COX-2特异性的siRNA诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术在体外抑制COX-2基因表达,探讨RNAi诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的可能途径.方法 设计靶向COX-2基因的小干扰RNA(siRNA),构建重组表达质粒pTZU6+1-siRNA-COX-2,并导入SGC-7901细胞,在体外诱导RNAi,用RT-PCR、免疫细胞化学、末端标记细胞凋亡检测法(TUNEL)和Western Blot检测COX-2基因表达、细胞凋亡和凋亡相关基因的表达.结果 重组质粒pTZU6+1-siRNA-COX-2导入SGC-7901细胞株后,COX-2表达明显下调,细胞出现凋亡(P<0.05),Caspase-9和Caspase-3表达明显上调.结论 RNA干扰明显抑制了靶基因COX-2的表达,并可能通过激活Caspase途径诱导SGC-7901细胞凋亡.     

降低COX-2表达与乳腺癌细胞迁移和侵袭关系的研究

目的 探讨利用小RNA干扰技术降低COX-2表达对高度恶性乳腺癌MDA-MB-231细胞趋化和侵袭能力的影响.方法 应用合成的小RNA干扰质粒转染MDA-MB-231细胞株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2mRNA的表达.通过划痕实验检测细胞的运动能力;体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力;应用细胞黏附...     

抑癌基因ING4转染对乳腺癌细胞MDA-MB-435S生物学行为的影响

目的 研究转染抑癌基因ING4对乳腺癌细胞系MDA-MB-435S生物学行为的影响.方法 携带ING4基因的真核表达质粒pcDNA3.0(+)-ING4利用脂质体瞬时转染乳腺癌MDA-MB-435S细胞,以转染pcDNA3.0(+)空载体和未转染的MDA-MB-435S作为阴性对照和空白对照.转染72 h后,RT-PCR检测转染前后ING4基因mRNA表达水平,MTT法检测转染各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞周期的变化,TUNEL实验检测各组细胞凋亡水平的变化.结果 转染ING4基因的MDA-MB-435S细胞ING4 mRNA表达水平明显上调;细胞增殖活力较空白组和阴性对照组下降(P＜0.05);细胞发生G2/M期阻滞(P＜0.05);细胞凋亡比例明显增加(P＜0.01).结论 ING4基因通过G2/M期阻滞和诱导细胞凋亡的方式抑制乳腺癌细胞生长.     

COX-2 siRNA诱导人肝癌Hep3B细胞凋亡实验研究

目的:观察COX-2在人肝癌细胞Hep3B中的表达及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默COX-2基因对COX-2 mRNA和蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:将siRNA-COX-2质粒载体转染Hep3B细胞,WST-8法检测细胞增殖抑制情况,透射电镜观察凋亡小体出现情况;筛选单克隆细胞株Hep3B-sh,采用RT-PCR和Western blotting检测COX-2 mRNA和蛋白情况。结果:siRNA-COX-2能抑制Hep3B细胞的增殖,稳定转染pshRNA-COX-2可使Hep3B细胞中COX-2 mRNA及蛋白的表达明显减弱(P<0.01);透射电镜下可见凋亡小体出现,发生凋亡细胞数增加。结论:COX-2siRNA能有效抑制肝癌Hep3B细胞中COX-2的表达和细胞的增殖,促进凋亡发生,为肝细胞癌基因治疗提供实验依据和治疗靶点。     

