IDO基因修饰的软骨细胞对T淋巴细胞增殖的影响

为检测吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因修饰的原代培养软骨细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。将pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染至C57小鼠原代培养的软骨细胞,体外检测IDO修饰的软骨细胞培养液中色氨酸水平的变化;使用CFSE标记技术,检测IDO修饰的软骨细胞体外混合淋巴细胞反应中对同种异体T淋巴细胞增殖的影响。结果:pEGFP-N1-IDO成功被导入原代培养的小鼠软骨细胞,荧光显微镜和流式细胞术均检测到EGFP的表达;体外实验表明,原代培养的软骨细胞上清可检测到一定量的色氨酸水平,而转染IDO 24 h后的软骨细胞上清中未检测到色氨酸,提示IDO转染的软骨细胞表达了具有活性IDO;使用CFSE标记技术,检测IDO修饰的软骨细胞体外混合淋巴细胞反应中对同种异体T淋巴细胞增殖的影响,发现IDO基因转染组96 h后总体增殖指数为1.122±0.017,单纯淋巴细胞阴性对照组为1.026±0.016,阳性单纯软骨细胞组为1.201±0.026,较阳性对照组,IDO基因组同种异体T淋巴细胞增殖得到明显抑制。IDO基因修饰的软骨细胞可以抑制T淋巴细胞的增殖。     

小鼠FasL全长cDNA的克隆与FasL腺病毒载体的构建

目的: 克隆小鼠FasL全长cDNA, 构建FasL腺病毒载体。方法: 从经ConA(5mg/L)刺激 48h的BALB/c小鼠脾脏单个核细胞中克隆FasL全长cDNA, 构建以CMV启动子转录调控的含小鼠FasL全长cDNA的穿梭质粒mFasL pAdTrack。经PacI酶切后, 与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。挑选阳性重组子转染HEK- 293细胞, 构建CMV启动子转录调控的mFasL重组腺病毒载体。结果: 成功地克隆小鼠FasL全长cDNA, 经PCR、酶切及荧光检测等证实, 成功地构建了重组mFasL腺病毒载体。结论: 重组FasL腺病毒载体的构建为进一步研究FasL在肿瘤和自身免疫性疾病的作用奠定了基础。     

EIER2／neu和GM-CSF共转染树突状细胞的免疫杀伤研究

目的：探讨HER2／neu蛋白细胞胞外段的基因重组腺相关病毒（rAAV-HER2／neu）和粒-巨噬细胞集落刺激因子重组腺相关病毒（rAAV-GM-CSF）共转染树突状细胞（DC）诱导的细胞免疫应答。方法：成熟的DC通过淋巴细胞分离液分离培养获得，流式细胞技术分析HER-2／neu以及细胞表面标志CD1a、CD83、CD80、CD86和HIA-DR的表达，MTT检测混合淋巴反应，^3H-TdR释放法检测CTL杀伤活性，RT-PCR检测FasL表达。结果：共转染组（CT）、单独转染组（ST）和未转染组（UT）3组DC的细胞表面标志表达无统计学意义（P〉0．05），共转染组中HER2／neu和FasL的表达比单独转染组高，共转染组中可以检测到更强的混合淋巴细胞反应和CTL杀伤活性。结论：HER2／neu蛋白细胞外段的基因通过DC的抗原提呈作用可以诱导出免疫应答，其免疫应答作用与FasL表达相关，而GM-CSF可以增强其免疫应答作用。     

树突状细胞靶向性DNA疫苗的构建及其在CHO细胞的表达

目的 构建含OVA-Fc融合基因的真核表达质粒，证明其能在真核细胞CHO细胞表达。方法通过PCR从OVA-pcDNA3．1质粒中扩增出全长的小鼠OVA cDNA，酶切后克隆到含有小鼠IgG2a Fc cDNA的真核载体pMIgV，然后将OVA-Fc酶切后亚克隆入pcDNA3．1，构建真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1；脂质体转染法将其导入CHO细胞，流式细胞仪、Western blot、ELISA法检测融合蛋白OVA-Fc的表达。结果酶切鉴定和序列测定证明真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1构建正确；流式细胞术、Western blot、ELISA法均检测到转染的CHO细胞能表达OVA-Fc融合蛋白。结论OVA-Fc-pcDNA3．1真核表达质粒构建正确并能在真核细胞中表达，该质粒的成功构建与表达为进一步将其作为DNA疫苗治疗肿瘤、哮喘等疾病奠定了基础。     

