丹酚酸B对大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中Desmin、α-actinmRNA表达的影响

[目的]探讨丹参单体丹酚酸B(SalB)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的情况及Desmin和α-actin mRNA的表达,确定大鼠MSCs体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。[方法]选用成年近交系Wistar大鼠,利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增。免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定。分别应用10μmol/L5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)及250μg/LSalB联合5-aza(5-aza+SalB)对第9代的MSCs进行联合诱导24h,于诱导后第4周,用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Desmin、α-actin mRNA的表达。[结果]1)第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达。2)诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。5-aza组、5-aza+SalB组均出现明确的心肌早期分化基因与5-aza组相比,5-aza+SalB组的Desmin和α-actin mRNA表达明显增强。[结论]SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用。     

小分子水凝胶对大鼠骨髓间充质干细胞心肌分化过程中早期分化基因表达的影响

目的：探讨小分子水凝胶对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）心肌分化过程中早期分化基因Desmin和α-actin的表达影响。方法：流式细胞仪检测鉴定P9MSCs细胞表面标记物,分别应用10μmol／L5-aza（5．aza组）、小分子水凝胶＋5-aza（水凝胶组）对第9代MSCs进行联合诱导24h,诱导4周后,QRT-PCR和Western—blotting法检测Desmin、α—actinmRNA及蛋白的表达。结果：第9代MSCsCD44阳性表达、CD34阴性表达;诱导4周后,5-aza组细胞难以形成球状细胞团,细胞容易脱落,凋亡及死亡细胞较多;水凝胶组细胞死亡少,数量较诱导前增多。细胞之间的分支连接紧密,有聚集生长的趋势,形成球状细胞团块,个别细胞内形成类肌管状结构。5-aza组和水凝胶组心肌早期分化基因Desmin、α-actin均有阳性表达．水凝胶组mRNA及蛋白表达水平均较5-aza组明显增强（P〈0．05）。结论：小分子水凝胶可作为细胞的三维培养支架．有利于MSCs生长,具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

5-氮胞苷联合丹酚酸B促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

[目的]探讨5-氮胞苷及丹酚酸B的联合作用下骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞的能力。[方法]体外分离、培养、鉴定的骨髓MSCs分为4组:正常对照组,5-氮胞苷组,丹酚酸B组,5-氮胞苷+丹酚酸B组。诱导2周后,利用实时荧光定量PCR(QPCR)和蛋白免疫印迹技术检测心肌早期转录因子(GATA-4)和心肌特异性肌凝蛋白重链(α-MHC)的表达含量。[结果]各诱导组GATA-4及α-MHC RNA和蛋白的表达量均高于正常对照组,而5-氮胞苷+丹酚酸B组高于5-氮胞苷组和丹酚酸B组,且差异有统计学意义。[结论]5-氮胞苷联合丹酚酸B可提高MSCs向心肌样细胞的分化率。     

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的形态学观察

目的探讨5-氮胞苷（5-aza）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外诱导作用。方法分离2同龄小鼠胫骨、股骨，冲洗出骨髓，利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代MSCs培养48h后加10μmol／L5-aza进行诱导，3周后刮取贴壁细胞，离心收集，免疫细胞化学检测心肌特异性蛋白α-actin的表达对所诱导细胞进行鉴定，电镜观察细胞超微结构。结果电镜下见胞质内出现大量肌丝，线粒体数量增多，分布在肌丝周围，可见细胞膜电子密度增高的缝隙连接；免疫细胞化学显示α-actin呈强阳性表达。结论MSCs经5-aza体外诱导分化，可获得形态上类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向心肌细胞分化的研究

目的探讨体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化的方法。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨，冲洗出骨髓，利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代细胞培养48h，分为4组：A组加入心肌组织块条件培养液、B组加10μmol／L 5-氮胞苷（5-aza）、C组为二者的混分液、D组不加任何诱导剂以作对照组。应用免疫细胞化学方法检测各组心肌特异性蛋白α-actin的表达。结果免疫细胞化学染色结果显示，A组细胞培养3周时可检测到α-actin阳性细胞，阳性细胞较多；B组培养1周可见弱阳性细胞，随时间延长，阳性着色增强且阳性细胞数增多，3周时呈强阳性表达；C组2周即可检测到细胞呈强阳性着色。对照组MSCs胞浆内未检测到α-actin的表达。4个组的阳性细胞率进行两两比较均有统计学意义（P〈0.05）。结论心肌组织块条件培养液和5-aza联合应用可促进MSCs体外分化为心肌样细胞。     

