注射用免疫核糖核酸II的免疫调节及对顺铂的增效减毒作用

 目的 研究干扰素刺激基因因子3（ISGF3）在干扰素α（IFN-α）抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制机制中的作用。 方法 应用定量PCR技术检测IFN-α处理前后人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞上清HBV DNA含量，DNA印迹法检测IFN-α处理前后HepG2.2.15细胞内HBV复制中间体的变化，蛋白质印迹法检测IFN-α处理前后HepG2和HepG2.2.15细胞中ISGF3的3个组分即信号转导和转录活化因子（STAT）1、磷酸化STAT2和ISGF3γ以及双链RNA依赖蛋白激酶(PKR)蛋白质表达水平的改变。用酪氨酸酶抑制剂染料木黄酮抑制IFN-α作用后，再次进行上述检测。 结果 IFN-α处理后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和细胞内HBV复制中间体减少，HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达水平均升高。加染料木黄酮抑制IFN-α后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和复制中间体无减少，而HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达均减少。 结论 ISGF3是IFN-α抑制HBV复制的关键因子。     

磷酸脂酶抑制剂冈田酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

 目的 初步鉴定可能与 HBV 核心蛋白去磷酸化有关的磷酸酯酶。 方法 以磷酸酯酶 2A 抑制剂冈田酸（OA）处理体外培养的人肝癌 HepG2.2.15 细胞。将细胞分为 4 组，分别加入终浓度为 0（对照组）、10、20、30 ng/ml 的 OA（OA 10 ng 组、OA 20 ng 组、OA 30 ng 组），每组各设 5 孔。在培养 0、2、4、6 d 时分别收集各组细胞培养上清液，采用电化学发光方法检测 HBsAg 浓度，荧光实时定量 PCR 方法检测 HBV DNA 拷贝数。取培养 2 d 时的各组细胞，采用蛋白质印迹方法检测 HBcAg 异质性，免疫荧光细胞化学染色方法检测 HBcAg 亚细胞定位。 结果 OA 10ng 组、OA 20 ng 组各时间点细胞培养上清液HBsAg 浓度、HBV DNA 拷贝数分别与对照组相应各时间点比较，差异均无统计学意义；在培养 2 d 时 HBcAg 电泳条带、亚细胞定位分别与对照组比较均无明显异常。OA 30 ng 组在培养 2、4、6 d 时细胞培养上清液 HBsAg 浓度（ng/ml）均明显低于对照组相应各时间点（分别为 385.9 ± 43.1 vs. 510.2 ± 63.3、346.5 ± 39.6 vs. 484.6 ± 59.4、295.1 ± 32.8 vs. 467.2 ± 52.9，P 值分别为 0.028、0.022、0.016）；在培养 2 d 时细胞培养上清液 HBV DNA 拷贝数（ml-1）明显高于对照组相应时间点（6.71 ± 6.07 vs. 6.34 ± 5.72，P = 0.022），而在培养 4、6 d 时均明显低于对照组相应各时间点（分别为 5.80 ± 5.19 vs. 6.29 ± 5.68、4.75 ± 4.15 vs. 6.25 ± 5.58，P 值分别为 0.008 和 0.005）；在培养 2 d 时 HBcAg 电泳条带明显增宽，约 20% 的 HepG2.2.15 细胞的细胞核内 HBcAg 红色荧光信号明显增强。 结论 短时间、高浓度的 OA 处理可提高 HBV DNA 的复制水平和核心蛋白的磷酸化水平，提示磷酸酯酶 2A 可能参与了 HBV 核心蛋白的去磷酸化过程。     

