1株汉坦病毒的分离及其S基因片段的克隆和序列分析

目的对浙江省肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)疫区-龙泉,新分离到的毒株的S基因片段进行克隆并进行序列测定及分析,以确定毒株的型别和基因变异程度,为进一步研究病毒进化和变异提供了有利条件。方法采用直接免疫荧光检测疫区鼠肺HV抗原。将HV抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离病毒。参考GenBank发表的汉坦病毒核蛋白基因序列,设计合成一对引物,提取分离株细胞培养物的总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增新毒株S片段基因,并克隆入载体,纯化后进行核苷酸序列测定及分析。结果成功分离到的新毒株S片段的全基因序列共1 700个核苷酸,只有一个开放读码框架,共编码429个氨基酸。新毒株与HTN型毒株比较,核苷酸同源率为85.7%~91.9%。与SEO型毒株比较,核苷酸同源率为71.2%~75%,表明该毒株为HTN型毒株。结论浙江HFRS疫区新分离汉坦病毒株可以定型为HTN型毒株,可能为新的亚型。     

福建省汉坦病毒基因分型及基因序列分析

目的了解福建省汉坦病毒的型别及分子特征。方法汉坦病毒阳性鼠肺标本中提取病毒RNA,应用汉坦病毒型特异性引物进行RT-PCR扩增及核苷酸序列测定,对汉坦病毒进行基因分型和同源性分析。结果3份来自我省肾综合征出血热混合型疫区黄胸鼠、针毛鼠和黄毛鼠的鼠肺标本中均发现携带HTN型病毒,1份来自我省家鼠型疫区褐家鼠鼠肺标本则携带SEO型病毒。ZH1和ZH48同源性较高为953%,ZH53与之差异较大,同源性仅82.7%～83.3%,而其与HTN型病毒Q36差异最小,核苷酸序列同源性为937%。结论FJF3属SEO型;ZH1、ZH48及ZH53同属HTN型;而ZH53可能属于HTN型中的一个新亚型。     

地方株肾综合征出血热病毒生物学特性研究

肾综合征出血热(HFRS)分为4个血清型,目前国内已证实存在Hantaan型(HTN),Seoul(SEO)2个血清型.根据单克隆抗体的抗原分析认为,出血热病毒有复杂的抗原决定簇,毒株间存在明显的抗原差异.我们选择肾综合征出血热疫区抗原阳性鼠肺组织,现症病人外周静脉血及尿液,分离出11株出血热病毒.用McAb对其抗原性进行分析,同时测定毒株毒力.     

青岛市汉坦病毒基因型测定及分析

目的探讨青岛市汉坦病毒主要流行株的基因型。方法在青岛5市采集鼠肺标本,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增技术及核苷酸序列测定方法对免疫荧光抗原阳性的HV M部分片段扩增并测序,与山东省其他地区代表株及其他部分标准株进行系统发生树及同源性分析。结果分离的5株HV有3株为SEO型,2株为HTN型。从SEO型病毒间的异同来看,青岛市汉坦病毒分离株和临近地区汉坦病毒分离株相近。结论青岛市HV是SEO和HTN混合型疫区;SEO型基因有较高的稳定性。     

从保定地区病人血清中扩增出与76-118株同亚型的汉坦病毒核苷酸序列分析

通过对1996年我院收治的肾综合征出血热(HFRS)病人应用 RT-PCR方法进行分型研究发现2例为野鼠型(HTN)汉坦病毒感染。经过对其中一例的病毒部分核苷酸序列的扩增、克隆、序列测定与分析,结果其核苷酸序列与已知HTN型病毒具有较高的同源性,特别是与韩国的76-118株的核苷酸序列极为相似,同源序列占 98.7％,故为同一亚型,证     

河北省肾综合征出血热疫区鼠携带汉坦病毒基因特征分析

目的了解河北省肾综合征出血热(HFRS)疫区鼠携带汉坦病毒(HV)的基因特征。方法收集2019年河北省各地市捕获的鼠类标本,无菌下解剖取肺组织,应用Real-time PCR对阳性鼠标本进行HV G2片段扩增并测序,运用DNASTAR 7.1软件包对核苷酸序列进行同源性比较,采用MEGA 5.22软件构建系统发生树分析。结果共收集951份鼠肺标本,经Real-time PCR检测HV阳性标本共24份,均为汉城型(SEO)。对12份标本进行序列测定,鼠肺标本病毒间变异不大,同源性达97.3%～100.0%。新测序株与以往测序株比较同源性为97.3%～99.7%。系统发生树分析显示12份标本均为S3亚型HV。结论河北省HFRS疫区HV基因型以SEO型为主,亚型为S3亚型,同亚型病毒基因高度同源,无明显变异,遗传物质具有区域稳定性特征。     