RNAi抑制MCF7细胞Lon基因后的生物学效应

目的 通过构建Lon基因表达下调的哺乳动物细胞模型,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计针对Lon蛋白酶基因的小干扰RNA(siRNA),构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体,并用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7.RT-PCR法检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法);流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡的作用.结果 RT-PCR显示重组质粒pSilencer U62.1-Lon转染MCF7细胞后,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的条带,细胞培养结果显示细胞增殖能力明显减弱.MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞经紫外线照射和顺铂处理后,增殖能力明显下降,与空载体转染组和未转染组相比有显著差异(P＜0.05).加热应激实验显示,41℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)、未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).而在43℃和45℃时,3组之间均无显著性差异(P＞0.05).流式细胞术检测pSilencer U6 2.1-Lon质粒组细胞凋亡率为(22.47±3.15)%,相对于空载体转染组的(2.3±0.9)%和无质粒转染组的(1.14±0.79)%有明显提高,而空载体转染组和无质粒转染组相比无明显差异.结论 RNAi能有效下调Lon蛋白的表达.Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖,诱导细胞凋亡,并可增加MCF7细胞对紫外线和顺铂的敏感性.     

CacyBP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的 观察干扰小RNA(siRNA)介导的Cacy BP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响。方法 化学合成Cacy BP/SIP基因序列特异性siRNA(Cacy BP/SIP siRNA),采用脂质体法转染siRNA至MDA-MB-231细胞(Cacy BP/SIP siRNA组),MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Realtime PCR和Western blotting检测MDA-MB-231细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白的表达。另设阴性对照组和空白对照组。结果 与阴性对照组和空白对照组比较,Cacy BP/SIP siRNA组MDA-MB-231细胞增殖能力显著下降(P<0.05),细胞凋亡率显著增高(P<0.05)。Caspase-3和Bax mRNA及蛋白表达上调(P<0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白表达下调(P<0.05)。结论 靶向沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中Cacy BP/SIP基因表达后,可以抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡,其作用可能通过下调Bcl-2表达,上调Caspase-3和Bax表达发挥诱导细胞凋亡的作用。     

COX-2基因沉默对OS-RC-2细胞生长和侵袭能力的影响

目的：观察RNA干扰沉默肾癌细胞株OS-RC-2的环氧合酶-2（COX-2）基因表达对肾癌细胞生长及体外侵袭能力的影响。方法：构建靶向COX-2的小干扰RNA（siRNA）真核表达质粒pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA。将对数生长期的OS-RC-2细胞分3组,干扰组转染pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA,空转组转染pSliencer2.0-U6,对照组不转染。培养72h后采用半定量RT-PCR、Westernblot检测COX-2mRNA和蛋白表达,CCK8增殖抑制实验观察细胞生长情况,改良Boyden小室法评估细胞体外侵袭能力。结果：酶切和测序证实pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA构建成功。3组细胞COX-2mRNA和蛋白的表达、细胞存活率及穿孔细胞数差异均有统计学意义（F分别为189.800,89.326,188.403和75.349,P均〈0.001）。与其他2组比较,干扰组COX-2mRNA及蛋白表达下调（P〈0.05）,细胞存活率、穿孔细胞数降低（P〈0.05）。结论：COX-2有望成为肾癌基因治疗的靶点。     

利用RNA干扰技术下调Lon基因表达的生物学效应研究

目的:通过构建Lon基因下调的哺乳动物细胞模型表达,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以探讨Lon蛋白的功能.方法:设计针对Lon蛋白酶的小干扰RNA(siRNA),构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体,用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7,RT-PCR检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法).结果:RT-PCR显示重组质粒pSilencer U6 2.1-Lon转染MCF7细胞,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的带,细胞培养结果显示,细胞增殖能力明显减弱.紫外线照射和顺铂处理后的MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞,增殖能力明显下降,与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)和未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).加热应激试验显示,37,41,43℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组、未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).而在45℃时,RNA干扰转染组、空载体转染组与未转染组之间均无显著性差异(P＞0.05).结论:RNAi能有效下调Lon蛋白的表达.Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖能力,诱导细胞凋亡,以及可增加MCF7对紫外线和顺铂处理的敏感性.     

