mtHSP70/HSV-tk重组沙门菌抗小鼠黑色素瘤的作用

摘要：目的研究携带结核杆菌热休克蛋白70（mtHSP70）、人单纯疱疹病毒一胸苷激酶（HSV-TK）双基因的重组沙门菌瘤内注射
抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效应。方法构建重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK,建立小鼠黑色素瘤动物模型,瘤内注
射重组沙门菌观察其抑瘤效应、荷瘤鼠的生存期并进行安全性评估。结果瘤内注射重组沙门菌,实验组抑瘤率显著高于对照
组,延长荷瘤鼠生存期,重组菌治疗后荷瘤小鼠的生存状态良好,无腹泻,治疗期间体质量无明显改变。结论减毒沙门菌携带
的mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒瘤内注射对B16肿瘤细胞具有显著抑制作用。
     

mtHSP70/HSV-tk 重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤实验研究

研究携带结核杆菌热休克蛋白70（mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70, mtHSP70）、人单纯疱疹病毒－胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase ,HSV-TK）双基因的重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效应及机制。方法 将PCMV-mtHSP70-IRES-TK双基因真核共表达质粒电穿孔至减毒沙门菌SL7207,构建重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK,体外感染小鼠黑色素瘤细胞株 B16,观察重组菌对 B16 细胞的侵袭性和 mtHSP70/HSV-TK 双基因的表达;构建小鼠黑色素动物模型,瘤内注射重组沙门菌观察其抑瘤效应,流式细胞术检测治疗后小鼠外周血CD3+\CD4+和CD3+\CD8+T 细胞 NK 细胞的分布,Elisa检测瘤组织中IFN-r的含量。结果 体外实验表明重组沙门菌侵入B16细胞中并表达目的基因;瘤内注射重组沙门菌,实验组抑瘤率显著高于对照组,实验组外周血CD8+T淋巴细胞及瘤组织内IFN-r含量显著高于对照组。结论 减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒瘤内注射对B16肿瘤细胞具有侵袭性且能引起强烈的细胞毒性T细胞反应,能显著抑制肿瘤的生长。     

荷瘤小鼠口服重组减毒鼠伤寒沙门菌后瘤体内富集效果的观察

目的观察重组减毒鼠伤寒沙门菌作为基因载体在人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤中的富集情况和对外源基因的呈递能力。方法以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,以减毒鼠伤寒沙门菌SL7207为转基因载体,分别构建原核启动GFP表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pUC-GFP和真核启动GFP表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pEG-FP-N1。原核菌SL7207-pUC-GFP在体外连续传代,观察GFP基因表达的稳定性;同时,对荷人涎腺腺样囊性癌皮下移植瘤裸鼠模型口服给予原核菌SL7207-pUC-GFP(0.1mL,1×109cfu/mL),在口服后24h、48h、5d、10d、20d、30d处死荷瘤裸鼠,获取肝、脾及肿瘤组织并制成匀浆液进行重组菌培养及GFP表达检测,观察重组菌在瘤体细胞内富集情况。对荷瘤裸鼠模型口服给予真核菌SL7207-pEGFP-N1,5d后取肝、脾及肿瘤组织进行冰冻组织切片,荧光显微镜下观察GFP的表达,了解重组菌携带外源基因在肿瘤细胞内的表达。结果携带GFP原核表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pUC-GFP在体外连续传代10次未见表达减少或缺失。荷瘤裸鼠口服原核表达GFP基因重组菌SL7207-pUC-GFP菌液实验表明,重组菌SL7207-pUC-GFP在肝、脾及肿瘤组织中能长期存活,以肿瘤组织中聚集明显(P<0.05)且维持时间较长。荷瘤裸鼠口服真核表达GFP基因重组菌SL7207-pEGFP-N1菌液实验表明,相对肝脏和脾脏组织,外源基因在肿瘤细胞内表达量最高。结论重组减毒鼠伤寒沙门菌可以在瘤体细胞内富集存活,并且携带的外源基因可以释放到肿瘤细胞内表达,具有作为基因治疗载体的双重优势。     

负载肿瘤抗原的DC疫苗对小鼠体内膀胱肿瘤的抑制作用

目的 研究负载肿瘤抗原的DC疫苗对T739小鼠体内膀胱肿瘤的免疫学效应.方法 建立BTT 739荷瘤小鼠动物模型,随机分为实验组和实验对照组和空白对照组,于肿瘤细胞接种后第7、14天给予相应DC疫苗治疗,每组分2亚组,分别用于测量瘤质量、体积及用于观察荷瘤小鼠存活情况.结果 负载肿瘤抗原的DC疫苗实验组荷瘤鼠肿瘤平均体积和平均瘤质量均显著低于对照组(P＜0.01),生存期长于对照组,并且有2只小鼠无瘤长期存活.经DC疫苗实验组治愈的2只小鼠30 d后无肿瘤生长,再次皮下接种BTT739细胞观察30 d仍无肿瘤发生.结沦负载肿瘤抗原的DC疫苗对膀胱肿瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效应和生存期延长作用.     