河北省肾综合征出血热疫区鼠携带汉坦病毒基因特征分析北大核心CSCD

目的了解河北省肾综合征出血热(HFRS)疫区鼠携带汉坦病毒(HV)的基因特征。方法收集2019年河北省各地市捕获的鼠类标本,无菌下解剖取肺组织,应用Real-time PCR对阳性鼠标本进行HV G2片段扩增并测序,运用DNASTAR 7.1软件包对核苷酸序列进行同源性比较,采用MEGA 5.22软件构建系统发生树分析。结果共收集951份鼠肺标本,经Real-time PCR检测HV阳性标本共24份,均为汉城型(SEO)。对12份标本进行序列测定,鼠肺标本病毒间变异不大,同源性达97.3%~100.0%。新测序株与以往测序株比较同源性为97.3%~99.7%。系统发生树分析显示12份标本均为S3亚型HV。结论河北省HFRS疫区HV基因型以SEO型为主,亚型为S3亚型,同亚型病毒基因高度同源,无明显变异,遗传物质具有区域稳定性特征。     

黑龙江省肾综合征出血热病毒基因序列变化特点

目的研究黑龙江省肾综合征出血热病毒基因序列特点,以期寻找近年来黑龙江省肾综合征出血热临床特点变化的原因。方法收集鼠肺标本110例及2005—2015年就诊于哈尔滨医科大学附属第一医院及齐齐哈尔市第七医院临床诊断为轻型和不典型肾综合征出血热的患者早期血标本121例,及部分典型出血热患者外周血标本100例,提取病毒核酸,进行序列扩增,电泳分析及基因测序,所得序列分型并与既往毒株基因序列进行比较,进行系统进化及同源性分析,结合核苷酸及氨基酸位点的变化,探讨肾综合征出血热临床特点变化原因。结果轻型及不典型肾综合征出血热基因序列扩增成功26例,其中HTN型14例,SEO型12例。典型肾综合征出血热标本扩增成功22例,其中HTN型19例,SEO型3例;黑龙江省人源与鼠源汉坦病毒与76-118株均存在变异,非典型病例标本、典型病例标本、鼠源汉坦病毒与标准株核苷酸同源性分别为74.4%～89.2%、87.4%～90.3%、88.1%～88.5%;人源及鼠源汉坦病毒同源性为79.7～99.1%,其中人源的Hljh38、Hljh39与其他毒株差异较大,与既往Amur病毒株H5、H8205同源性高,可达94.9%～97.6%,为同一亚型。推导的氨基酸与标准毒株比较部分位点存在变异,但未见明显的变异规律。结论黑龙江省肾综合征出血热临床特征较之前发生变化的原因与病毒型别的变化相关;同时也存在汉坦病毒变异,氨基酸位点变化,但具体变异规律及与临床表现的相关性有待进一步验证。。     

浙江新分离汉坦病毒ZT71株S基因片段的克隆及序列分析

目的为了获得浙江省汉坦病毒基因组更为详尽的资料,研究汉坦病毒的进化状况及变异程度,为疫苗病毒株的选择使用提供科学依据。方法本实验室利用RT-PCR方法扩增ZT71株S基因片段并克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。结果ZT71株S基因由1754个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码429个氨基酸。与HTN型病毒(76-118)的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.0%和82.6%,与SEO型病毒(SR-11、R22、Guo3、8610)核苷酸和氨基酸同源性分别为88.4%—96.5%和98.1%—99.0%,与其它型汉坦病毒的同源都很低。结论表明此分离的病毒为SEO型汉坦病毒,为进一步研究其进化和变异提供了有利条件。     