细胞人基因组DNA对荧光实时定量PCR检测细胞培养液中HBV DNA的影响

 目的 研究细胞人基因组 DNA 对荧光实时定量 PCR（FQ-PCR）检测细胞培养上清液中 HBV DNA 含量的可能干扰影响，提高细胞培养上清液中 HBV DNA 定量检测的准确性。方法 取 HBV DNA 阳性血清，以 DMEM 培养基分别配制出 HBV DNA 拷贝数为 5 × 107/ml（高拷贝组）、5 × 105/ml（中拷贝组）、5 × 103/ml（低拷贝组）的不同样本组；各组内再分 5 个亚组，分别加入终浓度为 0（对照组）、12.5、25、50、100 μg/ml 的细胞人基因组 DNA（提取自人肝癌细胞系 HepG2）。以不含 HBV DNA 阳性血清的 DMEM培养基加入上述浓度细胞人基因组 DNA 为空白组。采用基于 TaqMan 技术的 FQ-PCR 检测各组样本的 HBV DNA 拷贝数并绘制 HBV DNA 定量曲线。每组均重复检测 10 次。根据 HBV DNA 定量检测结果确定受干扰样本和未受干扰样本，分别计算其定量曲线线性期斜率和平均扩增效率。 结果 高拷贝组中加入不同浓度细胞人基因组 DNA 的各个亚组与相应对照组比较，HBV DNA 拷贝数差异均无统计学意义。中拷贝组中加入细胞人基因组 DNA 浓度为 50 和 100 μg/ml 的 2 个亚组，其 HBV DNA 拷贝数结果明显高于相应对照组，增高可达 50 ~ 100 倍，且重复性差。低拷贝组中只有加入细胞人基因组 DNA 浓度为 12.5 μg/ml的亚组可通过提高基线值取得与相应对照组接近的定量检测结果，而其他亚组 HBV DNA 定量曲线指数扩增期斜率明显异常，无法确定其定量检测结果。空白组各亚组均未观察到明显的 HBV DNA 指数扩增期。受干扰样本线性期斜率（-1.01 ± 0.06）和平均扩增效率（90.0% ± 2.1%）与对照组样本（分别为 -1.52 ± 0.06，97.0% ± 0.4%）比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 细胞人基因组 DNA 对应用 FQ-PCR 技术进行的HBV DNA 定量检测可产生非特异性干扰，尤其在 HBV DNA 拷贝水平较低时。在细胞培养上清液作 HBV DNA 定量检测时应尽量去除细胞人基因组 DNA。     

着色性干皮病基因D和p53对HBV复制的影响

 目的:探讨人着色性干皮病基因D(XPD) 和p53对乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法:使用脂质体转染法把重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染进入人肝癌细胞株HepG2.2.15细胞,转染后的第2天用20 μmol/L pifithrin-α（p53抑制剂）孵育细胞24 h。实验共分为空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α组和pifithrin-α组。使用RT-PCR法检测XPD、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）及乙型肝炎病毒X蛋白（HBx） mRNA表达的变化;使用ELISA法检测培养上清液中HBsAg和HBeAg含量的变化;用荧光定量PCR法检测培养上清液中HBV-DNA含量的变化;用bDNA法检测细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量的变化。结果:RT-PCR结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染可使得XPD mRNA表达增高,XPD表达增高能使得HBsAg、HBeAg和HBx mRNA表达明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。ELISA结果显示,XPD表达增高能使得培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。荧光定量PCR结果显示,XPD表达增高能使得培养上清液中HBV-DNA含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。bDNA结果显示,XPD表达增高使得细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。结论: XPD能通过p53通路抑制HBV复制,所以XPD和p53可能成为乙型肝炎抗病毒治疗的作用靶点。     

针对S基因的siRNA抑制HepG2 2.2.15细胞中HBV基因的表达

目的 构建针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA（short interfering RNA）表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,观察其对HepG2 2.2.15细胞中的HBV基因表达的影响.方法 设计并合成针对HBV S区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG2 2.2.15细胞,经200μg/ml潮霉素抗性筛选,4周后获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,免疫荧光染色检测细胞内抗原的表达,同时用RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果 成功构建了针对HBV S基因的siRNA表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,两种siRNA均能明显抑制HepG2 2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为83%和78%,免疫荧光染色显示siRNA能抑制细胞内抗原的合成,RT-PCR结果证实HBV的mRNA表达降低,而无关序列的siRNA和对照则无此作用.结论 载体产生的针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达.     