携带flk-l的减毒沙门疫苗菌抗胶质瘤血管生成的研究

目的观察表达鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR2,flk-1)的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤血管及肿瘤生长抑制作用。方法构建真核表达载体pcDNA3 1.-flk-l,通过电转化法将pcDNA3 1.-flk-1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,经由胃管饲于C57BL/6J小鼠,对胶质瘤荷瘤小鼠进行免疫预防及治疗。通过观察免疫动物的生存期,免疫荧光法检测肿瘤血管密度,评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。分离免疫小鼠的脾细胞,分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞(CTL)应答。结果重组疫苗菌免疫能够明显减少肿瘤血管密度,延缓胶质瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果。重组疫苗菌免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对flk-l的CTL活性。结论表达鼠flk-l的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌经口服免疫,可打破小鼠对于自身抗原flk-1的免疫耐受,诱导小鼠产生抗flk-1的特异性免疫反应,特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞,预防和治疗小鼠胶质瘤。     

携带flk-1的减毒沙门疫苗菌抗胶质瘤血管生成的研究

目的观察表达鼠血管内皮生长因子受体2（VEGFR2，flk-1）的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤血管及肿瘤生长抑制作用。方法构建真核表达载体pcDNA3、1-flk-1通过电转化法将pcDNA3．1-flk-1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中，经由胃管饲于C57BL／6J小鼠，对胶质瘤荷瘤小鼠进行免疫预防及治疗。通过观察免疫动物的生存期，免疫荧光法检测肿瘤血管密度，评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。分离免疫小鼠的脾细胞，分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞（CTL）应答。结果重组疫苗菌免疫能够明显减少肿瘤血管密度，延缓胶质瘤的生长，延长小鼠生存期，获得明显的抗肿瘤效果。重组疫苗菌免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对flk-1的CTL活性。结论表达鼠flk-1的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌经口服免疫，可打破小鼠对于自身抗原flk-1的免疫耐受，诱导小鼠产生抗flk-1的特异性免疫反应，特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞，预防和治疗小鼠胶质瘤。     

瘤体内注射肿瘤坏死因子重组腺病毒对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的:观察腺病毒重组肿瘤坏死因子(TNF)基因转染对大鼠乳腺癌细胞Walker256体内致瘤性的影响及瘤体内注射TNF重组腺病毒对Walker256荷瘤大鼠的治疗作用.方法:Walker256乳癌细胞感染人TNF重组腺病毒后,观察其体外增殖能力、皮下致瘤性的变化及进行肿瘤局部病理学检查;瘤体局部注射TNF重组腺病毒(Ad.hTNF),观察荷瘤大鼠的肿瘤生长情况及生存期.结果:Walker256感染人TNF重组腺病毒后,培养上清中24 h TNF的分泌量达5.2 ng/106细胞,细胞形态学无明显变化,体外增殖能力和皮下致瘤性显著下降,瘤体周围有大量淋巴细胞及单核细胞浸润;肿瘤局部注射Ad.hTNF能显著抑制Walker256的生长,并延长荷瘤大鼠的生存期.结论:重组腺病毒能有效介导TNF基因转染Walker256细胞,瘤体内局部注射Ad.hTNF对Walker256荷瘤大鼠具有明显的治疗作用.     

