中国人粘多糖贮积症I型IDUA基因突变的检测

目的：检测中国人粘多糖贮积症I型患IDUA基因（IDUA）突变。方法：采用PCR－SSCP、PCR产物直接测序等技术对35例粘多糖贮积症I型患的IDUA第2、6、7、8、9和10外显子相邻区域进行突变筛查。结果；本研究筛查出7种突变，均为单碱基置换。一内含子区突变nt1486C→T；一中性突变nt945G→C；1种无义突变E404X；4种错义突变：F198L、L218V、A361T和V454I。结论：中国人IDUA在第2、6、7、8、9和10外显 子区存在突变。在上述检测到的7种突变中，A361T国外已确定为多态性，E404X国外已报道为重型突变。而nt1486C→T、F198L和L218V和V454I为我们首次发现和报道，可能为新突变，但其突变性质还有待于进一步鉴定。     

颅内海绵状血管畸形CCM1基因突变的分析

目的探讨颅内海绵状血管畸形（ICM）患者CCM1基因突变的情况。方法收集经手术病理证实的ICM患者25例,均为汉族,其中家族性ICM7例。以30例正常健康人作为对照组。抽取两组对象的静脉血,提取基因组DNA、PCR,扩增CCM1基因8、9、11、12、13、15、16、17、18号外显子及部分两侧相邻的内含子、DNA测序,结果与GenBank比较。结果ICM患者中有11例被检测出7个新的CCM1基因突变,突变率为44％（11／25）。其中错义突变3个：12号外显子,1160A→C（Q387P）、1172C→T（S391F）;13号外显子,1405A→C（N469H）,插入突变2个：8号外显子,704insT（K246stop）;18号外显子,2138insG（T733stop）,内含子突变1个：IVS12-4C→T,同义突变1个：17号外显子,1875C→T（F625F）。除了1875C→T的同义突变可能为基因多态性以外,其他被发现的CCM1基因突变均导致编码KRIT蛋白的变化。对照组的CCM基因未检测出异常。家族性ICM的CCM1基因突变率高于散发性ICM,两者比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论国人ICM患者同样存在CCM1基因的突变,导致编码的KRIT1蛋白功能改变或缺失,这与ICM发病相关,是ICM发病的遗传学基础。     

女性血友病A FⅧ基因的双重杂合突变-1例基因分析

目的对1例女性血友病A(HA)患者家系进行基因分析，以探讨其分子发病机制。方法FⅧ：C等测定进行HA表型诊断；用LD—PCR进行内含子22倒位检测，对FⅧ基因的所有外显子及其侧翼序列进行扩增，用末端标记双脱氧法检测核酸序列。结果表型检测先证者(父亲)及其女儿的FⅧ：C分别为6．9％、3．4％；3人内含子22倒位为阴性；先证者女儿FⅧ14号外显子存在自发杂合突变(112183-112191)insA，18号外显子131252T→C(Leu1975Pro)；父亲FⅧ18号外显子存在相同突变，母亲FⅧ基因检测没有发现先证者的这2个突变。结论FⅧ14号外显子(112183-112191)insA与18号外显子131252T→C双重杂合突变可能是导致该患者HA的分子机制，其中18号外显子131252T→C为国际首次报道，14号外显子(112183-112191)insA为国内首次报道。     

乙型肝炎病毒adr型全基因组C区突变株的构建及其生物学活性检测

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)全基因组C区L97和V60突变质粒,并检测其生物学活性。方法采用定点突变技术将HBVadr1.2拷贝基因组质粒p3.8Ⅱ进行C区点突变,构建L97和V60两个突变株。质粒经脂质体介导转染HepG2细胞,Southern杂交分析细胞内HBVDNA复制,ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg。结果测序结果表明所构建的突变质粒p3.8L97和p3.8V60分别为nt2189A→C和nt2086C→G,突变质粒均可在宿主细胞内复制和表达。结论所构建HBV(adr型)全基因组C区L97和V60突变质粒具有生物活性。     