转染FasL基因树突状细胞诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的研究

目的 制备稳定表达FasL蛋白的小鼠骨髓源树突状细胞(dendritic cell,DC)并探讨其诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的机理.方法 采用培养基选择法体外培养小鼠骨髓源DC,脂质体法转染FasL基因至小鼠成熟DC,实时定量PCR检测转染前后FasL mRNA的表达,流式细胞仪和免疫蛋白印迹检测转染前后FasL蛋白的表达.异系小鼠静脉分别输注未转染DC、转染空质粒DC和转染FasL的DC,7 d后TdT介导的原位末端标记法(TUNEL)和流式细胞仪检测脾脏中T淋巴细胞凋亡.结果 体外培养可获得成熟的小鼠骨髓源DC,转染FasL基因的DC较未转染DC FasL mRNA和FasL蛋白表达明显升高.对脾脏中T淋巴细胞凋亡的检测发现,转染FasL的DC组凋亡指数(11.67±1.53)明显高于未转染DC组(2.67±0.58)和转染空质粒组(3.33±0.58),P＜0.01.结论 培养基选择法可收获大量骨髓源DC,脂质体转染FasL基因至小鼠骨髓源DC,可以使DC高表达FasL蛋白.转染FasL的DC输注能明显诱导异系小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡.     

猪FasL基因在猪软骨细胞上的表达和鉴定

目的: 实现猪Fas配体(FasL)基因在猪软骨细胞中表达和鉴定。方法: 用RT- PCR扩增猪FasL基因片段, 构建重组pGCEN-FasL逆转录病毒载体, 并转染PA317细胞。经G418筛选获得高滴度的病毒液, 感染猪软骨细胞, 应用FACS和Westernblot检测软骨细胞上FasL的表达。结果: 经酶切分析、测序证明, 成功地构建pGCEN- FasL逆转录病毒载体。转染的软骨细胞表面FasL的表达率为 57%。Westernblot显示, 在Mr为 37 000处有 1条特异性蛋白带, 具有诱导Fas 细胞凋亡的作用。结论: 成功地构建重组猪FasL基因的逆转录病毒载体, 并在转染的软骨细胞上高表达具有生物学活性的FasL, 为建立同种异体软骨细胞移植的免疫耐受提供了实验依据。     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

CTLA4-Ig基因修饰的树突状细胞体外对Th1/Th2平衡的影响

目的:探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4 Ig)基因修饰的树突状细胞(CTLA4 Ig-DCs)体外对Th1/Th2平衡的影响。方法:通过腺病毒载体将目的基因(CTLA4 Ig)转染至小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)。采用流式细胞术(FCM)检测DC表面分子和胞内CTLA4 Ig的表达;采用混合淋巴细胞反应检测DC刺激同种异体T细胞的能力,ELISA法检测DC抗原提呈反应中Th1和Th2类细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平。结果:CTLA4 Ig基因成功转染至DC,转染率约为80%,制备的CTLA4 Ig-DCs稳定表达CTLA4Ig,表面分子CD86呈现低表达;CTLA4 Ig-DCs可有效抑制T细胞增殖,降低抗原提呈反应上清中IFN-γ和IL-4的分泌,并增加IFN-γ/IL-4比值。结论:通过腺病毒将CTLA4 Ig转染DC并且高效表达,可有效降低DC表面CD86分子,抑制同种异体T细胞反应,并能影响体外Th1/Th2水平。     

小鼠诱导性共刺激分子-Ig在小鼠树突状细胞中的表达及其效应研究

目的 获得mICOS-Ig基因修饰的小鼠DC，分析表达产物mICOS-Ig对T细胞活化的影响。方法 采用电转染方法将mICOS-Ig表达载体转入小鼠DC，通过ELISA法检测转染小鼠DC 60和96h以及稳定表达的培养上清；观察mICOS-Ig对同种混合细胞培养反应的影响。结果 ELISA法检测证明将mICOS-Ig表达载体转入小鼠DC，获得瞬时表达及稳定表达，mICOS-Ig可抑制单向混合淋巴细胞反应，抑制率达40％，其效应呈剂量依赖性。结论 获得了稳定表达mICOS-Ig融合蛋白的小鼠DC，mICOS-Ig表达产物对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用。     

FasL基因转染对大鼠肥大细胞凋亡的影响

目的：观察FasL基因转染对大鼠肥大细胞凋亡的影响。方法：RT-PCR法扩增大鼠FasL穿膜区和胞外区cDNA，成功构建pcDNA3．1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3，RT-PCR、免疫印迹法鉴定FasL在RBL-2H3上的表达，Annexinv流式细胞检测pcDNA3．1／FasL转染RBL-2H3后细胞的凋亡情况。结果：获得FasL穿膜区和胞外区eDNA，构建pcDNA3．1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3后在细胞膜和上清均有FasL的存在，瞬时转染RBL-2H3后48小时，细胞发生凋亡。结论：吧大细胞可以通过Fas-FasL途径凋亡，为FasL基因应用于过敏性疾病的治疗提供依据。     

