化学鉴定细胞波形蛋白阳性,角蛋白阴性。RT-PCR法与免疫细胞荧光染色法证实体外培养的人胃纤维细胞表达CTGF。[结论]组织块法培养的人胃成纤维细胞可在体外稳定培养、传代,人胃成纤维细胞能合成CTGF。     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用

目的探讨人胎盘源问充质干细胞（PMSCs）对脐血单个核细胞（MNCs）体外生长的支持作用。方法将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁培养获得人PMSCs，用流式细胞仪检测细胞表面标志。以密度梯度离心法分离脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养，通过细胞计数和流式细胞仪分别检测细胞的生长情况。结果从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs，经流式细胞仪检测其表型为CD29^＋,CD44^＋,CD105^＋、CD106^＋、CD166^＋、CD34^-,CD45^-、HLA—DR^-。人PMSCs＋脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45^＋细胞数在各培养时间点均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。在培养第7天，CD45^＋、CD14^＋及CD19^＋细胞数共培养组也明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。     

人羊膜上皮细胞的体外培养及标记

目的 改良人羊膜上皮细胞的培养方法,检测生长特性,观察DAPI标记HAECs的效率。 方法 取足月剖宫产术后羊膜经胶原酶和胰蛋白酶消化获得上皮细胞。MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞的生长周期,免疫组化对细胞角蛋白进行鉴定。并用DAPI标记,测1、2周荧光阳性率。 结果 培养的HAECs多角形,生长分为缓滞期、对数增长期和平台期,约80%处于细胞周期的静止期G0。细胞角蛋白keratin阳性表达。DAPI标记1周标记率为100%;2周细胞形态好,标记率不变,荧光强度减弱。 结论 本实验方法成功培养人羊膜上皮细胞。DAPI短期标记效果理想。     

骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达造血生长因子的实验研究

目的在分子生物学水平上探讨体外培养的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达TPO、GM-CSF、SCF的mRNA的能力的差异.方法收集培养28d的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞,采用RT-PCR方法在mRNA水平上分析其造血生长因子GM-CSF、SCF、TPO的表达,比较二者表达TPO、GM-CSF、SCF等造血生长因子的mRNA能力的差异.结果体外培养的人脐血基质细胞与骨髓基质细胞均能表达:(1)TPO的mRNA,人脐血基质细胞表达能力强于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为1.57;(2)SCF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.83;(3)GM-CSF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.68.结论人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可以表达造血生长因子TPO、GM-CSF、SCF的mRNA,具有支持调控造血的物质基础.     

人皮肤瘢痕成纤维细胞原代培养及其生长曲线的研究

目的 建立可靠的人皮肤瘢痕成纤维细胞培养方法,探索细胞的生长规律,为皮肤瘢痕体外研究提供平台.方法 采用组织块贴壁法原代培养瘢痕成纤维细胞,波形蛋白免疫细胞化学法鉴定成纤维细胞,CCK-8测定细胞生长曲线.结果 人皮肤瘢痕原代成纤维细胞培养成功,细胞形态为长梭形,波形蛋白表达阳性,16～18天可传第1代,以后每7～8天可传1代,传代后5～6天时为活跃期,第7天进入停滞期.结论 培养出的人皮肤瘢痕成纤维细胞在传代后第5～6天最适于于体外实验研究.     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

人胚胎成纤维细胞的分离、培养和鉴定及人胚胎生殖细胞体外生长所需细胞因子的表达

目的：从人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜中分离、培养及鉴定人胚胎成纤维细胞(hEFs),检测hEFs表达人胚胎生殖细胞（hEG）体外生长所需的重要细胞因子。方法：利用酶消化法从孕5～9周龄人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜中分离培养hEFs,检测其生物学特性（细胞形态、细胞生长特点、细胞周期）。采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测hEFs表达成纤维细胞特异性标志（脯氨酰4-羟化酶β亚单位）和上皮细胞特异性标志（细胞角蛋白4）的情况,对该细胞进行鉴定。应用RT-PCR检测hEG生长所需的重要细胞因子的表达,即碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和白血病抑制因子（LIF）。结果：从人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜中成功地分离培养出hEFs,该细胞可传25代以上,且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变;hEFs表达脯氨酰4-羟化酶β亚单位,不表达细胞角蛋白4,确定其为成纤维细胞;该成纤维细胞表达bFGF和LIF。结论：成功地分离和培养了人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维细胞,证明其表达对于hEG体外生长起重要作用的细胞因子。     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.