减毒沙门菌介导联合基因对腺样囊性癌血管生成的抑制作用

目的:观察构建含有Tip30与人IFN-γ基因的真核表达及共表达质粒的重组减毒沙门菌对腺样囊性癌荷瘤裸鼠肿瘤血管生成的抑制作用.方法:4周龄BALB/c nu nu雄鼠25只,随机分成5组,对照组(PBS组)、单纯减毒沙门菌组(SL7207组)、携带人IFN-γ基因减毒沙门菌治疗组(SL7207/pCI-IFN组)、携带Tip30基因减毒沙门菌治疗组(SL7207/pCI-Tip30组)、携带Tip30与人IFN-γ基因的真核共表达质粒的重组减毒沙门菌治疗组(SL7207/pCI-Tip30/IFN组),均于颌下接种腺样囊性癌(ACC-2)细胞.10 d后对照组裸鼠口服PBS,其余各治疗组口服相应的减毒沙门菌,隔周1次,共3次.然后检测肿瘤生长体积、带瘤存活期、裸鼠体内肿瘤的微血管密度(MVD).结果:各治疗组比较对照组、携带基因治疗组比较SL7207组、联合基因治疗组比较单基因治疗组肿瘤生长慢、体积小,带瘤存活期长(P<0.05);携带Tip30基因治疗组MVD较其他3组低,联合基因组较携带Tip30单基因组MVD低(P<0.05).结论:减毒沙门菌载体分别介导Tip30、IFN-γ基因有抑制肿瘤生长作用,联合基因较单基因治疗效果好,有协同作用.     

含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体对荷B16黑色素瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体（AdCMVGM-CSF）直接注射荷B16黑色素瘤小鼠瘤体内对小鼠免疫功能的影响。 方法：将B16黑色素瘤细胞（5×10⁶/只）接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,将荷瘤小 鼠随机分为2组,每组12只,待瘤体直径达5 mm时分别注射AdCMVGM-CSF、AdCMVLacZ （5×10⁸ PFU/只）,检测每组小鼠的免疫功能及其对B16黑色素瘤的抑制作用。 结果：AdCMVGM-CSF实验组小鼠注射后第10天,荷瘤鼠血清中GM-CSF水平［(1 563.72±136.58)ng·L^-1］高于对照组（P<0.01）,肿瘤组织周围的CD8＋ T细胞表达明显增强。 结论：AdCMVGM-CSF可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,具有抑制肿瘤生长的作用。     

内皮抑素基因腺病毒联合化疗治疗小鼠Lewis肺癌

目的:研究腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因联合化疗对肺癌的综合治疗作用.方法:利用病毒重组技术将内皮抑素基因克隆入增殖缺陷型腺病毒基因组中,构建携带内皮抑素基因的重组腺病毒Ad-mES,复制小鼠Lewis肺癌的动物模型,随机分成4组,每组10只:化疗组,皮下隔日注射环磷酰胺150 mg/kg,共3次;基因治疗组,一次性瘤内多点注射6×1010 pfu/ml的Ad-mES病毒纯化液100 μl;基因联合化疗组,Ad-mES病毒纯化液联合环磷酰胺,剂量同上;对照组,以0.9%生理盐水100 μl替代环磷酰胺.定期测量各组肿瘤体积,采用Western印迹分析检测基因转导后肿瘤组织中内皮抑素的表达,应用免疫组化法检测肿瘤微血管密度(MVD),观察内皮抑素基因对肿瘤血管生长的抑制作用.结果:构建了表达内皮抑素的重组腺病毒载体Ad-mES;各治疗组荷瘤C57BL/6小鼠肿瘤生长抑制明显,以基因联合化疗组尤为显著(P＜0.01);基因治疗组和基因联合化疗组MVD与对照组和化疗组相比差异显著(P＜0.05).基因治疗过程中未见明显不良反应,且荷瘤鼠生存期明显延长,以联合治疗组为著(P＜0.05).结论:所构建的Ad-mES重组腺病毒载体可有效表达具有生物学活性的内皮抑素;并能减少肿瘤内微血管生成、减慢肿瘤增殖、延长生存期.     

携带siRNA-Stat3质粒减毒沙门氏菌对肝原位移植瘤的治疗作用

目的：观察携带有siRNA-Stat3质粒的鼠减毒沙门氏菌对小鼠肝脏原位移植瘤的治疗作用及效果。方法：将siRNA-Stat3质粒经电转化方法转入减毒鼠沙门氏菌中,将肝原位移植瘤小鼠分为mock未治疗组、pGC-Si-Stat3组和pGC-Si-Scramble组。pGC-Si-Stat3组小鼠灌胃转化有siRNA-Stat3质粒减毒沙门氏菌,pGC-Si-Scramble组小鼠灌胃转化有空质粒的减毒沙门氏菌,未治疗组小鼠灌胃PBS,观察pGC-Si-Stat3组Stat3 mRNA和蛋白表达水平。结果：与未治疗组和pGC-Si-Scramble组比较,携带有siRNA-Stat3质粒治疗组肝原位移植瘤体积明显缩小(P<0.05),瘤重减轻(P<0.05)。与其对应的 mRNA和蛋白表达泳道光密度值较未治疗组和pGC-Si-Scramble组明显降低（P<0.01﹚。结论：携带有siRNA-Stat3质粒的鼠减毒沙门氏菌对小鼠肝原位移植瘤的生长具有显著抑制作用。     