RNA干扰抑制环氧化酶-2表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的 建立以小分子干扰RNA(siRNA)抑制环氧化酶-2(COX-2)表达的宫颈癌HeLa细胞模型,探讨COX-2在肿瘤细胞增殖、凋亡方面的作用和可能机制.方法 构建靶向抑制COX-2的siRNA表达载体,转染HeLa细胞,Western blot法确定筛选的稳定表达siRNA的转化克隆COX-2表达受抑制;流式细胞仪检测RNA干扰(RNAi)抑制COX-2表达后细胞凋亡和细胞周期的变化;克隆形成试验检测细胞克隆形成率;RT-PCR及Western blot法检测ku70、ku80的表达变化.结果 获得稳定表达siRNA的转化细胞株(HeLa/COX-2i),其COX-2蛋白表达明显受抑制,而转入阴性对照质粒的细胞株(HeLa/Negi)COX-2蛋白表达不受影响;HeLa/COX-2i细胞的克隆形成率[(45±4)%]显著低于HeLa细胞[(85±7)%](P<0.01);HeLa,HeLa/Negi,HeLa/COX-2i 3株细胞的细胞周期分布以及细胞凋亡率差异无显著性意义;RT-PCR及Western blot显示RNAi抑制COX-2表达后ku70、ku80在转录和翻译水平均受抑制.结论 RNAi抑制COX-2表达后可抑制HeLa细胞增殖,其机制可能与ku70、ku80的表达下调有关.     

Bcl-2 siRNA增强HepG2细胞对5-氟尿嘧啶敏感性

目的 观察Bcl-2 siRNA对人类肝癌细胞HepG2 5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性的影响。方法 Bcl-2 siRNA表达载体构建并稳定转染至肝癌细胞HepG2中,用G418筛选稳定的阳性细胞克隆。用RT-PCR检测Bcl-2 mRNA水平,免疫荧光检测目的基因Bcl-2蛋白水平的表达。用131、30、1300和13 000 mg/L 5-FU处理稳定转染细胞,用MTT观察细胞对药物敏感性的影响,用流式细胞术观察细胞凋亡情况。Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白水平。结果 5-FU处理细胞24 h,Bcl-2 siRNA转染组的细胞生长抑制率明显高于阴性载体转染组和正常细胞;Bcl-2 siRNA转染组细胞凋亡率高于正常细胞和阴性载体转染组;在Bcl-2表达下调时,Bax蛋白表达水平不变。结论 siRNA下调目的基因Bcl-2能增强人类肝癌细胞HepG2对5-FU的敏感性;HepG2细胞对5-FU的敏感性增强与Bax/Bcl-2的比例增高有关。     

靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.     

稳定转染ERα基因抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞COX-2和VEGF-C的表达

Background Estrogen receptor （ER）-negative breast cancer cells are more aggressive than ER-positive cells. Elevated levels of cyclooxygenase-2 （COX-2） and vascular endothelial growth factor-C （VEGF-C） expression have been detected in cultured human breast cancer cells and are associated with negative hormone receptor status. In this study, we created ERα stable transfectants in MDA-MB-231 cells to explore the effect of ERα on cell growth and COX-2 and VEGF-C expression.Methods The green fluorescent protein （GFP）-ERα plasmids were stably transfected into ER-negative MDA-MB-231 cells. The proliferation and migration of untransfected MDA-MB-231 cells, ERα-transfected MDA-MB-231 cells and ER-positive MCF-7 cells were determined. The expression of COX-2, and the levels of VEGF-C mRNA and the VEGF-C secretion concentration were assayed in these cell lines.Results The proliferation and migration capacities of ERα-tranfected MDA-MB-231 cells were significantly decreased （P 〈0.05）. The expression of COX-2 was significantly lower in ERa-tranfected MDA-MB-231 cells than in untranfected MDA-MB-231 cells. The mRNA and protein levels of VEGF-C were lower in ERa-tranfected MDA-MB-231 cells than in untransfected MDA-MB-231 cells （P〈0.05）.Conclusions ERα stable transfection inhibits proliferation and migration capacities of MDA-MB-231 cells and decreases expression of COX-2 and VEGF-C. The decreases of proliferation and migration capacities may be related to suppression of COX-2 and VEGF-C expression.     