蛋白C基因复合杂合突变导致的肺栓塞及家系研究

目的了解1例肺栓塞患者及其家系成员发生蛋白C缺陷症的分子发病学机制。方法收集先证者及其家系成员的枸橼酸钠抗凝血,采用发色底物法检测PC活性(PC∶A)、蛋白S活性(FPS∶A)和抗凝血酶活性(AT∶A),采用ELISA方法检测PC抗原(PC∶Ag)水平。采用PCR方法对先证者PC基因所有9个外显子及其侧翼序列进行扩增、测序,发现突变后,对先证者家系成员的PC基因有关外显子片段进行PCR扩增和测序。结果先证者及其父亲、母亲和妹妹均为Ⅱ型PC缺陷症患者。PC基因测序结果显示先证者的PC基因分别出现了位于3号外显子第5540位碱基的G→A的杂合突变和位于第7号外显子第10230位碱基C→T的杂合突变,导致PC E29K和R147W双杂合突变。先证者父亲携带PC E29K杂合突变,而先证者母亲和妹妹均为PCR147W杂合突变的携带者。结论先证者为PC E29K和R147W基因复合杂合突变携带者,且这两种突变分别遗传自其父母。其中,PC E29K错义点突变为目前国际上尚未见报道的新突变,而PC R147W是一种已报道的常见于遗传性易栓症患者的可导致Ⅱ型PC缺乏的错义点突变。     

抗凝血酶基因T98I和A404T突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

目的研究抗凝血酶（AT）基因T98I和A404T突变致AT缺陷症的分子机制。方法构建AT野生型和突变体表达质粒（ATwt、ATT98I、ATA404T）并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验、脉冲-追踪试验和细胞免疫荧光染色;用荧光实时PCR（RT—PCR）检测转染细胞ATmRNA表达量的改变;蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径。结果ATT98I未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解,ATA404T仅部分从细胞内分泌、大部分未分泌并在细胞内逐渐降解。RT—PCR显示,与野生型ATmRNA相比,突变体ATmRNA不降低。脉冲-追踪试验发现,这两种AT突变体分泌障碍,未在细胞内聚集而是降解。蛋白降解抑制实验显示,突变体ATT98I通过蛋白体酶途径进行细胞内降解。转染细胞荧光染色显示,转染ATT98I质粒的CHO细胞内荧光强度明显减弱、无明显核周聚集,而转染ATA404T质粒的CHO细胞内荧光减弱且弥散分布于胞质、核周有轻度聚集。结论分泌障碍和细胞内降解是AT基因T98I和A404T突变导致AT缺陷症的分子病理机制。     

45例国人Wilson病基因第8外显子突变热区检测和序列分析

目的 检测中国人群Wilson病基因(ATP7B)第8外显子突变频率并进行序列分析。方法 采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)银染技术初步研究了30例患者和15例正常人ATP7B基因第8外显子突变频率，然后对突变个体直接测序，进而与临床表型作相关分析。结果 SSCP发现有6例患者出现第8外显子泳动异常(20％，6／30)，且均为杂合子；4例患者既存在2273G→T，又同时伴有2250C→G及2280G→T；前者是错义突变(即Arg778Leu)，累及Tm4区，后者由于氨基酸组成均为Leu仅是一种保守改变，对Tm4区无影响；1例患者同时存在2099A→G、2273C→T、2250C→G及2280G→T4个位点突变，前两者分别影响Tm3、Tm4区，后两者认为是保守改变；1例患者2245G insertion是一种新的突变类型，影响Tm4区。结论 提示中国人ATP7B基因第8外显子可能为一突变热区，2273G→T(Arg778Leu)是一种常见的突变类型，Tm4是常见受累功能区之一。     

蛋白C基因复合杂合突变导致的肺栓塞及家系研究

摘要：目的了解1例肺栓塞患者及其家系成员发生蛋白C缺陷症的分子发病学机制。方法收集先证者及其家系成员的枸橼
酸钠抗凝血,采用发色底物法检测PC活性（PC∶A）、蛋白S活性（FPS∶A）和抗凝血酶活性（AT∶A）,采用ELISA方法检测PC抗原
（PC∶Ag）水平。采用PCR方法对先证者PC基因所有9个外显子及其侧翼序列进行扩增、测序,发现突变后,对先证者家系成员
的PC基因有关外显子片段进行PCR扩增和测序。结果先证者及其父亲、母亲和妹妹均为Ⅱ型PC缺陷症患者。PC基因测序
结果显示先证者的PC基因分别出现了位于3号外显子第5540位碱基的G→A的杂合突变和位于第7号外显子第10230位碱基
C→T的杂合突变,导致PC E29K和R147W双杂合突变。先证者父亲携带PC E29K杂合突变,而先证者母亲和妹妹均为PC
R147W杂合突变的携带者。结论先证者为PC E29K和R147W基因复合杂合突变携带者,且这两种突变分别遗传自其父母。
其中,PC E29K错义点突变为目前国际上尚未见报道的新突变,而PC R147W是一种已报道的常见于遗传性易栓症患者的可导
致Ⅱ型PC缺乏的错义点突变。
     