两种表达鼠精子受精素β蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的稳定性分析

目的 了解表达鼠精子抗原受精素β亚单位(Fertilin βsubumit,fβ)的两种重组减毒沙门氏菌疫苗株X4632(pFEC)和X4550(pFEC)的生长特性和体内外携带重组质粒的稳定性。方法 将两种重组沙门氏菌疫苗株X4632(pFEC)和X4550(pFEC)体外传代培养，观察比较其生长特性和所含重组质粒的稳定性；将该两种重组菌口服免疫BAIB／c雄性小鼠，观察重组菌侵入小鼠Peyer结、肠系膜淋巴结和脾脏等组织内繁殖生长情况和所回收重组菌携带质粒的阳性率。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体内、外营养选择压力下均可较稳定携带重组质粒传代繁殖，X4550(pCFL)在体内可较稳定地定植于Peyer结、肠系膜淋巴结和脾脏；X4632(pCFL)可较稳定地定植于Peyer结，均可稳定表达被Fβ单抗识别的重组Fβ蛋日。结论 X4632(pFEC)、X4550(pFEC)疫苗株可作为递呈精子抗原的活菌载体。     

阳离子脂质体包裹的IL-12基因对小鼠黑色素瘤的治疗作用

目的:观察体内注射阳离子脂质体包裹的小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因对小鼠黑色素细胞瘤的治疗作用.方法:C57BL/6小鼠在接种B16黑色素细胞后3、5、7、9 d分别给予lipofectin包裹的pCmIL-12质粒治疗,观察小鼠的肿瘤生长速度、生存期以及NK细胞活性的变化.结果:阳离子脂质体明显增强pCmIL-12质粒在体内的抗肿瘤生长活性,并延长荷瘤小鼠的存活期.此外,pCmIL-12/阳离子脂质体还能显著增强荷瘤小鼠的NK细胞活性.结论:阳离子脂质体介导的IL-12基因对小鼠黑色素瘤有明显的治疗效果.     

人乳头瘤病毒6b型重组减毒沙门菌的构建及表达

目的：构建ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１Ｅ７嵌合基因重组减毒沙门菌，为进一步粘膜免疫奠定基础。方法：用ＰＣＲ方法扩增获得ＨＰＶ６ｂ　的　Ｌ１Ｅ７　嵌合基因片段，ＴＡ　克隆后，再将Ｌ１－Ｅ７　基因克隆入ｐＴＥＴｎｉｒ１５　沙门菌表达质粒。用电转化法将重组表达质粒导入鼠伤寒减毒沙门菌Ｓ．ＢＲＤ５０９（△ａｒｏＡ，△ａｒｏＣ）中，厌氧诱导其表达，蛋白样品做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　凝胶电泳　和ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析。结果：用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ双酶切重组表达质粒ｐＴＥＴｎｉｒ１５６ｂＬ１Ｅ７可释放２３８９ｂｐ和１５５４ｂｐ两片段，结果与预计相符。ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示，重组沙门菌在约５６ＫＤ处有明显特异蛋白条带，而对照菌则无。结论：该重组沙门菌能特异地表达ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７　融合蛋白，人乳头瘤病毒ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７重组减毒沙门菌构建成功。     

逆转录病毒载体介导HSV-tk基因经尿道膀胱灌注对大鼠膀胱癌的杀伤作用

目的探讨经尿道膀胱灌注由逆转录病毒介导的HSV-tk基因对大鼠膀胱肿瘤的治疗作用.方法 N-甲基亚硝基脲(MNU)膀胱灌注诱导雌性Wistar大鼠膀胱肿瘤.经尿道HSV-tk基因膀胱灌注后,RT-PCR 检测肿瘤组织中tk基因表达;TUNEL 法检测肿瘤细胞凋亡;荷瘤膀胱总重量检测. 结果 HSV-tk基因经尿道膀胱灌注后,RT-PCR 检测膀胱肿瘤组织有tk 基因mRNA表达;TUNEL 法凋亡检测,荷瘤膀胱总重量测定,提示治疗组与对照组有显著差异.结论经尿道膀胱灌注逆转录病毒载体/HSV-tk可转导tk基因;联合GCV治疗,肿瘤生长被显著抑制;诱导肿瘤细胞凋亡可能是其作用机理之一.     