胃癌中COX-2基因的表达及其与Bcl-2和CyclinD1相关性研究

目的 研究胃癌中环氧合酶-2（cox-2）的表达情况和生物学意义，以及与Bcl-2和CyclinDl的相关性。方法 选择胃癌42例和浅表性胃炎24例，对COX-2、Bcl-2和Cyclin D1抗体行SP法免疫组化染色。结果42例胃癌标本中有31例COX-2阳性，24例中浅表性胃炎中5例弱阳性表达（P〈0．01）。CyclinD1和Bcl-2在胃癌中的阳性率分别为47．6％（20／42），50％（21／42）。COX-2和CyclinDl、Bcl-2表达呈正相关。Cox-2基因表达与年龄、性别、大小、组织学类型和浸润深度无关。但与肿瘤的淋巴结转移具有显著的相关性（P〈O．05）。结论 COX-2过表达可能通过对CyclinDl和Bcl-2表达的调控。抑制胃癌细胞凋亡，加速细胞增殖，促进胃癌的发生发展；COX-2过表达在肿瘤侵袭和转移过程中发挥着重要作用。     

鼻咽癌组织中COX-2与VEGF-C基因表达的研究

目的:研究环氧化酶-2(COX-2)和血管内皮生长因子(VEGF-C)在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用逆转录-聚合酶链法(RT-PCR)检测32例鼻咽癌和11例癌旁鼻咽正常组织标本中COX-2mRNA与VEGF-C-mRNA的表达。结果:COX-2 mRNA与VEGF-CmRNA在鼻咽癌中的表达分别为68.7%和71.9%,显著高于癌旁鼻咽正常组织(P<0.01,P<0.005);在有淋巴结转移患者中COX-2 mRNA与VEGF-C-mRNA阳性表达均明显高于无淋巴结转移患者(P<0.05,P<0.01)。结论:COX-2与VEGF-C基因在鼻咽癌中组织的发生、发展、转移中发挥重要作用。     

Inhibition of the proliferation of human gastric cancer cells SGC-7901 in vitro and in vivo using Bcl-2 siRNA

Background Bcl-2, the anti-apoptotic protein is overexpressed in the majority of gastric cancers and associated with its pathogenesis. To better understanding of the role of Bcl-2, RNA interference （RNAi） was used to inhibit Bcl-2 expression in the human gastric cancer cells in vitro and in vivo. Methods Bcl-2 small interfering RNA （siRNA） was transfected into human gastric cancer cells $GC-7901, and Bcl-2 expression was monitored by real-time polymerase chain reaction （PCR） and Western blot. Cell proliferation, apoptosis, and telomerase activity were examined by MTT, flow cytometry, and TRAP assay, respectively. Gastric cancer cells treated with 100 nmol/L Bcl-2 siRNA were subcutaneously transplanted into nude mice and tumor growth was assessed. Results Bcl-2 siRNA significantly inhibited the expression of Bcl-2 in human gastric cancer cells at both mRNA and protein levels in a time- and dose-dependent manner. Bcl-2 siRNA also decreased telomerase activity （by 78.76%） and increased the rate of apoptosis （by 37.47%）. SGC-7901 cell growth was also significantly suppressed in vivo and in vitro. Conclusions Bcl-2 expression knockdown suppressed the growth of gastric cancer cells. Thus, Bcl-2 may play a very important role in carcinogenesis of gastric cancer and its knockdown may offer a new potential gene therapy approach for human gastric cancer in future.     