哈萨克族苯丙酮尿症F161S/EX6-96A→G双重突变基因杂合子鉴定

目的鉴定新疆哈萨克族苯丙酮尿症（PKU）F161S和EX6-96A→G双重突变基因杂合子。方法应用PCR及单链构象多态性（SSCP）分析技术结合基因序列测定方法确定突变类型。结果对患者PAH基因第3、5、6、7、11、12外显子分别进行SSCP实验筛检，在外显子5和外显子6中，均发现患者的SSCP电泳条带位置与正常对照不同，遂对患者的这两个外显子基因区域分别测序，结果显示：在外显子5中cDNA第482位发生了T→C突变，是F161S型基因突变，而外显子6则在cDNA第611位发生了A→G突变。是EX6-96A→G型基因突变，即患者为F161S／EX6-96A→G型双重突变基因杂合子。结论在新疆哈萨克族中检出的PKU F161S／EX6-96A→G型双重突变基因杂合子，为本民族首次报道。     

中国人腓骨肌萎缩症线粒体融合蛋白2基因突变分析

目的 分析线粒体融合蛋白2(MFN2)基因在中国人腓骨肌萎缩症的突变情况,建立快速、有效和经济的基因诊断方法 .方法 应用变性高效液相色谱(DHPLC)结合DNA直接测序的方法 ,对9个常染色体显性遗传的CMT2先证者和26个散发CMT2病例共35例患者进行MFN2基因编码区17个外显子及其侧翼区的突变检测.结果 在35例腓骨肌萎缩症患者中共检测到3种MFN2基因序列变异:c.281G→A,c.395G→A和c.408A→T,其中c.395G→A(C132T)为首次报道的致病突变,c.281G→A(R94Q)为已知致病热点突变,c.408A→T(V136V)为单核苷酸多态.DHPLC突变检测的敏感性和特异性为100%.结论 首次在国内应用DHPLC结合DNA直接测序对MFN2基因进行突变检测,发现2个致病突变和1个单核苷酸多态.DHPLC结合DNA直接测序法可准确有效地用于大规模MFN2基因突变筛查.     

高亲和力IgE受体β链基因与儿童哮喘的相关性研究

目的研究FcεRⅠ-β的I181L、V183L和E237G突变在四川地区11岁以下汉族儿童中的存在和频率,判断这些突变与儿童哮喘的相关性。方法利用扩增阻滞突变系统聚合酶链技术(ARMS-PCR)对四川地区的48例汉族哮喘儿童进行FcεRⅠ-β的1811、83、237三个位点的突变进行检测和分析,并与40例健康儿童进行对照。结果在哮喘组中检测到I 181L突变5例(10.4%),V 183L突变2例(4.2%),E 237G突变6例(12.5%),在对照组中未发现I 181L、V 183L、E 237G突变子。结论四川地区汉族儿童中存在I 181L、E 237G突变,不存在V 183L突变或突变率极低。I 181L突变与哮喘存在相关性(P<0.05),E 237G突变和哮喘有相关性(P<0.025),而V 183L与哮喘不存在相关性(P>0.05)。     

高亲和度IgE受体β链基因多态性与过敏性哮喘相关性的研究

目的：检测Fcepsilon RI-beta三个突变位点H81L，V183L和E237G在中国南方汉族人群中的存在和频率分布；判断这些突变与哮喘及特应症的相关性。方法：利用扩增阻滞突变系统聚合酶使技术(ARMS—PCR)对60例哮喘患者Fc epsilon RI-beta基因编码181，183和237的三个氨基酸位点进行分析和检测，并与65例正常人进行对照。结果：在哮喘组中检测到1例1181L杂合子，被检人群中没有发现V183L突变。Glu237／C1y237在哮喘人群中的频率是18．3％，E237G突变基因频率为9．2％；Glu237／C1y237在特应性哮喘人群中的频率是22．6％E237G突变的基因频率为11．3％，G1u237／G1y237在正常对照人群中的频率是6．2％E237G突变的基因频率为3．1％。结论：在中国南方汉族人群中存在E237G突变。不存在V183L突变或突变率很低。E237G突变与哮喘有相关性(P＜0．05 OR＝3．18)；E237G突变与特应症有相关性(P＜0．025 OR＝4．00)，I181L突变的存在不确定。     