GM-CSF与IL-21基因共转染卵巢癌细胞及其对NK细胞活性的影响

 目的 探讨粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与 IL-21 基因共转染的体外抗肿瘤效应。 方法 制备 pRSC-GM-CSF- IL21 重组质粒，再用脂质体将 质粒 pRSC-GM-CSF、pRSC-IL21 和 pRSC-GM-CSF-IL21 分别转染人卵巢癌 SKOV3 细胞（依次命名为 SKOV3/GM- CSF、SKOV3/IL21、SKOV3/GM-CSF-IL21 细胞）。以 RT- PCR 方法检测 GM-CSF 与 IL-21 表达；倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化；噻唑蓝法测定各组细胞增殖活性；流式细胞仪检测各组细胞细胞周期分布，细胞表面 HLA-ABC、主要组织相容性复合体 I 类相关基因（MIC A/B）、细胞间黏附分子 1（ICAM-1）的表达，以及各组细胞培养上清液对 NK 细胞活性的影响。以未转染的 SKOV3 细胞和转染空质粒 pRSC 的细胞（SKOV3/Neo）为对照。 结果 经酶切与测序鉴定，pRSC-GM-CSF-IL21 重组体构建正确，共转染 SKOV3 细胞中有目的基因 GM-CSF、IL-21 的表达。各组细胞的形态学、增殖特性、细胞周期分布及 HLA-ABC 表达无明显变化。SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL21 和 SKOV3/GM-CSF-IL21 细胞的 MIC A/B 表达量分别为 19.24% ± 2.31%、31.11% ± 3.76%、37.27% ± 3.04%、54.97% ± 4.77% 和 63.94% ± 5.90%；ICAM-1 表达量分别为 35.88% ± 3.06%、37.75% ± 4.09%、68.59% ± 4.84%、78.53% ± 5.78% 和 84.10% ± 3.98%；加入各组细胞培养上清液后 NK 细胞活性分别为 31.8% ± 3.6%、42.7% ± 3.3%、54.7% ± 7.4%、55.9% ± 4.4% 及 63.4% ± 6.4%。SKOV3/GM-CSF-IL21 细胞分别与 SKOV3、SKOV3/ Neo 细胞比较，3 项指标的差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 GM-CSF 与 IL-21 基因共转染可上调 SKOV3 细胞表面 MIC A/B 与 ICAM-1 表达，表达产物可增强 NK 细胞活性，这有助于免疫细胞激活，增强抗肿瘤效应。     

蝉拟青霉多糖体外对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的: 探讨蝉拟青霉多糖(PcPS)体外对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用及对HepG2.2.15细胞表达Toll样受体4 (TLR4) mRNA的影响。方法: 以不同浓度PcPS与HepG2.2.15细胞株共培养,以拉米夫定 (LMV)为阳性对照,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和ELISA法,检测PcPS对HepG2.2.15细胞毒性作用及其分泌HBsAg、HBeAg的情况。实时荧光定量PCR分析PcPS对HepG2.2.15细胞表达与分泌HBV-DNA和TLR4 mRNA表达的影响。结果: 蝉拟青霉多糖在体外能有效抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg,最大抑制率分别为44.8%、31.0%;对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA复制和TLR4 mRNA表达均有一定抑制作用。结论: 一定浓度的蝉拟青霉多糖在体外具有显著抑制HBV的复制作用。     

HMGN2分子体外抗乙型肝炎病毒活性研究

目的： 我们先前的研究证明HMGN2（high mobility group nucleosomal-binding domain 2）是人LAK细胞抗菌的一个新的效应分子,本研究欲检测其体外抗乙型肝炎病毒的活性。方法: 应用反向高效液相色谱技术从人淋巴结组织酸溶性提取物中分离纯化批量HMGN2分子,用质谱精确分子量测定、Western blotting和抗菌试验对分离纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。采用MTT法检测HMGN2分子对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;用不同浓度HMGN2分子作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3 d和第6 d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBV DNA的含量。结果: 从人淋巴结组织中分离纯化获得纯度较高的HMGN2蛋白;在检1-100 mg/L范围内,HMGN2分子对HepG2.2.15细胞无细胞毒性;HMGN2分子在1-5 mg/L水平即可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,可显著降低HBV DNA拷贝数。结论: HMGN2分子在体外具有较强的抗HBV活性。     

霉酚酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

目的:探讨霉酚酸（MPA）在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。 方法:将不同浓度的MPA（1-20 mg/L）作用于HepG2.2.15细胞，在外加或不加鸟嘌呤核苷（简称鸟苷）的情况下，分别收集第4 d细胞培养上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg），采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测细胞内乙型肝炎病毒核心蛋白mRNA（HBV core mRNA）,狭缝印迹杂交法定量分析细胞内 HBV DNA。 结果:在不外加鸟苷情况下，MPA对HBV复制具有抑制作用，随着浓度增加，对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升，细胞内HBV DNA复制水平下降。外加鸟苷后能逆转MPA对HBV复制的抑制作用。 结论:MPA对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌及HBV DNA复制具有抑制作用。MPA可能通过减少细胞内鸟苷酸的合成来实现对HBV复制的抑制。     