体内直接导入转基因IL—2包装细胞的抗瘤作用

利用构建分泌人ＩＬ－２的逆转录病毒的包装细胞，直接体内注射，观察了对Ｂ１６小鼠黑色素瘤生长影响及转基因效果。狭缝印迹分析结果显示，Ｂ１６细胞在体内获得ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达。同时，肿瘤生长受到抑制，表现在小鼠成瘤与存活时间延长，免疫功能也获得增强，ＩＦＮ－γ水平升高。本结果与本室以往报道的体外基因转移的动物实验结果相符，提示直接体内注射病毒包装细胞可转移外源基因及显示抑癌作用。     

Anti-angiogenesis Effect on Glioma of Attenuated Salmonella Typhimurium Vaccine Strain with flk-1 Gene

To investigate the anti-vasculature effects and the anti-glioma effects of attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing VEGFR2 (flk-1) gene, plasmid pcDNA3, 1-flk1 was constructed and electro-transfected into live attenuated Salmonella typhimurium strain SL7207. Mouse models of intracranial G1261 glioblastoma were treated with an orally administered attenuated Salmonella typhimurium expressing flk-1 gene. The survival period was recorded and vessel density was observed by immunofluorescence. CTLs activity was measured by MTT assay. Our results showed that attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing flk-1 gene could significantly inhibit glioblastoma growth, reduce vessel density, prolong the survival period and improve the survival rate in these mice. The flk-1 specific CTLs activity was increased obviously after the vaccination. Our study showed that attenuated Salmonella typhlmurium vaccine strain expressing flk-1 gene could break peripheral immune tolerance a in glioma gainst this self-antigen and kill endothelial cells by the orally administered vaccine and can be used for both prophylactic and therapeutic purposes.     

人参皂苷Rg3联合X射线照射对黑色素瘤细胞生长的抑制作用

目的：观察人参皂苷Rg3联合X射线照射对黑色素瘤细胞生长的抑制作用。方法：建立黑色素瘤C57BL/6J小鼠动物模型,观察Rg3联合照射对小鼠体内肿瘤生长的影响;通过黑色素瘤B16细胞体外培养,观察Rg3对其细胞受照后存活率的影响。结果：小鼠接种B16细 胞第6天,Rg3给药组肿瘤体积明显缩小,与对照组比较差异有显著性（P<0.001）;照射后12 d,照射组和给药加照射组肿瘤均明显缩小,后者缩小更为显著（P<0.05）;同时,Rg3联合X线照射使其细胞存活率下降,与其他3组比较差异有显著性(P<0.05)。结论：人参皂苷Rg3具有抑制肿瘤细胞生长的作用,联合X射线照射对抑瘤具有放射增敏作用。     

携带siRNA-STAT3质粒的减毒沙门菌对小鼠移植性前列腺癌的治疗作用

目的：观察以减毒沙门菌携带siRNA-STAT3质粒对小鼠前列腺移植癌的治疗效果,阐明siRNA-STAT3诱导前列腺癌细胞凋亡的机制。方法：构建小鼠前列腺移植癌模型,随机分为Mock未治疗组、pGC-Si-Scramble组及pGC-Si-STAT3治疗组（将转化有siRNA-STAT3质粒的减毒沙门菌局部注射到模型构建成功的小鼠体内）。观察小鼠一般状态,记录肿瘤体积的变化,RT-PCR和Western boltting方法检测STAT3 及其下游基因Bcl-2、c-Myc、HIF-1、CyclinD1的 mRNA和蛋白表达水平,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。结果：小鼠前列腺移植癌模型构建成功,pGC-Si-STAT3治疗组移植性前列腺癌瘤体生长受到明显抑制,肿瘤的质量和体积明显低于对照组（P<0.05）。流式细胞术检测,pGC-Si-STAT3治疗组、pGC-Si-Scramble组及Mock未治疗组肿瘤细胞早期凋亡率分别为（29.1±1.6）%、（14.7±1.4）%和（8.9±1.8）%,组间比较差异有显著性(P<0.05)。pGC-Si-STAT3治疗组肿瘤组织的STAT3 mRNA和蛋白表达明显降低,其下游基因Bcl-2、 c-Myc的mRNA及HIF-1、CyclinD1蛋白的表达水平均降低,与Mock未治疗组比较差异有显著性（P<0.05）。结论：以减毒沙门菌作为运载体携带siR
NA-STAT3质粒通过调控STAT3下游基因表达,诱导细胞凋亡,对小鼠移植性前列腺癌具有明显的抑瘤效果。