小鼠白蛋白基因的特异性调控及其在转基因动物中的应用

白蛋白是肝脏表达的血清蛋白 ,其组织特异性表达的基础在于白蛋白基因存在特异性调控序列如启动子、增强子 ,可与肝脏富含的转录因子如 HNF1、C/ EBP及 e H- TF等特异性结合 ,刺激基因高效转录。自 1 989年 Izban克隆并提交了小鼠白蛋白调控序列 ,其在转基因动物及基因治疗中得到了广泛的应用 ,实现了基因转移的器官靶向性。近年的研究发现 ,与其他启动子如 CMV、PGK相比 ,白蛋白启动子引导的基因转移引起的免疫反应较轻 ,并可克服因启动子失活而导致的转基因沉默现象 ,相信随着转基因技术的不断发展 ,其将有越来越广泛的应用     

小鼠白蛋白基因的特异性调控及其在转基因动物中的应用

白蛋白是肝脏表达的血清蛋白，其组织特异性表达的基础在于白蛋白基因存在特异性调控序列如启动子、增强子，可与肝脏富含的转录因子如HNFl、C／EBP及eH-TF等特异性结合，刺激基因高效转录。自1989年Izban克隆并提交了小鼠白蛋白调控序列，其在转基因动物及基因治疗中得到了广泛的应用，实现了基因转移的器官靶向性。近年的研究发现，与其他启动子如CMV、PGK相比，白蛋白启动子引导的基因转移引起的免疫反应较轻，并可克服因启动子失活而导致的转基因沉默现象，相信随着转基因技术的不断发展，其将有越来越广泛的应用。     

优化反向PCR法对hTF转基因小鼠整合位点旁侧序列分析

自1982年世界上首次通过转基因动物技术获得＂巨鼠＂[1]以来,转基因动物的研究发展迅速。随着多种转基因动物的成功获得,研究者设想利用动物表达外源基因,以动物个体作为一个反应器来生产有价值的蛋白质。     

液压转基因技术应用于大鼠再生肝转基因实验

目的 探讨液压转基因技术(HDT)应用于大鼠再生肝转基因的条件和方法 . 方法 以2ml/s的速度将浓度为30mg/L的含目的 基因的质粒注射入大鼠尾静脉,于注射前/后不同时间进行大鼠2/3肝切除(PH),于PH后不同恢复时间称量大鼠体重(g)和再生肝重(g),计算肝系数(Lc),并从Lc±Lc*0%、*5%、*10%、*15%、*20%、*25%、*30%、*35%等15组中找出最佳组,作为计算不同恢复时间再生肝最适注射质粒溶液量的校正系数(Trc);取大鼠肝右叶中部组织制备冷冻切片,在波长488nm的荧光显微镜下观察、计数1万个细胞中的绿色荧光蛋白阳性细胞百分率. 结果 PH后注射生理盐水和注射空质粒对肝再生的影响与对照(只进行PH)相比无显著差异.PH前液压转基因的合适时间是PH前≥12h;PH后所有时间均可进行液压转基因.PH后对肝再生大鼠进行液压转基因的转基因溶液体积为大鼠体重(g)×9%×1/3×相应的校正系数(Trc).转入基因在体内的表达时间和丰度既受载体影响,又受插入的目的 基因影响. 结论 液压转基因技术亦可有效地应用于大鼠再生肝转基因研究.     

活体动物光学成像技术与应用研究

活体动物光学成像是利用生物发光及荧光技术在活体动物体内进行生物标记通过光学成像系统来监测被标记动物体内分子及细胞等的生物学过程。按发光模式可分为生物发光和荧光两类。相对于传统动物实验研究方法,具有无创、可多次重复、实时活体成像、灵敏、安全等优势,这项技术在标记活体内肿瘤活体细胞示踪、标记基因及转基因动物等方面的应用广泛。     

RNAi技术抑制HCMV-IE1表达的在体实验研究

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi) 对体内人类巨细胞病毒-立即早期基因1(human cytomegalovirus immediate-early gene 1,HCMV-IE1)表达的沉默作用,为靶向HCMV-IE1的基因治疗提供科学的实验依据.方法:选取60只雄性昆明种小鼠,并分为3组,分别为实验对照组(注射生理盐水)、病毒感染组(注射HCMVAD169株病毒液)和RNA干扰组(染毒后第2天注射转染了表达RNAi载体的人胚肺成纤维细胞液);采用PCR法检测小鼠体内HCMV基因的表达水平;采用ELISA检测动物血清中HCMV-IgM的含量;采用免疫组织化学和Western免疫印迹技术分别测定小鼠体内HCMV-IE1的蛋白水平.结果:PCR结果表明干扰组比病毒感染组的HCMV的基因表达下调20%;ELISA结果表明RNAi能使动物血清中HCMV的含量降低为19%;免疫组织化学和Western免疫印迹结果证实,干扰组和病毒感染组的HCMV-IE1蛋白水平分别降低为17.6%和18.5%.结论:RNAi技术能有效地抑制目的基因在体内的表达,有可能用于靶向HCMV-IE的基因治疗.     