Hepatitis B virus S gene mutants in infants infected despite immunoprophylaxis

Objective　To assess the correlation between hepatitis B virus (HBV) surface gene mutant infection and hepatitis B (HB) vaccination failure. Methods　Using sera from 106 infants who were born to HBV carrier mothers and failed in HB immunoprophylaxis, HBV S gene was amplified by PCR, transferred to nylon membranes for Southern blots, and then hybridized with oligonucleotide probes. Eleven of non-hybridizing samples were used for DNA sequencing. Results　93.4% (99/106) of the samples were HBV DNA positive, and 30.3% (30/99) failed to hybridize with at least one of the four probes. DNA sequencing confirmed that 10 of the 11 samples had an S gene mutation with amino acid (aa) change. The identified mutants included nucleotide (nt) 546T→A(aa131N→T), nt531T→C (aa126I→T), nt491A→C (aa113T→P), nt491T→A (aa113S→T), nt533C→A (aa127P→T), nt581T→A (aa143S→T), nt636A→T (aa161Y→F), and nt679A→C (aa175L→F). The sequence in one mother-infant pair was completely the same, with mutations at aa131 and aa161. Conclusions　The prevalence of HBV surface mutants is about 30% in the children failing in HB vaccination. HBV mutants can infect infants by maternal-infant transmission.     

一性连锁智障家系AGTR2基因新突变位点的检测

目地 探讨AGTR2基因突变与智障的关联关系。方法 通过PCR和直接测序对一性连锁智障家系13个受检个体血管紧张素-Ⅱ2型受体基因（AGTR2）的全长序列进行检测。结果 在AGTR2基因第3外显子3550位点，2个男性患儿均存在C／T碱基替换，该基因第182位编码氨基酸由谷氨酰氨变为终止密码（nt3550C／T．Q182Stop／E3）。正常男性家系成员无此突变，而女性家系成员存在杂合子。结论 nt3550C／T可能为引起该家系学床病变的突变位点，不是多态性位点。在伴性连锁智障疾病中，AGTR2基因的这个单碱基替换突变位点为首次报道。     

乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变及其临床意义

目的探讨利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)前C区/BCP区基因突变方法的临床价值及前C区/BCP区基因突变的临床意义。方法应用基因芯片技术检测95例慢性乙型肝炎患者的HBV前C区G1896A(nt1896G→A)、A1814C(nt1814A→C)及HBV C基因启动子(BCP)T1762A、G1764A(nt1762A→T、nt1764G→A)四位点突变,同时检测血清HBV DNA含量及ALT、AST水平。结果95份血清标本中,有91份分别检测到了HBV前C区/BCP区基因突变,阳性率95.8%,其中61896A突变33例(36.3%),A1762T G1764A联合突变64例(70.3%),G1896A A1762T G1764A联合突变22例(24.2%),未检测到A1814C突变毒株。抗-HBe阳性的慢性乙肝患者HBV前C区/BCP区突变率较HBeAg阳性的患者明显增高。G1896A突变后血清ALT水平与未变异组比较有显著性差异(P<0.05),而其他各组的肝功能无显著变化。G1896A A1762T G1764A联合突变后,血清HBV DNA水平较未变异组降低(P<0.05),其他各组间则无显著变化。结论应用基因芯片法测定HBV特定变异位点,可一次同时检测多个突变位点,具有一定的临床应用价值。HBV前C区/BCP区突变对血清HBVDNA水平和肝功能有一定的影响。     

一个新的双重杂合突变Met306Val和Thr181Asn导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症

目的 对1例遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺乏症患者及其家系成员进行凝血因子Ⅶ（FⅦ）基因分析,揭示其发病的分子机制。方法提取先证者及其家系成员外周血基因组DNA,聚合酶链反应（PCR）法扩增FV0基因8个外显子及其侧翼序列,核苷酸序列分析检测FV0基因异常;将先证者突变序列、家系成员和100名正常人相应序列的PCR产物用限制性内切酶EC091I消化,以进一步确定基因突变位点并排除基因多态性;用蛋白质分子模型模拟软件对基因突变的分子结构病理学进行分析。结果先证者FV0基因8号外显子的10833位核苷酸发生A→G杂合突变,导致Met306Val;先证者7号外显子的9643位核苷酸发生C→A杂合突变,导致Thr181Asn。家系分析前者遗传于母亲,后者遗传于父亲,先证者胞妹为A10833G（Met306Val）杂合子。蛋白质空间构型模拟分析发现,Met306Val突变位于FⅦ分子的表面,产生空间位阻影响蛋白的结构和功能。结论FⅦ基因Met306Val和m18lAsn双重杂合突变是导致该遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症的分子机制;推测Met306Val突变改变了蛋白质分子的空间构型,从而影响FⅦ蛋白的功能。Met306Val突变是一种国际上尚未报道的新的突变类型。     