江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析

目的 对2011年江西省采集的鼠肺标本进行汉坦病毒的分离鉴定,了解分离病毒株的基因特征。方法 采用Vero-E6细胞对阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对毒株进行鉴定。扩增分离株的S、M片段基因进行克隆测序。运用DNAstar软件包和MEGA3.1软件对序列进行分析。结果 从15份标本分离到2株来自褐家鼠的汉城型汉坦病毒。对其中1株病毒的S、M片段进行了克隆和序列测定,其中S片段含1 772个核苷酸,编码429个氨基酸;M片段含3 651个核苷酸,编码1 133个氨基酸。经核苷酸和氨基酸同源性分析,新分离株与国内外汉城型病毒核苷酸同源性94.8 %~98.0%,氨基酸同源性98.2%~99.6%。与汉城型标准株80-39株相比,S片段仅1个氨基酸位点发生变异;M片段有9个氨基酸位点发生变异,糖基化位点的数目和位置没有发生变化。结论 从江西省褐家鼠分离到两株汉城型病毒,病毒基因变异较小,型别相对稳定。     

辽宁省鼠类感染肾综合征出血热的病原学及分子生物学检测比较

目的了解辽宁省鼠间带毒、鼠密度及鼠种构成与汉坦病毒的分子特征。方法采用夹夜法对鼠密度、鼠种构成及鼠带毒率进行监测,用间接免疫荧光方法检测HFRS抗原,用Vero-E6细胞对病毒进行传代分离,RT-PCR方法对阳性毒株进行基因分型及测序分析。结果鼠密度在春秋季各出现一个高峰,村内鼠密度高于村外鼠密度,褐家鼠为优势鼠种。带毒率无显著性差异,各鼠种间带毒率无显著性差异。5株病毒,有2个遗传分支,4株为HV的SEO型,1株为HTN型,4株SEO型HV基本位于系统发生树的同一进化枝上;1株HTN型HV,与汉滩病毒标准株76-118接近。结论辽宁省每年存在春秋季两个鼠密度高峰,带毒率同季节及鼠种无关。辽宁省是以SEO型HV为主的SEO和HTN混合型疫区,且SEO型汉坦病毒变异较小。     

陕西延安地区肾综合征出血热流行情况研究报告

目的 明确陕西延安地区为肾综合征出血热疫源地及病毒基因型别。方法 择有疫情报告地,进行人群疫情调查及健康人群特异性抗体检测;用夹夜法捕鼠,调查鼠种及鼠密度,采集鼠肺、血标本。人血、鼠血分别用IFA和ELISA法检测IgG抗体;鼠肺采用RT-PCR检测汉坦病毒(HV)RNA,测定PCR产物并与HV代表株76-118和Seoul序列进行比较。结果 对延安市防疫站2001年统计的7例HFRS患者进行流行病学调查,均属在当地感染;检测延安市洛川县交口河镇245例人血标本HV特异性IgG抗体,阳性50例,人群隐性感染率为20.41％。22份鼠肺及鼠血标本,IFA抗HV IgG阳性3例,ELISA阳性5例。从一只鼠血抗体阳性的鼠肺中检测到HV RNA,序列测定符合Seoul S片段序列(94％)。结论 延安市洛川县交口河镇为HFRS疫源地及新疫区,洛川交口河镇健康人群、褐家鼠、小家鼠中有HV感染,病毒型别为SEO型。     

深圳市肾综合征出血热疫源地宿主动物汉坦病毒分离株的基因分型

目的 对深圳市肾综合征出血热(HFRS)疫源地进行宿主动物汉坦病毒分离,研究分离株的基因分型.方法 采用幼龄长爪沙鼠接种和Vero-E6细胞培养的方法进行汉坦病毒分离,用直接免疫荧光实验进行鉴定.应用型特异性引物进行反转录一套式PCR分别扩增M片段G1、G2区、S片段,并测定核苷酸序列,进行同源性比对和进化树分析.结果 从深圳市褐家鼠肺中成功分离到2株汉坦病毒,命名为SZ2082和SZ2083,经反转录一套式PCR扩增并进行序列测定显示为第2型汉城病毒型(SEOV).通过对3个基因片段序列比较分析发现,SZ2082和SZ2083部分M和S片段核苷酸序列完全一致.M片段G1、G2区核苷酸序列与SEOV国际代表株80-39的同源性分别为96.7%、95.0%,与第1型汉滩病毒型(HTNV)型国际代表株76-118的同源性仅为75.9%、70.3%.S片段与SEOV80-39和HTNV76-118比较,核苷酸同源性分别为95.7%和69.7%,与M片段的结果相似.通过M片段G2区的分析发现,SZ2082与BjFT01、Beijing-Rn、Guang199、HN71-L处于同一分支,同源性为99.0%～99.7%.结论 在深圳市分离到汉坦病毒,通过鉴定其属于汉城型病毒S2亚型.     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