携带乙型肝炎病毒感染性克隆的四种转基因载体在体内外抗原表达分析

目的 构建四种不同结构的1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)转基因载体,观察HBV抗原在体内外表达水平的差异.方法 克隆1.3倍的HBV基因至慢病毒转基因质粒pCS-CG并取代其中的EGFP表达盒,构建四种结构的pCS-HBV1.3质粒,体外转染Huh 7细胞和尾静脉高压水动力法注射C57BL/6小鼠后,ELISA方法分别检测细胞上清和小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表达.结果 成功构建了四种不同结构的pCS-HBV1.3质粒,四种质粒HBV S抗原与e抗原在体内外的表达趋势一致,即乙肝抗原表达水平在正向插入的转基因质粒中高于反向插入;HBV抗原表达水平还与载体序列中RRE调控元件和cPPT调控元件前的基因序列长度有关.结论 筛选获得了可在体内外高效表达HBV抗原的转基因载体可应用于乙肝病毒体内外感染模型的建立与应用.     

外源基因在转基因蚊虫中表达的研究进展

利用转基因技术对蚊虫进行遗传修饰使其密度下降或降低其传播疾病的能力是控制蚊媒传染病的一个新策略。其核心问题是外源基因在转基因蚊虫体内的表达。本文从转基因蚊虫的表达载体、外源基因表达特性及效应、转基因蚊虫研究存在的问题及发展前景等方面对该领域的研究进展进行了综述。     

慢病毒载体在转基因动物研制中的应用

慢病毒载体（lentiviral vector，LV）用于转基因技术与传统的DNA微注射相比具有操作简单、整合效率高、成本低廉等优点。与非慢病毒类反转录病毒载体相比，LV具有转基因表达效率高、对细胞周期没有选择性等优点。正因为LV具有独特的优点近年来LV转基因技术迅猛发展起来，多种LV转基因动物也接连诞生，文章从LV优点，构建，以及已获得的转基因动物制备方法研究入手，分析总结并提出了对未来的展望。     

可复制型抗乙肝免疫基因治疗剂pSVK-HBVE的构建与表达

目的构建能同时表达抗体小分子靶向干扰素(dsFvα)和人白介素12(hIL-12)的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE。方法将pVAX-HBVE质粒双酶切,回收dsFvα-IRES-hIL12片段;将dsFvα-IRES-hIL12片段克隆入早期构建的pSVK载体,得到重组质粒pSVK-HBVE。将重组质粒瞬时转染到293T细胞,ELISA法检测目的基因表达;提取重组质粒pSVKHBVE,注射乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转基因小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果pSVK-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pSVK-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够同时表达抗体靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒,为慢性乙肝免疫基因治疗提供新的备选方案。     

脂质体介导pIDO-EGFP转染原代培养软骨细胞的初步研究

目的：检测脂质体介导pIDO-EGFP转染原代培养的C57小鼠关节软骨细胞的瞬时表达及转染效率，建立原代培养的小鼠关节软骨细胞转染方法。方法：大肠杆菌中扩增pIDO-EGFP质粒，在最优化条件下通过lipofectamine2000^TM转染试剂将pIDO-EGFP质粒转入原代培养的小鼠关节软骨细胞。应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况，流式细胞术检测其转染效率。结果：质粒携带的增强型绿色荧光蛋白在转染后24h得到了明显表达，48h后流式细胞术检测其转染效率为36．43％，未影响软骨细胞贴壁过程。结论：经绿色荧光蛋白检测表明，脂质体成功地将IDO基因转染进入原代培养的软骨细胞。转染后的软骨细胞在体外仍能存活，在最优化的条件下能达到良好的瞬时转染效率，为组织工程化软骨细胞基因导入和基因修饰提供了思路。     