真核表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建及其在NIH 3T3细胞株中的表达

目的: 构建pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体，并在NIH 3T3细胞株中表达。方法: 采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/IgGFc/CD80的真核表达载体pLNCX质粒上，转染NIH 3T3细胞株，经G418筛选细胞，用RT-PCR、流式细胞术检测目的基因表达情况。结果: 经菌落PCR、酶切及一次测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的成功构建；经RT-PCR法，能够从转染的NIH 3T3细胞中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段，流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。结论: 重组表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建，并在NIH 3T3细胞株中的成功表达，为该重组质粒转染原代T淋巴细胞从而制备CD20靶向性嵌合锚定T细胞奠定了基础。     

人4-1BB配体基因真核表达载体的构建、表达及其体外抗肿瘤效应

目的： 构建人4-1BB配体（h4-1BBL）全长基因的真核表达载体, 并在肿瘤细胞HT-29中转染表达; 探讨人4-1BBL基因转染的肿瘤细胞体外诱导的抗肿瘤活性.方法： 用RT-PCR从Raji细胞中克隆h4-1BBL全长基因, 测序后, 构建重组真核表达载体pcDNA3.1（-）-h4-1BBL.通过脂质体法以重组载体转染HT-29细胞, 用RT-PCR检测转染细胞中h4-1BBL mRNA的表达; 用流式细胞术检测转染细胞表面h4-1BBL分子的表达.分离外周血单个核细胞（PBMC）, 用抗CD3 mAb扩增T细胞, 并与h4-1BBL基因转染及未转染的HT-29细胞混合培养.用MTT比色法检测CTL的增殖及杀伤活性; 用流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞.结果： 从Raji细胞中克隆到h4-1BBL全长cDNA, 测序完全正确.构建的h4-1BBL基因真核表达载体在HT-29中获得稳定表达.与未转染的细胞相比较, h4-1BBL基因转染的肿瘤细胞HT-29能更有效地刺激T细胞活化、增殖, 促进IFN-γ分泌, 并能有效地诱导CTL产生针对野生型HT-29细胞的特异性杀伤.结论： 成功地构建pcDNA3.1（-）h4-1BBL重组真核表达载体.4-1BBL基因转染的肿瘤细胞介导的协同刺激信号, 能增强野生型肿瘤细胞的免疫原性, 诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

MHC II类抗原的诱导性表达和同种异体软骨细胞移植的免疫排斥

本研究将不同年龄香猪的软骨细胞和可注射性材料复合物Pluronic混合在一起 ,以 5 0× 10 6/ml浓度接种到版纳猪的腹部皮下 ,在第 1、 2、 4周取材作组织学检查 ,并进行软骨细胞表面标志的分析和测定淋巴细胞软骨细胞混合反应(MLChR )的强度。结果显示 :猪的软骨细胞仅表达MHCI类分子 ,分别来自胎猪、幼猪和成年猪的软骨细胞刺激MLChR的能力无显著差别 ,均表现抗原性较弱。经IFN γ诱导后 ,软骨细胞表达MHCII类抗原 ,能明显地刺激淋巴细胞增殖。免疫病理学检测发现 ,在组织化的软骨中 ,第 1周出现大量淋巴细胞浸润 ,第 4周组织化软骨消失。上述结果提示 ,体内同种异体软骨细胞被迅速排异 ,可能与MHCII类抗原诱导性表达有关     

人DAT基因的克隆及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的:探讨人多巴胺(DA)转运体(dopamine transporter,DAT)基因过表达对单胺类递质代谢的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增DAT cDNA片段,重组于pGEM-T-EASY载体中并进行全序列测定。重组真核表达载体pLNCX2-DAT转染MN9D细胞,Western Blot检测DAT的表达,高压液相(high-performance liquid chromatography,HPLC)法检测细胞内外DA含量的变化。结果:RT-PCR方法扩增得到1981bp的cDNA片段,测序结果表明所得到的片段与DAT序列完全一致;Westein Blot证实转染后的MN9D细胞(实验组)内DAT基因表达明显高于对照组(P0.05);HPLC结果表明实验组中细胞内外的DA含量明显高于对照组(P0.05)。结论:DAT高表达明显促进DA的循环和利用,为帕金森病的基因治疗提供了理论依据。     

端粒酶RNA基因在白细胞中表达的研究

用RT－PCR的方法钓取端粒酶RNA（hTR）基因的cDNA，将hTR基因克隆到逆转录病毒载体（pLNCX）构建哺乳动物细胞表达质粒，然后经脂质体介导转染人体正常的外周血白细胞中表达。结果表明端粒酶RNA基因的表达，不能激活或重建白细胞的端粒酶活性，流式细胞技术分析结果显示，外源hTR基因的表达不能延长白细胞的寿命，反而抑制白细胞的增殖并促进其凋亡，这可能是因为外源hTR基因的表达一定程度上阻碍了细胞内端粒酶RNA同端粒酶催化亚基的结合，同时也阻碍了端粒酶RNA模板区与端粒DNA之间的结合，从而影响端粒酶活性，抑制了细胞的增殖。     