3个遗传性对称性色素异常症家系中DSRAD基因的突变

目的:检测国内3个遗传性对称性色素异常症家系中DSRAD基因的突变.方法:PCR扩增3个家系中成员DSRAD基因的全部外显子,并行DNA测序.以100例无关正常人作对照.结果:PCR结合DNA测序发现3个家系中患者均存在DSRAD基因的异常:家系A中第3220位碱基发生了C→T的杂合突变,对应1074位的精氨酸被半胱氨酸替代;家系B与家系C中发现的突变相同,为第3325位碱基发生了G→T的杂合突变,对应1109位的天冬氨酸被酪氨酸替代.家系中未患病者及无关正常人未发现相应突变.结论:此3个遗传性对称性色素异常症家系中存在DSRAD基因的特异性突变,突变可能使蛋白功能缺陷,导致临床上出现皮肤色素异常.     

苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因外显子7突变特点及临床研究

目的:探究苯丙酮尿症(PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子7突变特点及其与临床的关系.方法:选取87例PKU患儿为研究对象.聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析PAH基因外显子7突变与基因测序,分析其与经典型、中间型及轻型PKU之间的关系.结果:87例患儿检出6种PAH基因外显子7位点突变,分别为R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V,其基因频率分别为18.97％、4.02％、1.72％、1.15％、1.15％、0.57％;经典型PKU患儿检出6种突变,中间型PKU检出R243Q、IVS7+2T-A、R241C等3种突变,而轻型PKU仅检出R243Q突变;应用外显子7位点突变情况预测患儿PKU表型显示,经典型、中间型及轻型PKU预测与临床诊断一致性较高,Kappa值分别为0.818、0.781、0.935.结论:PKU患儿PAH外显子7突变主要以R243Q、IVS7+2T-A为主,其基因型与PKU表型存在相关性,有助于患儿PKU表型预测.     

糖原累积病Ⅱ型七例的临床表现及基因突变分析

目的 报道7例糖原累积病Ⅱ型(GSDⅡ)的临床表现及α-1,4葡萄糖苷酶(GAA)基因突变特点.方法 2003-2011年在北京大学第一医院行肌肉活检的患者中有7例诊断为GSDⅡ.其中婴儿型1例,其主要症状为生后出现全身力弱、心脏扩大、呼吸困难和肝脏肿大;晚发型患者6例,发病年龄在1～29岁,主要表现为进展性肢体力弱,其中2例有呼吸肌受累.7例患者均伴随CK升高,5例肌电图呈肌源性损害,1例为神经源性损害.肌肉活检均发现肌纤维存在嗜碱性空泡,电镜检查发现大量膜性包裹的糖原.应用PCR产物直接测序法对患者进行GAA基因的所有外显子及其侧翼序列突变检测.对发现的新突变位点在100例正常对照中进行筛查.结果 7例GSDⅡ患者均存在GAA基因突变,共检测出11种点突变和1种缺失突变,其中p.P361L、p.P266S、p.R437C、p.R600C、p.W746S和p.W746*为文献已经报道的突变,p.R168Q、p.R168P、p.E521V、p.R594H和c.827_845del为尚未报道的新突变类型.除p.R168Q在2例正常对照中检测到外,其余新突变均未发现正常携带者.7例GSDⅡ患者携带的突变各不相同,仅p.P361L和p.W746 *出现在两例患者中.结论 我国GSDⅡ患者存在较多新发突变,提示该病可能具有较多个体化突变.p.P266S、p.P361L和p.R437C突变可能与临床晚发型的GSDⅡ有一定相关性.     

乙型肝炎病毒C区变异与拉米夫定治疗后HBVDNA反弹关系的研究

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)C区变异及变异位点与拉米夫定抗病毒治疗后HBVDNA反弹的关系.方法:应用PCR-序列分析法,多引物对巢式PCR法,检测10例用拉米夫定治疗的乙型肝炎患者(治疗组), 以及10例从未用过抗病毒治疗患者(对照组)的C区的突变位点及HBV基因型.结果:治疗组10例病人中4例检出有C区变异,变异位点分别为:I134V、P164Q、I126L E142D P159T及L84I I88V I126L P159A P164;对照组10例病人中有5例检出有C区变异,变异位点分别为: A83G、A83G P164Q、I126L P164Q、I126L P159T;其中I134V、E142D、L84I、I88V位点的变异仅出现在拉米夫定治疗后HBVDNA反弹的3例病人中,而且感染的HBV均为C基因型.结论:C区I134V、E142D、L84I、I88V位点变异可能与拉米夫定的耐药有关;感染C基因型的病人比B基因型的病人更易出现与拉米夫定耐药相关的C区变异.