条件培养液体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究*

[目的]观察乳鼠心室肌成纤维细胞条件培养液干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.[方法]分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:单纯条件培养液组(TJ)、条件培养液1组(TJ-ZY)、条件培养液2(TJ-XFK),诱导,24h后继续培养4周,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和α-actin mRNA的表达.[结果]免疫细胞化学结果显示单纯条件培养液诱导后的MSCs不表达心肌特异性蛋白cTnT,心复康参与组则表达.实时荧光定量(RT-PCR)结果显示各组均表达心肌分化早期基因,心复康参与组诱导后的MSCs的心肌分化早期基因表达明显高于单纯条件培养液组.[结论]微环境在MSCs向心肌样细胞的分化过程中起了重要作用,心复康能够提高MSCs向心肌样细胞的分化和特化作用.     

黄芪甲苷体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

【目的】观察黄芪甲苷体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的作用。【方法】采用密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠MSCs,反复传代及纯化后,取第3代MSCs,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34和CD44;取第8代MSCs进行分组诱导:黄芪甲苷组(终浓度为250 mg/L)、5-氮胞苷(5-aza,终浓度为10μmol/L)、黄芪甲苷加5-aza组(终浓度分别为250 mg/L与10μmol/L),并设空白对照组,诱导后继续培养4周;计算心肌样细胞诱导率,采用免疫组化法鉴定诱导后MSCs中结蛋白(Desmin)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法鉴定诱导后MSCs中心肌特异性蛋白α-心肌肌球蛋白重链(-αMHC)和β-心肌肌球蛋白重链(-βMHC)信使核糖核酸(mRNA)的表达。【结果】原代培养的MSCs首先形成集落,传代细胞体积变大,诱导后细胞呈梭形,并出现肌管;MSCs表面抗原CD44表达阳性,而骨髓造血干细胞表面抗原CD34表达阴性,表明本实验方法所得细胞为均一的MSCs细胞群;各组在不同时间的心肌样细胞诱导率无明显差异;免疫组化结果显示诱导后MSCs表达心肌特异性蛋白Desmin和cTnI;RT-PCR结果显示诱导后MSCs表达成熟的心肌特异性蛋白-αMHC和-βMHC。【结论】黄芪甲苷可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞,但诱导率仍有待提高。     

3种体外培养方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化效果比较

目的：采用3种体外培养方法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导分化,探讨体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最佳方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离培养大鼠BMSCs,分为5-氮胞苷（5-aza）组、扩张型心肌病（DCM）模型大鼠心肌细胞裂解液组和DCM模型大鼠血清+5-aza组,同时设对照组（同等条件下在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养）,观察细胞形态表现,采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫组织化学染色法检测细胞中肌钙蛋白T（cTnT）的表达。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法获得大鼠BMSCs,BMSCs高表达间充质干细胞（MSCs）的特征性表面标记CD44、CD29和CD105,不表达造血干细胞的特征性表面标志CD34;特定诱导条件下,BMSCs可以向成骨细胞及脂肪样细胞分化。体外3种培养方法均可诱导BMSCs表达cTnT,分化为心肌样细胞;5-aza组细胞生长状态差,其余2组细胞生长状态较好,DCM模型大鼠血清+5-aza组细胞中cTnT阳性表达率最高。结论：采用DCM模型大鼠血清联合5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化的效果最佳。     

丹酚酸B体外干预骨髓间充质干细胞分化过程中cTnT的表达

[目的]观察丹酚酸B(SalB)体外干预骨髓间充质干细胞(MSCs)后细胞形态及心肌特异性蛋白肌钙蛋白T(cTnT)的表达。[方法]培养、纯化及鉴定MSCs,用SalB、5-氮胞苷组(5-aza)、SalB联合5-aza(SalB+5-aza)分别定向诱导分化,观察此过程中MSCs的形态学变化并采用免疫细胞化学法鉴定诱导后MSCs心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达。[结果]诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示诱导后MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT。[结论]SalB在体外定向诱导MSCs分化为心肌细胞的过程中发挥了一定的作用。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

肝干细胞－卵圆细胞的研究进展

卵圆细胞是肝脏干细胞的代表细胞,主要存在于幼肝及成人受损的肝脏中,是一种双潜能的肝脏干细胞,多种因素调节其分化,在此过程中动态表达一系列表面标志物。卵圆细胞的分化异常与肝癌的发生关系密切。在体外大量扩增卵圆细胞并使之分化为成熟的 有功能的肝细胞,为终末期肝病、肝脏的组织工程研究及基因治疗开辟了新的途径。 