人Nurr1基因克隆及其在真核细胞中的表达

为探讨Nurr1基因治疗Parkinson病的可行性,本研究克隆了中国人核相关受体1(nuclearrelatedreceptor1,Nurr1)基因,并重组携带Nurr1基因的真核表达载体,为该研究提供分子生物学基础。实验采用反转录聚合酶链式反应(RTPCR)方法从人胎儿脑中获取Nurr1cDNA,将其克隆至pGEMTEasy载体中;测序鉴定后,重组携带Nurr1基因的逆转录病毒载体pLNCX2Nurr1;通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系,用病毒上清感染NIH3T3细胞系以检测病毒滴度。结果发现,RTPCR扩增得到人Nurr1cDNA片段,序列与GenBank登录的序列一致;将Nurr1基因亚克隆至逆转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLNCX2Nurr1,病毒上清滴度为2×105CFU/ml。结果表明本实验获得人Nurr1基因cDNA序列,检测到Nurr1基因在真核细胞中表达,并得到较高滴度的病毒上清。     

异体角膜刺激引起的人外周血T细胞及其亚群CD25分子表达

目的：观察异体角膜体外对人外周血T细胞及其亚群CD25分子表达的影响。方法： 异体角膜与外周血淋巴细胞体外共同培养后，进行单克隆抗体标记和流式细胞分析。结果： 对照组T细胞CD25表达为25.2％；受角膜或沸波醇酯（PDB）激活后T细胞CD25表达分别为56.8％和80.9％；受角膜和沸波醇酯共同激活后T细胞CD25表达为70.2％；受异体角膜激活后，CD4和CD8 T淋巴细胞CD25表达分别为67.3％和52.3％。结论： 异体角膜组织体外能够刺激人外周T细胞CD25表达和T细胞活化，CD4 T细胞比CD8 T细胞活化更明显。     

CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究

目的 构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国地仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovurm,CHO）中功能性表达,寻找消除白血病细胞免疫逃逸的有效方法.方法 采用定向分子克隆技术将小鼠CD80胞外段和IgG1 Fc段的cDNA串联至真核表达载体pcDNA3.0中,运用脂质体将所得的重组子转染CHO细胞,经免疫印迹、斑点ELISA检测其表达,免疫亲和层析法纯化其表达产物,用流式细胞术、MTT比色法及ELISA在体外检测该产物的生物学活性.结果 两段目的基因按预期设想克隆入空载体中并得到了表达,亲和层析纯化获得了高纯度目的蛋白,该蛋白能够将白血病细胞表面CD80分子密度提高5倍,并可显著增强同种异体小鼠淋巴细胞的增殖、对白血病细胞的杀伤以及Ⅱ-2的分泌.结论 成功构建了融合基因真核表达载体,其表达产物在体外具有相应的生物学功能,有希望成为消除白血病细胞免疫逃逸的有力工具.     

SREBP-2沉默抑制衣霉素诱导的软骨细胞内质网应激

目的:探究固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)对衣霉素诱导的软骨细胞内质网应激(ERS)的影响。方法:分离人正常软骨细胞和骨关节炎(OA)软骨细胞培养,衣霉素和SREBP-2 siRNA分别处理正常软骨细胞。24 h后,实时荧光定量PCR检测对微小RNA-185(miR-185)表达的影响,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,Western blot法检测对SREBP-2、CHOP、p-e IF2α和ATF4等ERS相关蛋白,Bcl-2、Bax和caspase-3等凋亡相关蛋白水平的影响;caspase-3活性试剂盒检测对细胞caspase-3活性的影响。结果:与对照组相比,OA组和衣霉素组SREBP-2表达增加,miR-185表达降低(P0.05)。SREBP-2 siRNA转染可明显阻断衣霉素引起的miR-185降低(P0.05)。miR-185过表达能够下调SREBP-2蛋白水平(P0.05)。与对照组相比,OA组和衣霉素组CHOP、pe IF2α和ATF4的蛋白水平明显上调,Bcl-2表达下调,Bax和caspase-3表达增加(P0.05);SREBP-2沉默处理则显著逆转上述蛋白表达(P0.05)。细胞凋亡率与上述细胞凋亡相关蛋白的变化趋势一致(P0.05)。与衣霉素组相比,SREBP-2 siRNA转染明显下调caspase-3活性,miR-185抑制则明显逆转上述作用(P0.05)。结论:SREBP-2沉默可通过上调miR-185抑制衣霉素诱导的软骨细胞ERS和细胞凋亡。