RNA干扰IDH2基因对HCT-8细胞增殖能力的影响

目的：研究RNA干扰(RNAi)对结肠癌HCT-8细胞IDH2基因表达的抑制作用及干扰后对HCT-8细胞增殖的影响,为结肠癌的基因靶向治疗提供理论依据。方法：实验分siRNA干扰质粒转染组、阴性质粒对照组和HCT-8细胞空白对照组。构建靶向基因IDH2的siRNA真核绿色荧光载体重组质粒PGPU6/GFP/Neo-IDH2,利用FuGENE HD转染剂转染HCT-8细胞,通过荧光定量PCR检测IDH2 mRNA的表达情况及MTT法检测结肠癌HCT-8细胞增殖变化。结果：在荧光显微镜下进行细胞计数,细胞转染率为74%。实时荧光定量PCR检测,siRNA重组质粒PGPU6/GFP/Neo-IDH2对IDH2基因表达的抑制率为85.02%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。MTT检测,干扰质粒转染组细胞的增殖能力明显低于空白对照组(P<0.05)。结论：抑制IDH2基因的表达可影响结肠癌细胞的增殖能力,提示IDH2基因在结肠癌的发生发展中起重要作用,抑制IDH2基因的表达可能成为一种治疗结肠癌的方法。     

乳腺癌中COX-2、Bax、Bcl-2的表达及熊果酸的干预作用

目的研究熊果酸（UA）对人乳腺癌SK-BR-3细胞COX-2、Bax、Bcl-2 mRNA的表达的影响,结合人体乳腺癌组织凋亡相关蛋白表达检测,探讨其作用机制,为UA的临床应用提供实验依据。方法 RT-PCR技术检测SK-BR-3细胞中COX-2、Bax、Bcl-2 mRNA的表达;免疫组织化学技术检测雌激素受体（ER）（-）,人表皮生长因子受体-2（HER-2）（＋）的人乳腺癌组织中COX-2、Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果 UA作用48 h后能使乳腺癌SK-BR-3细胞中COX-2、Bcl-2 mRNA表达明显减少（P〈0.05）,使Bcl-2/Bax比值减小（P〈0.05）,而对Bax mRNA的表达未见明显影响;COX-2、Bcl-2、Bax蛋白在ER（-）,HER-2（＋）的乳腺癌组织中的表达阳性率分别为86.67%（26/30）,63.33%（19/30）,56.67%（17/30）,COX-2与Bax表达呈明显负相关（P〈0.05）,与Bcl-2未见明显相关性。结论 UA可抑制COX-2、Bcl-2 mRNA表达,使Bcl-2/Bax减小;ER（-）,HER-2（＋）的人乳腺癌组织中COX-2中阳性表达率较高,COX-2与Bax表达呈明显负相关,与Bcl-2表达未见明显相关性。     

胃癌组织中环氧合酶-2、血管内皮生长因子-C与微淋巴管密度检测

目的:探讨胃癌组织中环氧合酶-2(COX-2)和血管内皮生长因子-C(VEGF-C的表达及其与微淋巴管形成、淋巴结转移之间的关系.方法:采用免疫组织化学 SP法对53例胃癌组织行COX-2 、VEGF-C检测;Ⅷ因子抗体及Ⅳ型胶原抗体双重免疫组化染色检测微淋巴管密度(MLVD).以15例手术切缘经病理证实的正常胃黏膜作对照.结果:胃癌组织中COX-2蛋白阳性率为62.3%(33/53,且COX-2蛋白表达水平与分化程度、淋巴结转移和病理分期有关(P＜0.05);VEGF-C蛋白阳性率为34.0%(18/53,VEGF-C蛋白表达水平与胃癌的组织学分化程度无关(P＞0.05),与淋巴结转移和病理分期有关(P＜0.05).胃癌组织中,VEGF-C表达与COX-2表达正相关(rs=0.312,P＜0.05);MLVD与COX-2、VEGF-C的表达及病理分期、淋巴结转移有关(P＜0.05).结论:胃癌组织中COX-2、VEGF-C蛋白表达与胃癌淋巴结转移有关,COX-2、VEGF-C在促使胃癌微淋巴管形成过程中起作用.