载脂蛋白E基因敲除小鼠在动脉粥样硬化研究中的应用

载脂蛋白E基因敲除小鼠是目前在动脉粥样硬化 (AS)研究领域中应用最多的基因工程动物。参考国内外应用载脂蛋白E基因敲除小鼠研究AS的有关文献 ,就其AS病灶形成的规律及形态学改变 ,有氧运动和饮食对该小鼠AS病灶的影响 ,关于调脂药物和其它药物研究情况 ,骨髓移植和基因治疗对该种小鼠AS病灶的影响等方面作一综述 ,以期将这种基因工程小鼠动物模型更广泛地应用于中西医药研究     

敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因并敲入HLA- G1基因的打靶载体构建

本实验室已克隆到猪α1，3-半乳糖基转移酶基因（α1，3-GT，第九外显子不全）。其中pMD-3arm载体上有5．0kb的片段，该片段包括了小部分第8外显子，完整的第8内含子和一部分第9外显子。本实验中利用LA-PCR的方法，从猪的基因组中获得约2．0kb的猪α1，3-GT的第9外显子序列的扩增产物，将片段克隆于pGEM-Teasy载体。将5．Okb和2．Okb片段分别作为打靶载体的5’，3’同源臂，以neo为正选择标记基因，以GFP为负选择标记基因，构建敲除猪α1，3-半乳糖基转移酶基因并同时能表达人白细胞抗原HIA-G1基因的的打靶载体pZJ。经酶切图谱和测序结果的鉴定成功地构建出敲除猪α1，3-半乳糖基转移酶基因并同时能表达人白细胞抗原HIA-G1基因的正负双向选择的打靶载体，为异种器官移植提供了很好的探索。     

"基因敲除"与人类疾病小鼠模型——2007年诺贝尔生理或医学奖简介

2007年诺贝尔生理或医学奖已于10月8号晚在瑞典揭晓,英国人马丁.埃文斯、美国人马里奥.卡佩基和奥利弗.史密斯三位科学家分享了此项殊荣。他们在动物胚胎干细胞和DNA同源重组技术的研究中取得了重大突破,发明了一项在生物医学领域具有划时代意义的技术——小鼠“基因打靶”。这     

基因敲除模型小鼠在疾病研究中的应用

背景：人类很多疾病是由基因决定的,构建相应的基因敲除动物模型对疾病的发病机制和治疗研究具有重要的意义。 目的：探讨基因敲除小鼠模型在心血管、神经、骨骼、肝脏、视网膜等系统的疾病研究中的应用与发展前景。 方法：应用计算机检索CNKI 期刊全文数据库和PubMed数据库(1990-01/2009-12)与基因敲除小鼠模型相关的文献。检索词分别为“基因敲除小鼠;动脉粥样硬化;神经系统;骨质疏松;肝脏;视网膜”和“Gene knock-out; Mice Atherosclerosis; Nervous system; Osteoporosis; Liver; Retinal”。纳入具有原创性,论点论据可靠的以基因敲除小鼠模型评价的文献报道。排除重复研究或Meta分析类文章。 结果与结论：检索到文献75篇,按纳入及排除标准筛选后共纳入文献38篇。经分析得出以下结论：基因敲除小鼠广泛应用于人类疾病模型,目前已构建了数百个人类疾病的小鼠模型,包括心血管疾病、神经退化性疾病、糖尿病、癌症等小鼠模型。通过对基因敲除小鼠疾病模型的研究,可以找到相关疾病的潜在治疗靶点,为人类精确地研究基因与疾病的直接关系提供了可能。     

利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾(human embryonic kidney cell,HEK-293)细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

人源化小鼠及其在病毒感染研究中的应用

人源化小鼠是指将人体细胞或组织移植入免疫缺陷小鼠,即保证不会产生免疫排斥,又可保证移植入的人体细胞/组织在小鼠体内作为合适的基质,适用于人体病原的感染及增殖,相较于普通动物模型可以获得更接近人体的较为可信的实验数据.目前人源化小鼠已经在病毒感染机制、诱导的免疫应答、抗病毒药物筛选及疫苗研发、基因治疗等方面的研究中获得应用,尤其对一些高度宿主特异性的病毒如HIV、HCV、DENV具有重大的研究价值.     

人HSV-1 UL40基因重组质粒的构建及其在siRNA筛选中的应用

目的： 快速筛选出高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA，为进一步应用RNA干扰的相关研究奠定基础。方法: 应用RT-PCR扩增人HSV-1 F株UL40基因，将其连接到pEGFP-N1构建pEGFP-N1-UL40融合蛋白表达质粒。将化学合成的针对UL40基因的siRNA与重组质粒共转染Vero细胞，通过观察绿色荧光蛋白报告基因的表达筛选高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA。结果: 倒置荧光显微镜观察发现设计的4对siRNA中siRNA3和siRNA4能明显降低绿色荧光蛋白的表达，流式细胞仪检测证明siRNA3和siRNA4对目的基因沉默效率分别达到76.99％和84.00％。结论: 成功构建了人HSV-1 UL40基因融合表达载体pEGFP-N1-UL40，并利用该载体筛选出2对高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA。     

新型慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞基因转导中的应用

背景：构建一个组成性表达某特定基因同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒载体目前未见报道。 目的：观察新型慢病毒载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP在人骨髓间充质干细胞基因转导中的表达。 方法：通过PCR在PEDF基因的两端加上attB位点,构建表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP,将表达载体与包装质粒(ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix)共转染293FT细胞。通过多次感染的方法将慢病毒载体导入人骨髓间充质干细胞,转导后第7天开始使用1~5 mg/L嘌呤霉素筛选5 d,得到表达PEDF和EGFP的人骨髓间充质干细胞,并进行Western、Elisa的鉴定分析。 结果与结论：经PCR和测序证实,慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP构建成功;将其成功导入人骨髓间充质干细胞,经过筛选获得纯化的过表达PEDF基因的绿色荧光细胞群。     

人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达

目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSeetag2/seFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达.方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体psectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况.结果:将750 bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv.将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34 000.结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据.