CpG-ODN对慢性乙型肝炎患者PBMC免疫刺激作用的观察

目的 观察CpG-ODN体外对慢性乙型肝炎患者PBMC的免疫刺激效应.方法 CpG-ODN体外刺激慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC),用ELISA检测培养液中IFN-α的水平;将不同比例的PBMC培养上清与HepG2.2.15细胞共孵育4和8 d后,用ELISA和荧光定量PCR法,分别检测培养上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平;MTT法观察活化的PBMC培养上清液对HepG2.2.15的杀伤作用.结果 CpG-ODN可有效诱导慢性乙肝患者PBMC分泌IFN-α,增强其活化的PBMC培养上清液对HepG2.2.15的杀伤作用;CpG-ODN本身虽不能直接抑制HBV的复制,但可通过其活化的PBMC的培养上清抑制HepG2.2.15细胞产生HBsAg、HBeAg和HBV DNA.结论 CpG-ODN可有效激活慢性乙肝患者的免疫细胞,发挥抗病毒效应.     

巯基化Ras相关蛋白7a抑制人肝癌细胞系HepG2.2.15中HBV复制

目的探究人肝癌细胞HepG2.2.15中Ras相关蛋白7a (Rab7a)的巯基化机制及其对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法通过生物素转换实验检测H2S对HepG2.2.15细胞中Rab7a巯基化水平的影响并验证Rab7a的巯基化位点;通过酶联免疫法、RT-qPCR和Western blot检测巯基化的Rab7a对HBV复制标志物水平的影响。结果在HepG2.2.15细胞中H2S可增强内源性Rab7a的巯基化水平(P<0.01);NaHS(H2S速释供体)可增强外源性Rab7a的巯基化表达,但其巯基化位点突变后则不受NaHS影响(P<0.01);Rab7a巯基化后,可抑制HepG2.2.15细胞上清中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA及细胞内HBV-cccDNA、3.5kb RNA、total RNA和HBcAg蛋白的表达(P<0.05)。结论 Rab7a的巯基化抑制HBV阳性细胞系HepG2.2.15细胞中HBV的复制水平。     

HBV cccDNA在2.2.15细胞表达的动态观察

目的研究2.2.15细胞中是否存在HBVcccDNA,探讨2.2.15细胞内HBV产物的动态表达规律。方法采用PCR方法检测2.2.15细胞内cccDNA,Taqman定量PCR技术检测2.2.15细胞内及培养上清中HBVDNA含量,EIA方法检测培养上清中HBsAg、HBeAg的动态表达,并进行定量资料相关性统计学分析。结果2.2.15细胞及培养上清中存在cccDNA,2.2.15细胞培养上清中HBVDNA与HBsAg、HBeAg之间存在相关性(r=0.833,P<0.05和r=0.939,P<0.01),而细胞内HBVDNA与培养上清HBVDNA及HBsAg、HBeAg之间无相关性(r=0.024,P>0.05和r=0.177,P>0.05)。结论为阐明2.2.15细胞内HBV的复制规律提供一定依据。     

Suppression of furin by interferon-γ and the impact on hepatitis B virus antigen biosynthesis in human hepatocytes

The roles of furin and intrahepatic cytokines in chronic heptatitis B virus (HBV) infection remain largely unknown. Here, we examined the relations between furin, IL-10, IL-12β, interferon (IFN)-γ, programed death (PD)-1, programed death ligand (PD-L)1, and the suppression of hepatitis B e antigen (HBeAg) and surface antigen (HBsAg) biosynthesis. Liver biopsies were performed on 20 chronically HBV-infected (15 HBeAg-positive and 5 HBeAg-negative) patients to assess liver inflammation/fibrosis, and mRNA levels of furin, IL-10, IL-12β, IFN-γ, PD-1, and PD-L1 were assessed by quantitative real-time PCR. IFN-γ mRNA abundance was associated with lower furin mRNA levels and higher PD-1 and PD-L1 mRNA levels in liver tissue from HBeAg-positive patients. IL-10 and IL-12β mRNA levels positively correlated with IFN-γ expression levels (P < 0.05). PD-L1 and furin mRNA levels were further assessed in IFN-γ-stimulated hepatoma cell lines with (HepG2.2.15 cells) and without (HepG2 and Huh7 cells) HBV replication. IFN-γ enhanced PD-L1 expression in hepatoma cells. In HepG2.2.15 cells, IFN-γ further suppressed furin and HBeAg expression. Furin inhibition and knockdown in HepG2.2.15 cells also down-regulated HBeAg and HBsAg biosynthesis. These data suggest that IFN-γ modulates the inflammatory response to avoid excessive hepatocyte damage through the enhancement of PD-1/PD-L1 expression, whereas furin suppression may contribute to a reduction in HBeAg/HBsAg biosynthesis.