酸性成纤维细胞因子基因体外转染肌卫星细胞

背景：研究报道外源性酸性成纤维细胞生长因子既可调节肌卫星细胞增殖和分化,又具有预防运动终板退变及肌萎缩的作用。 目的：通过酸性成纤维细胞因子基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞,检测目的基因转染肌卫星细胞效果及基因表达情况,探讨建立有效预防运动终板退变及肌萎缩种子细胞可行性。 方法：取Wistar成年大鼠后肢肌肉,差速贴壁培养法分离纯化肌卫星细胞,观察细胞生长特性并做免疫组织化学鉴定;取第2代细胞,LipofectamineTM2000 Reagent转染试剂介导,将重组真核表达质粒pEGFP-N1-aFGF转染肌卫星细胞为实验组;阴性对照组转染空载质粒pEGFP-N1;空白对照组仅加入转染试剂。转染后24-72 h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况,计算转染效率。转染细胞行Western Blot检测酸性成纤维细胞因子表达。提取转染后72 h 细胞总RNA, 实时荧光定量PCR检测酸性成纤维细胞因子基因mRNA表达。 结果与结论：分离纯化细胞经免疫组织化学鉴定为肌卫星细胞。荧光显微镜观察到细胞转染6 h后即有绿色荧光发出,荧光强度和表达细胞总数在72 h达到高峰,传代后仍可观察到绿色荧光蛋白表达。实时荧光定量PCR证实目的基因mRNA表达水平远远高于对照组,Western Blot检测实验组有大量酸性成纤维细胞因子产生。提示酸性成纤维细胞基因转染肌卫星细胞可表达基因产物,有望作为基因工程种子细胞预防失神经支配后运动终板退变及肌萎缩。     

基因转染技术的发展与现状

基因转染技术是基因研究中的重要实验手段。探讨了基因转染的兴起和发展,介绍了6种基因转染方法,其中重点对两种新方法——颗粒轰击技术和光诱导的光化学内在基因转染方法进行了介绍,并对各种方法的优势和不足进行了比较,以便研究人员在研究中更好地选择实验方法。介绍了基因转染技术在基因研究中的应用。     

超声－微气泡介导的基因转染研究进展

能否成功高效地转染靶基因对于基因治疗的效果具有决定性的影响。微气泡是具有稳定的封装壳,直径为微米量级的小气泡,已作为超声造影剂被广泛应用。微气泡在超声脉冲的作用下可以在靶区释放其携带的基因并使之转染,同时超声脉冲产生的热效应和空化效应能提高转染率。若将微气泡与磁性纳米颗粒结合,还可以进一步提高转染率和转染精度,是一种理想、安全的基因载体。本文综述了由超声－微气泡介导的基因转染在近5年的主要研究成果。对影响转染率的主要因素如微气泡种类、超声辐照条件、基因及受体类型等方面做了详细的论述,并对微气泡介导基因转染过程中的安全性、长效性和差异性等问题进行了讨论。     

探讨高表达肿瘤抗原基因OVA66对WISH细胞生物学特征的影响

目的 分析转染OVA66基因WISH细胞的生物学特征变化,探讨该基因的功能.方法 采用脂质体方法将重组真核表达载体pcDNA3.1-OVA66转染正常人羊膜细胞系WISH,经G418稳定筛选、克隆和扩增.采用RT-PCR、Western blotting和免疫荧光等方法检测目的基因及其蛋白的表达,通过电镜分析细胞超微结构,体外侵袭实验检测细胞生长特性和侵袭能力, 软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆性生长能力,并应用基因芯片技术检测相关基因差异表达.结果 RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1-OVA66细胞OVA66基因呈高表达;Western bloting显示OVA66蛋白处出现明显的条带;电镜检测表明该基因可明显增强WISH细胞增殖能力;体外侵袭实验显示,该基因可增强WISH细胞的侵袭转移能力;软琼脂克隆形成实验表明OVA66基因可以促进单克隆性生长能力;基因芯片提示,该基因高表达影响某些基因的异常表达.结论 提示OVA66基因高表达可促进细胞的增殖,利于肿瘤的侵袭和转移.     

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景：人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。 目的：验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。 方法：构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。 结果与结论：测序及酶切证实真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6 h检测到有EGFP的表达,至60 h达到高峰,转染效率为(16±3)%。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60 h达到22.65 μg/L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。     

HER2启动子在卵巢癌细胞系中控制报告基因特异性表达

目的 构建一种能在卵巢癌肿瘤组织中进行肿瘤特异性表达的逆转录病毒载体,增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法 ＰＣＲ法获得ＨＥＲ２基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体Ｐ＾ＬＸＳＮ中,再将突变型绿色荧光蛋白（ｍｔＧＦＰ）基因克隆至该启动子下游,将此载体转染ＳＫ－ＯＶ３细胞和ＭＣＦ－７细胞。结果 转染３天后可见部分ＳＫ－ＯＶ３细胞呈现绿色荧光,而ＭＣＦ－７中无此现象。结论 ＨＥＲ－２基因启动子可控制报告     