浙江省9株猪链球菌2型分离株Cps2J全基因克隆与序列分析

目的了解浙江猪链球菌2型(SS2)分离株的分子基础及与国内外其他分离株的基因差异程度,确定Cps2J基因变异位点和频率,为该地区的猪链球菌防治提供科学依据。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后采用ABI自动测序仪测定序列,并同国内外其他分离株的基因进行比较。结果扩增出9株菌株的Cps2J基因的完整开放阅读框(ORF)都为999bp,编码333个氨基酸,9株菌株Cps2J片段核苷酸高度同源,同源性在99.7%～100%;与国内外其他的SS2核苷酸的同源性为98.8%～99.0%,与猪链球菌1型的同源性只有56.8%～57.0%。结论9株浙江省猪链球菌2型分离株Cps2J基因序列非常保守,这些不同来源的菌株可能有相同的起源。     

酶斑点杂交法与双抗体夹心法检测汉坦病毒感染的比较

目的将酶标抗汉坦病毒NP抗原单链抗体应用于酶斑点杂交法和双抗体夹心法,检测汉坦病毒感染,探索价格低廉早期HFRS诊断试剂。方法以戊二醛偶联辣根过氧化物酶和抗汉坦病毒NP抗原单链抗体,制备酶标单链抗体,并应用于酶斑点杂交法和双抗体夹心法中,检测56份早期HFRS患者血清及66份阴性对照血清。结果56份HFRS患者血清中,双抗体夹心法检测出29例阳性,阳性率为51.79%,酶斑点杂交法检测出28例阳性,阳性率为50.00%,两方法检测66例阴性对照血清,结果均为阴性。统计学处理,两方法差异不显著。结论以酶标抗汉坦病毒NP抗原单链抗体制备的酶斑点杂交和双抗体夹心诊断试剂,均为稳定性好、假阳性率低、造价低廉、诊断可靠的诊断试剂。     

柏氏禽刺螨传播家鼠型汉坦病毒的研究

目的：研究柏氏禽刺螨在传播家鼠型肾综合征出血热病毒中的作用。方法：每罐放柏氏禽刺螨100只，于室温为23±1℃环境下饥饿4d，分别叮刺感染汉坦病毒（Hantaanvirus）或浙45株（Z45）大鼠乳小鼠2只或感染汉城病毒（Seoulvirus）UR株大鼠乳小鼠2只各12h，为感染螨，用感染后d15的螨叮刺正常大鼠乳小鼠9只，d30取感染鼠的肺和血清，用间接免疫荧光测试。于d15和d23取感染螨用聚合酶链反应测试其体内病毒RNA。结果：柏氏禽刺螨分别叮刺感染汉坦病毒Z45株和感染汉城病毒UR株大鼠乳小鼠后, 再分别叮刺正常大鼠乳小鼠5 只和4 只。IFAT 检测结果汉坦病毒Z45 株组的鼠全部阳性, 汉城病毒UR 株组的4 只鼠中3 只阳性, 其抗体滴度, 前者为10- 40, 后者为20- 40, 病毒在螨体内可保存22 d 以上。阻断试验显示, 病毒免疫血清1∶20 作用肺切片标本后, 部分阻断荧光抗体反应, 与未经稀释的血清作用后全部阻断特异性荧光反应。对照组正常鼠肺片和血清经IFA T 检测均阴性。结论: 柏氏禽刺螨可作为家鼠型肾综合征出血热的传播媒介和贮存宿主。     

浙江省副溶血性弧菌03：K6血清型菌株多位点序列分型研究

目的掌握浙江省不同来源的副溶血性弧菌O3：K6血清型菌株的分子分型特征,为副溶血性弧菌食源性疾病的预防控制提供技术支持。方法选择副溶血性弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对62株不同来源的副溶血性弧菌03：K6血清型菌株样本进行PCR扩增、测序,Chromas软件和DNAStar软件分析,核酸序列上传至MLST数据库进行比对,获得每株菌的序列型,绘制多位点序列分型遗传进化树并进行亲缘性分析。结果62株副溶血性弧菌03：K6血清型菌株中,59株菌为ST-3型（3,4,19,4,29,4,22）,1株菌为ST-121型（3,2,82,52,4,78,66）,1株菌为新的ST型（5,10,34,27,77,49,23）,1株菌仅gyrB基因第562位点由C突变为T,其余基因序列与ST4型（3,5,22,12,20,22,25）一致。结论浙江省副溶血性弧菌03：K6血清型菌株的主要MLST型别为ST-3型。