不同时期转染基因对牵引区新骨生成的影响

背景：前期研究表明,电穿孔介导的重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165能促进牵引区早期新生血管的形成和新骨形成。 目的：观察不同时机转染基因对兔下颌骨牵张成骨过程中牵引区新骨生成的影响,探索基因导入的最佳转染时间,以获得更好的治疗效果。 方法：新西兰大白兔48只,全麻下行双侧下颌骨截骨及牵引器植入后,采用随机区组法分成4组,分别于造模后即刻、牵引开始时、牵引结束时在双侧牵引区注射2 μg(0.1 g/L)重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165,3组均予电穿孔刺激;单纯牵引组单纯牵引不行基因转染。各组于造模后3 d开始以0.8 mm/d、1次/d的速率进行牵引,连续牵引10 d;各组分别于固定期1,2,4,8周处死3只兔子,切取下颌牵引区新生组织行组织学检测和形态计量学分析。 结果与结论：组织学检查和形态计量学分析发现,牵引期转染组与即刻转染组、固定期转染组、单纯牵引组比较间隙内有更多的新生血管、成骨细胞和间充质细胞等成分,各时点新生骨量与新生骨小梁宽度明显高于后者(P < 0.05)。表明在牵引开始时(牵引期)进行基因转染较其他时间转染促进新骨生成作用明显,能够获得最佳的促进新骨生成的效果,提示牵引期是下颌骨基因治疗的最佳时机。     

Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection

Natural killer (NK) cells are important mediators of virus- and tumor-specific immune responses. The transfection of genes into NK cells has been proven difficult and so far requires infection with virus-based vectors. Here, the application of a novel nonviral, electroporation-based gene transfer method is described for the rapid and highly efficient transient transfection of NK cell lines as well as freshly isolated NK cells. In contrast to conventional methods, this technique, termed nucleofection, leads to direct transfer of DNA into the nucleus. Using reporter proteins H-2K(k), luciferase+, and enhanced yellow green fluorescent protein (EYFP) as independent read-out systems, transfection efficiencies of well over 50% were achieved in transient transfection assays. The highest luciferase activity could be measured only 4 h after transfection, whereas EYFP, when analyzed by flow cytometry, showed expression peaks after 28 h. Interestingly, best transfection efficiencies were achieved with non-dividing NK cells. The novel nuclear gene transfer method presented here is highly useful for the analysis of NK cell-specific gene regulation and should facilitate the development of NK cell-based gene therapy approaches.     

A novel transfecting peptide comprising a tetrameric nuclear localization sequence

The transport of exogenous DNA into the nucleus of eukaryotic cells is a prerequisite for successful gene delivery. To favor nuclear transport we synthesized a tetramer of the nuclear localization signal (NLS) of the SV40 large T-antigen as a novel nonviral gene delivery vector. This 4.4-kDa lysine-rich peptide (NLSV404) binds and compacts DNA by electrostatic interaction and forms stable polyplexes. Apart from its sequence-specific potency to mediate nuclear accumulation of conjugated albumin, NLSV404 also displays properties of nuclear transport for plasmid DNA as confirmed by fluorescence in situ hybridization. Further, NLSV404 polyplexes are shown to efficiently transfect various cell lines such as 16HBE14o–, HeLa S6, and Cos7 cells. NLSV404 polyplexes displayed at least 20-fold higher transfection rates than analogous polyplexes formed by the nuclear transport-deficient mutant sequence cNLS. Using growth-arrested cells, NLSV404 complexes were at least 100-fold more efficient than cNLS complexes. Combination of NLSV404 peptide but not of cNLS peptide with preformed polyethylenimine and dendrimer DNA complexes resulted in a strong increase in transfection efficiency. Incubation of cells prior to transfection with NLSV404 polyplexes with excess free peptide NLSV404 but not with cNLS resulted in a dose-dependent dramatic decrease in the transfection rate, suggesting a sequence-specific competitive inhibition. These results indicate that NLSV404 mediates nuclear accumulation of transfected plasmid DNA and that it can be a highly useful component of nonviral gene vectors.Abbreviations BSA-BODIPY Fluorescence-labeled bovine serum albumin - EGFP Enhanced green fluorescent protein - FISH Fluorescent in situ hybridization - NLS Nuclear localization signal - PEI Polyethylenimine - SV40 Simian virus 40